Actividad lipasa intracelular en bivalvos (Argopecten purpuratus) mediante cromatografía de capa fina-densitometría
A thin-layer chromatography-densitometry assay for intracellular lipase activity in bivalves (Argopecten purpuratus)
MJ Fernández-Reiriz1*, U Labarta1, JM Navarro2
1 Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Instituto de Investigaciones Marinas, Eduardo Cabello 6, 36208, España. * E-mail: mjreiriz@iim.csic.es
]]> 2 Instituto de Biología Marina "Dr. Jürgen Winter", Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.
Recibido en noviembre de 2005;
Aceptado en marzo de 2006.
Resumen
Este estudio proporciona un método para la determinación de la actividad lipasa en bivalvos. Usando este método se estudió la actividad de la enzima lipasa en extractos de glándulas digestivas de Argopecten purpuratus alimentados con una dieta que refleja los cambios que se producen en el alimento disponible en ecosistemas naturales. El experimento se realizó durante 24-72 h. Los pectínidos fueron aclimatados a condiciones estándar siete días previos al inicio de los análisis enzimáticos. La dieta fue una mezcla de Isochrysis galbana y sedimento natural. La dieta de aclimatación (dieta control) tuvo 3.9 mg L-1 de material particulado total y 42.5% de contenido orgánico (28% lípidos). La dieta experimental tuvo una concentración de materia particulada total de 20.8 mg L-1 con un contenido orgánico del 26%, 20% de los cuales fueron lípidos. Se estudió el efecto de la dieta y el tiempo de experimentación sobre el comportamiento de la actividad lipasa. La respuesta de la lipasa intracelular a cambios en el alimento ofrecido fue importante, observándose las menores inversiones enzimáticas con la dieta experimental. El factor tiempo y la interacción entre dieta y tiempo no mostraron un efecto significativo.
Palabras clave: bivalvos, actividad lipasa, cromatografía capa fina-densitometría, ácidos grasos libres, glándula digestiva.
Abstract
]]> This study provides a method for the determination of lipase activity in bivalves. Using this method, lipase activities were studied in extracts of digestive gland of Argopecten purpuratus fed a diet that mimics the food available in natural ecosystems over a short-term experiment (24-72 h). The scallops were acclimated to standard conditions seven days prior to initiating the enzymatic analysis. The diet consisted of a mixture of laboratory-cultured Isochrysis galbana and natural sediment. For the acclimation diet (control diet), a total particulate concentration of 3.9 mg L-1 was used with an organic content of 1.7 mg L-1 (42.5%), of which 28% were lipids. The experimental diet had a total particulate concentration of 20.8 mg L-1 with 26% of organic content, of which 20% were lipids. The effect of diet and experimental time on lipase activity was analyzed. The response of the intracellular lipases to changes in the food offered was abrupt and lower investment in enzymatic activity was observed with the experimental diet. No significant effects were observed either for the time or for the combined diet and time interaction.Key words: bivalves, lipase activity, thin-layer chromatography-densitometry, free fatty acids, digestive gland.
Introducción
Desde que Young (1923) detectó la amilasa en el estilo cristalino de los moluscos bivalvos, se ha registrado la presencia de varios tipos de actividad enzimática tanto en el estilo cristalino como en la glándula digestiva de bivalvos (Brock y Kennedy 1992; Ibarrola et al. 1999; Fernández-Reiriz et al. 2001, 2004; Labarta et al. 2002).
A pesar de la abundante información que existe sobre la distribución cualitativa y cuantitativa de las enzimas digestivas en los moluscos bivalvos, ésta se refiere casi exclusivamente a las carbohidrasas (i.e., laminarinasa, celulasas, quitinasa, xilasas, amilasa) y proteasas, siendo limitada la información sobre la actividad lipasa en los órganos digestivos de estos organismos.
