Diferencias en los genes 16SrRNA y citocromo c oxidasa subunidad I de las lisas Mugil cephalus y Mugil curema y los robalos Centropomus viridis y Centropomus robalito

Differences in the 16SrRNA and cytochrome c oxidase subunit I genes in the mullets Mugil cephalus and Mugil curema, and snooks Centropomus viridis and Centropomus robalito

AB Peregrino-Uriarte¹, R Pacheco-Aguilar², A Varela-Romero^1,3, G Yepiz-Plascencia¹*

¹ Laboratorios de Biología Molecular de Organismos Acuáticos y Productos Pesqueros, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, PO Box 1735, Hermosillo CP 83000, México. *E-mail: gyepiz@cascabel.ciad.mx.

² Productos Pesqueros, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, PO Box 1735, Hermosillo CP 83000, México.

Recibido en agosto de 2006;
Aceptado en enero de 2007.

Resumen

Se estudiaron los genes mitocondriales codificantes del 16SrRNA y citocromo c oxidasa, subunidad I (COI), de cuatro especies de peces comercialmente importantes del Golfo de California. Los peces incluyen dos lisas y dos robalos: la lisa rayada Mugil cephalus y la lisa blanca Mugil curema; y el robalo plateado Centropomus viridis y el robalo aleta amarilla Centropomus robalito. Los fragmentos de los genes 16SrRNA y COI fueron obtenidos mediante amplificación por PCR. Las digestiones de restricción de los amplicones resultaron en patrones de bandeo diferentes entre las cuatro especies. Las distancias genéticas obtenidas con base en la secuencia del 16SrRNA fue menor que con COI para ambos grupos de especies. La inferencia filogenética para ambos genes muestra monofilia para las cuatro especies en dos diferentes grupos, uno para las lisas y otro para los robalos. La monofilia de estos grupos fue evidente a pesar de las politomías con el resto de las especies incluidas en los análisis de remuestreo para máxima parsimonia y máxima verosimilitud.

Palabras clave: peces, genes mitocondriales, 16SrRNA, COI, patrones de restricción.

Abstract

Key words: fish, mitochondrial genes, 16SrRNA, COI, restriction pattern.

Introducción

El Golfo de California es muy rico en especies de peces de importancia ecológica y comercial (Thomson et al. 2000). Las lisas y los robalos son especies abundantes en esta área, incluyendo al menos tres especies de lisas y cinco de robalos (Fischer et al. 1995, Rivas 1986). La adecuada identificación de especies de peces a partir de tejido fresco o filetes es una tarea difícil pero necesaria para la autentificación de productos procesados (Ram et al. 1996, Murgia et al. 2002), para la identificación de especies tóxicas (Ishizaki et al. 2005) y para el seguimiento de linajes genéticos (Tringali et al. 1996, Ravago-Gotanco y Juiñio-Menez 2004), entre otras aplicaciones.

Actualmente, los estudios genéticos y moleculares de las especies nativas de peces en México son limitados, contrastando con la gran diversidad y número de especies de peces del Golfo de California. Lisas y robalos son recursos pesqueros importantes y comprenden el 1.3 % de la producción nacional (SAGARPA 2003). Además, los robalos Centropomus undecimalis y C. paralellus ya están siendo cultivados (Zarza-Meza et al. 2006). Un proyecto inicial que describe las especies de peces del Golfo de California, incluyendo algunas lisas y robalos, comparó patrones de proteínas, lípidos y PCR-RFLP (disponible en http://www.ciad.mx/catalogo/index.htm). De este proyecto se seleccionaron dos especies de lisas y dos de robalos para analizar y comparar las secuencias de dos genes mitocondriales. Los genes mitocondriales han sido muy útiles para estudiar muchas especies de peces tales como atúnes (Ram et al. 1996, Chow et al. 2000), lenguado (Céspedes et al. 1998, Sotelo et al. 2001), esturión, salmón y atún (Horstkotte y Rehbein 2003), sardina (De Donato et al. 2005), entre otros ejemplos. Además, los genes mitocondriales han sido ampliamente estudiados en algunos peces y varios genomas mitocondriales de peces han sido completamente secuenciados (Miya et al. 2001; Clements et al. 2003, Miya et al. 2003). Ya que la mayoría de los genes mitocondriales son altamente conservados, se han propuesto iniciadores llamados universales (Kocher et al. 1989) para el estudio de especies para las que todavía no se dispone de información.