En los bivalvos las lipasas son importantes para la digestión de ceras y triglicéridos que forman parte principalmente de los compuestos de reserva (Langdon y Newell 1996). En contraste con el trabajo pionero de Yonge (1926), en el que se consideraba que la actividad lipasa en los moluscos era totalmente intracelular, George (1952) demostró, utilizando una prueba de actividad lipasa, que en los ostiones adultos Crassostrea virginica el estilo era considerado una fuente importante de lipasas extracelulares. Desde entonces, Reid (1966) observó actividad lipasa en los órganos digestivos del bivalvo Mya arenaria, mientras que Eble (1966) reportó actividad lipasa en la glándula digestiva de C. Virginica. Además, Mathers (1973) demostró actividad lipasa y esterasa en secciones histológicas del epitelio estomacal y el saco del estilo de Ostrea edulis y Crassostrea angulata. Los únicos datos relativos a las características fisicoquímicas de las enzimas lipolíticas en moluscos fueron presentados por Patton y Quin (1973), quienes reportaron una intensa actividad lipasa en los órganos digestivos del bivalvo Spisula solidissima; también observaron que la lipasa del estilo mostraba especificidad sobre la posición primaria de los triglicéridos y era capaz de hidrolizar los ésteres céricos. Otros estudios recientes incluyen análisis de actividades enzimáticas (Luna-González et al. 2004) usando un sistema comercial (APIZYM); sin embargo, estos análisis no se realizaron específicamente en órganos digestivos sino en homogeneizados de todos los tejidos de animales enteros.
Las fluctuaciones en la composición del seston pueden originar variación en el patrón enzimático, mismo que a su vez afecta los procesos de absorción de los diferentes componentes bioquímicos de la dieta como se ha descrito en varias especies (Bayne et al. 1993, Ibarrola et al. 1996, Fernández-Reiriz et al. 2001, Labarta et al. 2002, Navarro et al. 2003, Fernández-Reiriz et al. 2004).
Este estudio tuvo como objetivo determinar y cuantificar la actividad lipasa como ácidos grasos libres por medio de cromatografía de capa delgada (TLC)-densitometría, así como identificar las condiciones óptimas para la actividad lipasa en la glándula digestiva de los bivalvos. También se estudió la respuesta de la actividad lipasa en la glándula digestiva de Argopecten purpuratus (Lamarck 1819) a cambios drásticos en la dieta similares a los cambios en la disponibilidad de alimento en los ecosistemas naturales. La dieta control fue representativa de las condiciones típicas de una bahía en el sur de Chile y la dieta experimental correspondió a eventos de resuspensión de sedimento.
]]> Material y métodos
Condiciones experimentales
Se obtuvieron especímenes de A. purpuratus con longitudes de concha entre 50-60 mm (1.30-2.42 g de peso seco del tejido) de un cultivo en linternas en Hueihue, Chiloé, en el sur de Chile. Los pectínidos fueron transportados a la Universidad Austral de Chile, húmedos en acuarios para su aclimatación a condiciones estándares con una dieta control por siete días. En cada acuario (n = 3) con 30 L de agua de mar a 15°C y salinidad de 30% se mantuvieron veinte individuos, con recambios de agua cada 48 h. Después de su aclimatación, se suministró a diez individuos de cada acuario la dieta experimental durante 72 h, mientras que los otros diez individuos siguieron alimentándose de la dieta control durante el mismo periodo. Después de 24 y 72 h se muestrearon A. purpuratus control y experimentales, diseccionando y liofilizando sus glándulas digestivas.
La dieta consistió en una mezcla de Isichrysis galbana cultivada en laboratorio y sedimento natural. Para la dieta de aclimatación (dieta control) se utilizó una concentración total particulada de 3.9 mg L-1, con un contenido orgánico de 1.7 mg L-1 (42.5%) compuesto de 54.9% (0.9 mg L-1) de proteínas, 16.8% (0.3 mg L-1) de carbohidratos y 28.3% (0.5 mg L-1) de lípidos. La dieta experimental tuvo una concentración total de partículas de 20.8 mg L-1, con un contenido orgánico de 5.4 mg L-1 (26.0%) compuesto de 51.6% (2.8 mg L-1) de proteína, 28.3% (1.5 mg L-1) de carbohidratos y 20.0% (1.1 mg L-1) de lípidos.
La composición bioquímica de la dieta fue determinada de la siguiente manera: las proteinas se determinaron por el método descrito por Lowry et al. (1951) tras hidrólisis alcalina con NaOH 0.5 N a 30°C; los carbohidratos se cuantificaron en términos de glucosa usando el método fenol-sulfúrico (Strickland y Parsons 1972); y los lípidos se extrajeron utilizando el método de Bligh y Dyer (1957) modificado (Fernández-Reiriz et al. 1989).
Ensayo de enzimas in vitro
Se realizaron ensayos preliminares en otro grupo de pectínidos considerando como parámetros la concentración del tejido, el pH, el tiempo de incubación y la temperatura.
Dado lo reducido del tamaño de la glándula digestiva, se realizaron estudios preliminares para determinar la concentración óptima de tejido que garantizara la correcta cuantificación de la actividad lipasa con relación a los límites de detección del método. Dicha concentración fue fijada en 1.5 mg mL-1.