Los peces incluídos en este trabajo fueron la lisa rayada Mugil cephalus (Linnaeus, 1758), la lisa blanca Mugil curema (Cuvier y Valenciennes, 1836), el robalo plateado Centropomus viridis (Lockington, 1877) y el robalito o robalo aleta amarilla Centropomus robalito (Jordan y Gilbert, 1882). Estos peces fueron seleccionados para investigar variaciones en los genes mitocondriales 16SrRNA y de la citocromo c oxidasa subunidad I (COI) entre las especies de cada género y para contrastar la conservación de los genes entre los dos géneros.

Materiales y métodos

Muestras y extracción de DNA total

Los peces fueron fileteados y almacenados a -80 °C hasta su análisis. Se utilizaron cinco especimenes de cada especie para obtener individualmente el DNA genómico total de acuerdo con el método de Aljanabi y Martínez (1997), con las siguientes modificaciones. Aproximadamente 100-150 mg de músculo fueron homogeneizados en 500 μL de NaCl 0.4 M, Tris-HCl 10 mM , EDTA 2 mM , a pH 8.0, por 30-60 s y se incubaron 15 min a 55°C. Después se añadió RNasa A (concentración final de 60 μg mL^-1), se incubó 1 h a 37°C, seguido por la adición de proteinasa K (400 μg mL^-1) y SDS (2%) y se incubó por 1 h a 60°C. El homogenizado fue centrifugado a 10,000 g, por 10 min, a 4°C. Para precipitar polisacáridos y proteínas se añadió 1/3 de volumen de NaCl 6 M, CTAB 1%, se incubó 1 h a 55°C, luego se extrajo dos veces con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), la fase acuosa superior que contenía el DNA se colocó en otro tubo y se precipitó añadiendo un volumen de isopropanol, 1 h a -20°C y centrifugado a 10,000 g, por 40 min, a 4°C. El DNA precipitado se lavó dos veces con etanol al 70%, fue secado por vacío y resus-pendido en 50-100 μL de TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0).

Patrones de restricción de los amplicones y secuenciación

Para estudiar los genes 16SrRNA y COI de las especies antes mecionadas, se obtuvieron mediante amplificación por PCR dos fragmentos de ~1.3Kb para cada gen. Para el diseño de los iniciadores para la PCR, se alinearon las secuencias completas conocidas de los genomas mitocondriales de cuatro especies de peces, M. cephalus (NC_003182), Scyliorhinus canícula (NC_001950), Danio rerio (NC_002333) y Engraulis japonicus (NC_003097). Los primers usados para obtener los amplicones por PCR fueron: 16SF1, 5'-CCCTCACCTTTKG-CATCATGA-3'; 16SR1, 5'-CGGTCTGAACTAGATCACGTA -3'; COIF1, 5'-AYCACAAAGACATCGG-CACCCT-3'; y COIR1, 5'-GGGTAGTCAGAYTATCGTCGAGG-3'. Los primers T7 y M13R fueron usados para secuenciar los fragmentos clonados. Los primers internos 16SF2, 5'-YCGTTAMYCC-CACACTGGMGTG-3'; 16SR2, 5'-RCACKCCAGTGTGGR-KTAACG-3'; COIF2, 5'-TTCTGATTCTTTGGYCACCCAG-3' y COIR1 también fueron usados para secuenciar.