Para la determinación del perfil de actividad del pH se llevaron a cabo ensayos de actividad lipasa total a diferentes pH que variaron entre 4.0 y 8.5. La figura 1 muestra la gran dependencia de la actividad lipasa del pH, observándose la actividad óptima a pH de 7.2 mantenido durante los primeros 60 min (tiempo óptimo de incubación).
]]>
Para la determinación del perfil temperatura-actividad se realizaron ensayos de actividad lipasa total a temperaturas que variaron entre 0°C y 70°C, con incrementos de 10°C y a un pH constante de 7.2. Se encontró que la temperatura óptima para la actividad lipasa en la glándula digestiva de A. purpuratus es de 30°C (fig. 1).
Las glándulas digestivas liofilizadas fueron homogeneizadas en frío en una solución tanponada de fosfato-citrato 0.01 M (con NaCl 20 mM) a pH 6.9. Los extractos de enzimas fueron centrifugados inmediatamente a 15938 g durante 20 min y el sobrenadante resultante se utilizó para los ensayos in vitro.
El contenido proteico de los extractos digestivos se determinó siguiendo el método descrito por Lowry et al. (1951) utilizando suero de albúmina de bovino como estándar.
La actividad lipasa total se determinó de acuerdo al método de Tietz y Fiereck (1996) modificado, el cual se basa en la medición de los ácidos grasos que resultan liberados mediante la hidrólisis enzimática de los triglicéridos presentes en una solución estabilizada de aceite de oliva.
El arreglo experimental utilizado consistió en una emulsión de aceite de oliva (comercial, con 0.4 de acidez), preparada diariamente justo antes del análisis, con una mezcla de 5.25% de goma arábica en una solución de NaCl al 0.89% en agua destilada, emulsión que fue formada al sonicarse el aceite de oliva por la acción de la goma arábica:NaCl y que sirvió como sustrato para la actividad lipasa. A esta emulsión se agregó taurocolato de sodio 10 mM, CaCl 0.5 M y Tris-HCl 1 M.
Con el fin de seguir la reacción, se mezclaron 0.1 mL de extracto digestivo, 0.5 mL de emulsión de aceite de oliva, 0.05 mL de taurocolato de sodio, 0.022 mL de CaCl y 0.45 mL de Tris-HCl y se incubaron a 30°C en un baño de agua circulante. El tiempo de incubación fue de 60 min, después de los cuales se detuvo la reacción (1 min a 100°C) y se enfrió la mezcla, agregándole además 5 mL de cloroformo. Tras centrifugarla 10 min a 2853 g se recuperó la capa orgánica que se almacenó a -70°C para su análisis dentro de los siguientes 30 días (de acuerdo con estudios preliminares no publicados). La actividad lipasa fue determinada como ácidos grasos libres mediante TLC-densitometría.
Para el análisis cuantitativo de los ácidos grasos libres se utilizaron placas de sílica gel 60 W (Merck 16486) de 20 x 20 cm, y un espesor de capa de 0.25 mm. Las muestras fueron aplicadas con un dosificador TLC automático (Camag 27220). Las tinciones cromatográficas se hicieron de acuerdo con lo descrito por Freeman y West (1966). Las placas se tiñeron con una solución de CuSO4 al 10% en H3PO4 al 0.85%, calentándolas a 180°C. Para el análisis cuantitativo se utilizó como estándar ácido oléico a una concentración de 0.7 mg mL-1, utilizando y = 23494.1x - 1165.7 (r = 0.999) como la función que relaciona la respuesta del detector (y) y la concentración de ácido oléico (x). Las placas se escanearon con un densitómetro Shimadzu CS900, usando un rayo monocromático de 370 nm y 0.4 x 0.4 mm en zigzag. Toda la tinción fue leída calibrando para la corrección de línea base, de acuerdo con Fernández-Reiriz et al. (1999).
Todos los solventes, reactivos y estándares de ácidos grasos fueron de grado analítico (E. Merck, Darmstadt, y Sigma Chemical Co.).
]]> Los resultados de actividad lipasa se expresaron en términos de actividad específica: Lsp = (mg producto final liberado)/(mg proteina h), donde el producto final son los ácidos grasos. La actividad lipasa total de la glándula digestiva se reportó como: LGD = (mg producto final liberado)/(mg órgano digestivo entero h). El peso seco de los órganos digestivos se estandarizó a un equivalente a 1000 mg de peso seco de organismos enteros: Ys = (1000/We)b Ye, donde Ys es el peso seco estandarizado del órgano, Ye es el peso seco experimental del órgano, We es el peso seco total del organismo experimental, y b es el exponente peso-específico que relaciona el peso de los órganos digestivos con el peso del especimen entero (para la glándula digestiva de A. purpuratus b = 0.8125).
Análisis estadístico
Se confirmó la homogeneidad de varianza mediante una prueba de Bartlett y se realizó un análisis de varianza multivariado (MANOVA) con el fin de determinar el efecto de la dieta y el tiempo de experimentación sobre la actividad enzimática. También se compararon las diferentes dietas y tiempos de experimentación mediante ANOVA, y cuando se presentaron diferencias significativas se realizaron comparaciones de medias aplicando pruebas de Tukey con un nivel de significancia de P < 0.05 (Snedecor y Cochran 1980, Zar 1984).
Resultados
Ni las dietas ni el tiempo de experimentación tuvieron un efecto significativo en el peso seco o la proteina soluble de la glándula digestiva de A. purpuratus. La dieta mostró un efecto significativo sobre las actividades lipasa específica y total, explicando en ambos casos 58% de la varianza. No se detectaron efectos significativos asociados al tiempo de experimentación o a la interacción de dieta y tiempo (tabla 1, ANOVA de dos vías)
No se detectaron diferencias significativas en la actividad lipasa en función del tiempo de experimentación (tabla 2, P > 0.05); sin embargo, tanto la actividad lipasa específica como la total mostraron diferencias significativas entre la dieta experimental y la control, siendo los valores significativamente menores (P < 0.05) cuando A. purpuratus se alimento de la dieta experimental.
Discusión
]]> Los intervalos de pH en los que se alcanza la máxima actividad enzimática son una característica química importante de cada enzima. El pH óptimo puede variar no sólo de una especie a otra sino también entre poblaciones, variabilidad que se puede explicar principalmente por la naturaleza heterogénea de las enzimas digestivas. Sin embargo, como lo explicó Koopmans (1970), parte de esta variabilidad puede ser de origen metodológico.En este estudio, los resultados de tiempo de incubación y temperatura tuvieron una respuesta lineal cuando se trabajó a un pH óptimo (7.2) a 30°C durante los primeros 60 min. Los resultados de actividad lipasa mostraron que la actividad enzimática fue mínima entre 0°C y 20°C.
Desde un punto de vista conceptual, el método incrementa el conocimiento del papel que juega el conjunto de enzimas (carbohidrasas, proteasas y lipasas) en los órganos digestivos de los moluscos bivalvos. Fernández-Reiriz et al. (2004) demostraron que el complejo celulasa es la enzima más importante en la glándula digestiva y el estilo cristalino de A. purpuratus. Los resultados de esta investigación revelaron que las carbohidrasas (i.e. amilasa, laminarinasa y celulasa) muestran mayor actividad que las lipasas, siendo estas últimas las enzimas dominantes respecto a la actividad proteasa.
Fernández-Reiriz et al. (2001) y Labarta et al. (2002) mostraron que la inversión en recursos enzimáticos en los moluscos bivalvos (Mytilus chilensis y Mulinia edulis) era un mecanismo para optimizar la obtención de energía ante variaciones en el régimen alimenticio durante la respuesta a la aclimatación. Este cambio en la actividad enzimática ocurre tanto en el estilo cristalino como en la glándula digestiva, y depende no sólo de factores endógenos (historial alimenticio) sin también de factores exógenos (régminen trófico) así como de la interacción entre ambos.
En una investigación previa y considerando el equipamiento enzimático (amilasa, laminarinasa, celulasa y proteasa) y el balance asimilatorio por A. purpuratus, se obtuvieron valores más elevados de ingestión de proteinas y lípidos con la dieta control (con valores bajos de carga de seston) (Fernández-Reiriz et al. 2004); sin embargo, la ingestión de carbohidratos fue significativamente más baja. Con respecto a las eficiencias en la absorción (AEs) de componentes bioquímicos por A. purpuratus, las diferencias estuvieron relacionadas no sólo con la dieta disponible sino también, en el caso de la AE de lípidos, con el tiempo de exposición a la dieta experimental. La estabilidad de este último parámetro fisiológico usando la dieta control (0.61) contrasta con su acusada disminución después de alimentar a A. purpurratus por 24 h con la dieta experimental (0.42). Después de 72 h se observó una recuperación (0.61) en este parámetro, la cual pudiera ser interpretada en términos de adaptación a la nueva dieta. Con respecto a la AE de lípidos, se han descrito pérdidas fecales endógenas asociadas con dietas con concentraciones de una elevada carga total de material particulado (TPM), tal y como Navarro et al. (2003) observaron en Mytilus y Mulinia. Tomando en cuenta las tasas de ingestion (IR) y AE de lípidos, las tasas de absorción (ARs) de A. purpuratus fueron superiores con la dieta control (1.08 mg h-1) con respecto a las obtenidas con la dieta experimental (0.43 mg h-1). Despues de 72 h, con la dieta experimental, se observó una recuperación parcial de la AR (0.75 mg h-1), aunque nunca se alcanzaron los valores obtenidos con la dieta control.