Los fragmentos de DNA se obtuvieron por amplificación por PCR a partir del DNA genómico total (300 ng) en 50 μL de una mezcla de reacción conteniendo MgCl₂ 3.0 mM, dNTP 50 μM de cada uno, 0.5 μM de cada primer y 1 unidad de Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen) en buffer de PCR (KCl 50 mM, Triton X-100 al 0.1%, Tris-HCl 10 mM, pH 8.3). Las amplificaciones fueron llevadas a cabo en un termocicla-dor PTC-200 DNA Engine (MJ Research, Waltham, MA), en las siguientes condiciones: para el fragmento del 16SrRNA, 94°C por 3 min, seguidos de un ciclo de 94°C por 1 min, 55°C por 1 min, 72°C por 2 min, y luego 94°C por 1 min, 60°C por 1 min, 72°C por 2 min (34 ciclos) y, finalmente, una extensión a 72°C por 10 min. Para el fragmento de COI, 94°C por 3 min; un ciclo de 60°C por 1 min, 72°C por 2 min, 94°C por 3 min, 52°C por 1 min, 72°C por 2 min (un ciclo), 94°C por 1 min, 55°C por 1 min, 72°C por 2 min (33 ciclos) y finalmente, una extensión por 10 min a 72°C. Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 1.0% y teñidos con bromuro de etidio (Sambrook et al. 1989).

Los amplicones de cinco especímenes independientes de cada especie fueron precipitados con isopropanol (Sambrook y Russell 2001), resuspendidos en agua y digeridos por separado con las enzimas Hinf I y Msp I, a 37°C por 4-5 h. Los productos de la digestión fueron analizados por electroforesis en geles nativos de poliacrilamida al 12% (MiniProtean II, BIORAD) y teñidos con bromuro de etidio. Se seleccionaron las enzimas Hinf I y Msp I para la digestión con base en su presencia en los genes homólogos de otros peces. Las imágenes de los geles y los tamaños de los fragmentos fueron obtenidos y analizados usando el programa computacional Digital Science 1D (Kodak, Rochester, NY).

Los amplicones del 16SrRNA de todas las especies y los de COI de las lisas, fueron clonados en el vector pCR2.1 TOPO TA y el DNA plasmídico fue purificado (Sambrook y Russell 2001) usando columnas GFX (Amersham Biotech). Los amplicones de COI de los robalos fueron secuenciados directamente sin ser clonados. Dado que el patrón de restricciones para los cinco especímenes de cada especie era idéntico, sólo se determinó la secuencia de nucleótidos para un especimen de cada una. Todas las reacciones de secuenciación se realizaron en la Universidad de Arizona (Genomic Analysis and Technology Core).

Comparación de secuencias

Las secuencias nucleotídicas fueron editadas y alineadas usando los programas Editseq y Megalign (DNAstar, Madison, WI) y fueron comparadas usando el programa Clustal W (Thompson et al. 1994). Las secuencias de aminoácidos de COI fueron deducidas usando el código genético mitocondrial de vertebrados. El análisis de las distancias genéticas fue obtenido con el modelo F84 (Felsenstein, 2004). Se utilizó el programa PAUP* vers. 4.01b para búsquedas heurísticas con el criterio de máxima parasimonia con 100 réplicas aleatorias y bisección y reconexión de árboles. Se usó remuestreo (bootstrapping, de 1000 réplicas) para evaluar el soporte de los clados para el árbol de mayor parsimonia. Los análisis de máxima verosimilitud se realizaron con los modelos de evolución nucletídica de cada gen, K81uf+I+G para COI y GTR+I+G para 16SrRNA, estimados con el programa MODELTEST 3.0 (Posada y Crandall, 1998) con remuestreo de 100 réplicas. Se seleccionaron secuencias homólogas para uno o ambos genes de especies filogenéticamente cercanas empezando desde las especies y hasta el nivel de orden, usando la información disponible en el GenBanK para las inferencias filogenéticas de acuerdo a la clasificación sistemática de Eschmeyer (1998). Para los robalos (orden Perciformes, suborden Percoidei) se usó Lates calcarifer NC_007439 (familia Centropomidae), Micropterus salmoides NC_008106, Elassoma evergladei NC_003175, (familia Centrarchidae), Etheostoma radiosum NC_005254, (familia Percidae), Emmelichthys struhsakeri NC_004407 (familia Emmelichthyidae), Pagrus major NC_003196 (familia Sparidae), Pterocaesio tile NC_004408 (familia Lutjanidae). Para las lisas (orden Perciformes, suborden Mugiloidei) M. cephalus NC_003182 y Crenimugil crenilabis NC_003170 (familia Mugilidae). Los otros subordenes dentro del orden Perciformes estuvieron representados por Oreochromis mossambicus NC_007231 (suborden Labroidei, familia Cichlidae), Pholis crassispina NC_004410 (suborden Zoarcoidei, familia Pholidae), Petroscirtes breviceps NC_004411 (suborden Blennioidei, familia Blennidae), Acanthogobius hasta NC_006131 (suborden Gobioidei, familia Gobiidae) y Ariomma lurida AB205431 (suborden Stromateoidei, familia Nomeidae). Como órdenes hermanos de perciformes se usaron Paralichthys olivaceus NC_002386 (Pleuronectiformes), Cottus reinii NC_004404, Dactyloptena tiltoni NC_004402 (Scorpaeniformes), Gasterosteus aculeatus NC_003174 (Gasterosteiformes), Hypoatherina tsurugae NC_004386 (Atheriniformes), Arcos sp. NC_004413 (Gobiesociformes) y Takifugu rubripes NC_004299 (Tetraodontiformes); y finalmente, Oncorhynchus mykiss DQ288271 (Salmoniformes) se usó como grupo externo. Los árboles construidos fueron generados usando el programa TreeViewX 0.5.0 (http://darwin.zoology.gla.ac.uk/~rpage/treeviewx/).

Patrones de restricción para lisas y robalos

Los amplicones de DNA mitochondrial de ~1.3 Kb para los genes 16SrRNA y COI fueron obtenidos individualmente de cinco especímenes de cada una de las cuatro especies estudiadas. En todos los casos, solo se detectó un amplicón, lo que indica que la amplificación fue gene-específica (fig 1). La digestión con las enzimas de restricción Hinf I y MspI produjeron exactamente el mismo patrón en los cinco individuos por especie; sin embargo, los patrones de bandeo fueron diferentes entre las cuatro especies (fig 1). La digestión del amplicón 16SrRNA de M. cephalus con Hinf I produjo dos fragmentos claramente diferentes de 565 y 675 pb, mientras que para M. curema se obtuvo un fragmento de 953 pb y 3 fragmentos más pequeños que fueron muy tenues en el gel debido a su tamaño (fig. 1a). Los patrones de restricción del 16SrRNA con Hinf I de los robalos presentan 3 bandas para cada especie, pero todas de tamaño diferente: 812, 284 y 236 pb para C. viridis, y 542, 227 y 200 pb para C. robalito (fig. 1b). Los patrones de bandeo obtenidos con Msp I también fueron apropiados para distinguir las cuatro especies estudiadas (fig. 1c, d). Por otro lado, los patrones de bandeo de los amplicones de COI fueron especie-especificos con ambas enzimas de restricción (datos no mostrados). Estos resultados concuerdan con reportes de patrones de bandeo diferentes obtenidos de fragmentos de genes mitocondriales de peces (Céspedes et al. 1999) e identificación de especies de ostiones, a pesar del alto grado de conservación de las secuencias mitocondriales (Klinbunga et al. 2003).

Comparación de secuencias nucleotídicas de lisas y robalos

Para obtener información adicional sobre las diferencias genéticas entre las cuatro especies, se determinaron completamente las secuencias nucleotidicas de ambas cadenas de los amplicones obtenidos de un individuo de cada especie. Las longitudes de los amplicones 16SrRNA fueron muy similares: 1362 y 1334 pb para M. cephalus y M. curema, respectivamente; y 1377 y 1368 pb para C. viridis y C. robalito, respectivamente. Las secuencias de los primers fueron excluidas de las secuencias de los amplicones 16SrRNA y fueron depositadas en el GenBank con los siguientes números de acceso: M. cephalus, DQ307686; M. curema, DQ307687; C. robalito, DQ307688; y C. viridis, DQ307689.