Los resultados obtenidos para AE y AR de los lípidos usando la dieta control podrían estar asociados a la actividad lipasa en la glándula digestiva. Con relación a lo observado con la dieta experimental, los resultados obtenidos para la asimilación de lípidos (AE y AR) no pueden ser explicados totalmente con base en el comportamiento de la actividad lipasa en la glándula dado que a pesar de que no se encontraron diferencias significativas en esta actividad entre ambos tiempos de experimentación, se observó una recuperación de la AE de lípidos transcurridas 72 h, así como de la AR aunque la de ésta fue de menor magnitud. Este hecho puede estar relacionado con las pérdidas fecales endógenas descritas con dietas de elevada TPM o con procesos vinculados a la actividad lipasa en el estilo critalino, órgano en el que se ha reportado gran actividad lipasa para Crassostrea virginica (Langdon y Newell 1996).
Cuando A. purpuratus ha sido expuesta a variaciones cortas en la disponibilidad de alimento, se ha observado que altos valores de selección preingestiva han equilibrado las IRs orgánicas de pectínidos a los que se ha suministrado una dieta de bajo contenido orgánico (Navarro et al. 2004). Sin embargo, el comportamiento enzimático durante el tiempo experimental del presente estudio (72 h) no permite el equilibrio de procesos digestivos que afectan la incorporación de energía en esta especie, tal y como ha sido observado por Fernández-Reiriz et al. (2004) en el caso de las proteasas y las carbohidrasas, comportamiento que de acuerdo a los resultados del presente estudio parece ampliarse a las lipasas en la glándula digestiva.
Agradecimientos
Los autores agradecen a R Munilla y JL Garrido su ayuda con los procedimientos analíticos y sus valiosas sugerencias, y a G Urrutia (UACH-Chile), L Nieto, B González y A Ayala (CSIC-España) por la asistencia técnica en el laboratorio. Este estudio se realizó con el apoyo financiero de MYCIT REN 2001-0501/MAR (España) y FONDECYT 1000427 (Chile), y del Programa de Cooperación Científica Internacional (PCCI), CSIC/CONICYT (No. 2003 CL 0030).
]]>Referencias
Bayne BL, Iglesias JIP, Hawkins AJS, Navarro E, Heral M, Delous-Paoli JM. 1993. Feeding behavior of the mussel Mytilus edulis: Responses to variations in quality and organic content of the seston. J. Mar. Biol. Assoc. UK 73: 813-829. [ Links ]
Bligh EJ, Dyer WJ. 1957. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917. [ Links ]
Brock V, Kennedy VS. 1992. Quantitative analysis of crystalline style of carbohydrases in five suspension and deposit feeding bivalves. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 159: 51-58. [ Links ]
Eble AF. 1966. Some observations on the seasonal distribution of neglected enzymes in the American oyster as revealed by enzyme histochemistry. Proc. Natl. Shellfish Assoc. 56: 37-42. [ Links ]
]]>Fernández-Reiriz MJ, Pérez-Camacho A, Ferreiro MJ, Blanco J, Planas M, Campos MJ, Labarta U. 1989. Biomass production and variation in the biochemical profile (total protein, carbohydrates, RNA, lipids and fatty acids) of seven species of marine microalgae. Aquaculture 83: 17-37. [ Links ]
Fernández-Reiriz MJ, Labarta U, Albentosa M, Pérez-Camacho A. 1999. Lipid profile and growth of the clam spat, Ruditapes decussatus (L), fed with microalgal diets and cornstarch. Comp. Biochem. Physiol. 124B: 309-318. [ Links ]
Fernández-Reiriz MJ, Labarta U, Navarro JM, Velasco A. 2001. Enzymatic digestive activity in Mytilus chilensis (Hupé, 1854) in response to food regimes and past feeding history. J. Comp. Physiol. 171B: 449-456. [ Links ]
Fernández-Reiriz MJ, Labarta U, Navarro JM. 2004. Feeding and digestive response of Argopecten purpuratus (Lamarck, 1819) to short-term variation in food quality and quantity. Aquaculture 237: 347-364. [ Links ]
Freeman CP, West D. 1966. Complete separation of lipid classes on a single thin-layer plate. J. Lipid Res. 7: 324-327. [ Links ]
]]>George WC. 1952. The digestion and absorption of fat in lamellibranchs. Biol. Bull. 102: 118-127. [ Links ]
Ibarrola I, Iglesias JIP, Navarro E. 1996. Differential absorption of biochemical components in the diet of the cockle Cerastoderma edule: Enzymatic responses to variations in seston composition. Can. J. Zool. 74: 1887-1897. [ Links ]
Ibarrola I, Navarro E, Iglesias JIP, Urrutia MB. 1999. Time-course of digestive-enzyme acclimation in the cockle Cerastoderma edule. Mar. Biol. 135: 47-56. [ Links ]
Koopmans JJC. 1970. Cellulase in molluscs. I. The nature of cellulases in Helix pomatia and Cardium edule. Neth. J. Zool. 20: 445-463. [ Links ]
Labarta U, Fernández-Reiriz MJ, Navarro JM, Velasco A. 2002. Enzymatic digestive activity in epifaunal (Mytilus chilensis) and infaunal (Mulinia edulis) bivalves in response to changes in food regimes in a natural environment. Mar. Biol. 140: 669-676. [ Links ]
]]>Langdon CJ, Newell RIE. 1996. Digestion and nutrition in larvae and adults. In: Kennedy VS, Newell RIE, Eble AF (eds.), The Eastern Oyster Crassostrea virginica. Maryland Sea Grant Book, Univ. of Maryland, College Park, pp. 231-269. [ Links ]
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. 1951. Protein measurement with the pholin-phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275. [ Links ]
Luna-González A, Maeda-Martínez A, Ascensio-Valle AF, Robles-Mungaray M. 2004. Ontogenetic variations of hydrolytic enzymes in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Fish Shellfish Immunol. 16: 287-294. [ Links ]
Mathers NF. 1973. A comparative histochemical survey of enzymes associated with the process of digestion in Ostrea edulis and Crassostrea angulata (Mollusca: Bivalvia). J. Zool. 169: 169-179. [ Links ]
Navarro JM, Labarta U, Fernández-Reiriz MJ, Velasco A. 2003. Feeding behavior and differential absorption of biochemical components by the infaunal bivalve Mulinia edulis and the epibenthic Mytilus chilensis in response to changes in food regimes. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 287: 13-35. [ Links ]
]]>Navarro J, Fernández-Reiriz MJ, Labarta U. 2004. Short-term feeding response of the scallop Argopecten purpuratus exposed to two different diets. J. Mar. Biol. Assoc. UK 84: 775-779. [ Links ]
Patton JS, Quin JG. 1973. Studies on the digestive lipase of the surf clam Spisula solidissima. Mar. Biol. 21: 59-69. [ Links ]
Reid RGB. 1966. Digestive tract enzymes in the bivalves Lima hians Gmelin and Mya arenaria L. Comp. Physiol. 17: 417-433. [ Links ]
Snedecor GW, Cochran WG. 1980. Statistical Methods. Iowa State Univ. Press, Ames, 507 pp. [ Links ]
Strickland JDH, Parsons TR. 1972. A Practical Handbook of Seawater Analysis. 2nd ed. Bull. Fish. Res. Bd. Canada 167, 310 pp. [ Links ]
]]>Tietz NW, Fiereck EA. 1966. A specific method for serum lipase determination. Clin. Chim. Acta 13: 352-355. [ Links ]
Yonge CM. 1923. Studies on the comparative physiology of digestion. 1. The mechanism of feeding, digestion and assimilation in the Lamellibranch Mya. Br. J. Exp. Biol. 1: 15-63. [ Links ]
Yonge CM. 1926. Structure and physiology of the organs of feeding and digestion in Ostrea edulis. J. Mar. Biol. Assoc. UK 14: 295386. [ Links ]
Zar JH. 1984. Biostatistical Analysis. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ, 718 pp. [ Links ]
Nota
]]> Traducido al español por Manuel Gardea-Ojeda. ]]>