El análisis de las secuencias nucleotidicas reveló que la distancia genética entre las lisas, basada en el gen 16SrRNA fue 0.112, mientras que para los robalos fue 0.127. Las distancias más grandes (casi el doble del valor) se encontraron al comparar lisas y robalos (tabla 1). Debido a que el 16SrRNA es uno de los genes más altamente conservados (Stepien y Kocher 1997), quisimos obtener más información para las comparaciones. Para esto, se secuenció completamente en ambas cadenas un fragmento de 582 pb (interno en el amplicón original, hacia el extremo 3') del gen COI . Para el gen COI, la distancia genética fue de 0.158 para las lisas y 0.201 para los robalos; como antes, estos valores fueron mayores cuando se comparan lisas y robalos (tabla 1). Así, la conservación del 16SrRNA es mayor que la de COI y es más notoria cuando se comparan las lisas con los robalos usando el gen COI. Estos valores correlacionan con la mayor variación permitida en genes codificantes de proteínas por la existencia de codones sinónimos y, por esto, las distancias genéticas son mayores cuando se obtienen usando COI en el análisis.

Para ambos, lisas y robalos, aunque las distancias genéticas son relativamente pequeñas la digestión de los amplicones generó patrones diferentes. Esto es evidente en las alineaciones de las secuencias ya que hay regiones con mayor similitud que otras, aún entre las especies del mismo género, y las regiones más variables coinciden entre las cuatro especies (figs. 2, 3). Las variaciones en las secuencias genéticas entre diferentes poblaciones de estas especies de peces podrían revelar otros haplotipos en estudios posteriores. Las secuencias de COI fueron depositadas en el GenBank con los siguientes números de acceso: M. cephalus, DQ309555; M. curema, DQ310722; C. robalito, DQ310723 y C. viridis, DQ310724.

Las diferencias entre los dos genes de las cuatro especies corresponden adecuadamente con las identidades de las secuencias y son consistentes con las relaciones filogenéticas de las especies analizadas de cada género (Tringali et al. 1999, Rocha-Olivares et al. 2000, Papasotiropoulos et al. 2001, Rossi et al. 2004). Las inferencias heurísticas por parsimonia muestran monofilia para las cuatro especies en dos grupos separados, uno para M. cephalus y M. curema y otro para C. viridis y C. robalito para ambos genes (fig. 4). La monofilia de estos grupos se mantuvo a pesar de las politomías observadas con el resto de las especies incluidas en el análisis de remuestreo de máxima parsimonia (1000 réplicas) y máxima verosimilitud (100 réplicas). La inferencia filogenética limitada es evidente al usar los fragmentos de los genes para niveles taxonómicos mayores. Los órdenes de la clase Actinopterigyii, los subórdenes dentro de Perciformes y algunas de las familias aparecen mezcladas sin una señal filogenética coherente. En contraste, la relación para las especies de cada género fue consistente para las especies del género Mugil, formando un clado con el resto de Mugilidae y aún con el género Centropomus de la familia Centropominae y con Lates de la subfamilia Latinae, que forma un clado con la familia Centropomidae. Las relaciones filogenéticas obtenidas con COI fueron más limitadas para definir la monofilia, por lo que no se presentan. Finalmente, el estudio aquí reportado provee información sobre dos genes mitocondriales de cuatro especies de peces y muestra que aún cuando las especies son cercanas y los genes mitocondriales son bastante conservados, existe suficiente información para poder distinguir entre ellos.

Agradecimientos

Agradecemos a G García-Sánchez por al apoyo técnico, a AM van der Heiden y M Ruiz-Guerrero por la captura y la identificación de los peces completos y a R Sotelo-Mundo por la revisión del manuscrito. Se agradece el financiamiento a CONACYT (proyectos L0083-T y 34348-B).

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