Ejercicio interlaboratorio de bioensayos marinos para la evaluación de la calidad ambiental de sedimentos costeros. VI. Análisis general de resultados y conclusiones del ejercicio

Interlaboratory assessment of marine bioassays to evaluate the environmental quality of coastal sediments in Spain. VI. General analysis of results and conclusions of the exercise

MC Casado-Martínez¹*, JL Buceta², JM Forja¹, TA DelValls¹

¹ Departamento de Química Física, Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales, Polígono Río San Pedro s/n, 11510 Puerto Real, Cádiz, España. * E-mail: mcarmen.casado@uca.es

Recibido en noviembre de 2004;
aceptado en septiembre de 2005.

Resumen

Para estudiar si los bioensayos de toxicidad cumplen ciertos criterios a nivel nacional se realizó un ejercicio interlaboratorio diseñado principalmente para estudiar el desarrollo, la optimización y la validación de los métodos disponibles para la evaluación de la toxicidad en material de dragado. Se evaluó la eficiencia y la utilidad de este tipo de técnicas y se compararon los resultados de toxicidad obtenidos con la caracterización química tradicional. Este ejercicio incluyó dos fases y mostró resultados satisfactorios especialmente para el ensayo Microtox^®, el ensayo con el desarrollo embrionario del erizo de mar y el ensayo con anfípodos. Estos tres ensayos parecen factibles y ofrecen información útil para la gestión de dragados portuarios. Los resultados del análisis multivariante realizado para unir la toxicidad y la contaminación registrada con los ensayos mostraron que las respuestas tóxicas registradas están correlacionadas en mayor o menor medida con los distintos contaminantes analizados en el sedimento.

Palabras clave: ecotoxicología, toxicidad de sedimento, análisis multivariate, guías de calidad de sedimento, gestión de material de dragado.

Abstract

Key words: ecotoxicology, sediment toxicity, multivariate analysis, sediment quality guidelines, dredged material management.

Introducción

Para evaluar la variabilidad en cuatro bioensayos se llevó a cabo un ejercicio interlaboratorio como parte del proceso de desarrollo y selección de una batería de bioensayos para la caracterización de materiales de dragado en España. Los ensayos seleccionados fueron el Microtox^®, siguiendo el protocolo para la fase sólida (SPT) y el nuevo protocolo básico para muestras sólidas (BSPT); el ensayo de desarrollo larvario a 48 h con embriones de erizo de mar para la evaluación de lixiviados de sedimentos; y el bioensayo con anfípodos y juveniles de bivalvo, ambos desarrollados sobre la fase sólida. Los principales objetivos de estudio de los ensayos fueron: (1) evaluar la precisión de cada bioensayo para caracterizar la toxicidad de materiales de dragado cuando son desarrollados por distintos laboratorios; (2) identificar los principales factores de confusión que pueden afectar la interpretación de los resultados; (3) discutir las posibles causas de variabilidad interlaboratorio para mejorar el protocolo estándar y así el uso de los bioensayos como herramienta complementaria para la caracterización y gestión de dragados portuarios; y (4) discutir las guías biológicas previamente propuestas para cada ensayo para considerar las muestras como tóxicas o no tóxicas (Casado-Martínez et al. 2006a).

Las condiciones relacionadas con el muestreo y manipulación de los sedimentos han sido previamente discutidas (Casado-Martínez et al. 2006a), así como los resultados para cada uno de los bioensayos utilizados (Casado-Martínez et al. 2006b-e). El objetivo de este trabajo es analizar globalmente los resultados y conclusiones, y estudiar el uso de los ensayos biológicos en los procesos de caracterización para la gestión de dragados en España conjuntamente con la tradicional caracterización química. Además, las series de datos se estudiaron mediante un análisis estadístico multivariante para evaluar la relación entre los efectos biológicos adversos y la concentración de los compuestos potencialmente tóxicos.

Material y métodos

Con el propósito de encontrar posibles relaciones entre las distintas variables se utilizó un análisis factorial de componentes principales como procedimiento de extracción (DelValls y Chapman 1998, Riba et al. 2003). Los datos obtenidos se analizaron individualmente para cada fase del ejercicio mediante la técnica de extracción de componentes principales con el programa estadístico Statistica^® 5.0. El análisis de los factores se realizó en la matriz de correlación y todos los datos biológicos fueron tratados de forma similar suponiendo igual importancia para cada ensayo. Los datos de toxicidad se transformaron de forma que mostrasen un aumento en el valor al aumentar los efectos biológicos.

Fase I

El conjunto de variables originales comprendió 28 series de datos, cada una con 10 variables químicas (As, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Zn, Σ₇-PCBs y Σ₁₆-PAHs), 3 parámetros convencionales del sedimento (porcentaje de arenas, porcentaje de finos y contenido en material orgánica) y 15 variables de efecto biológico: los resultados para el ensayo Microtox^® SPT expresados como unidades tóxicas (100/EC50), el porcentaje de larvas anormales tras 48 h de exposición a los lixiviados, el porcentaje de mortalidad de anfípodos, así como el porcentaje de mortalidad de bivalvos tras 14 días de exposición (tabla 1). Sólo se incluyeron en el análisis multivariante los resultados de los laboratorios que obtuvieron resultados con todas las muestras y que, además, se consideraron aceptables: cinco laboratorios para el Microtox^®, nombrados A1, A2, A3, A4 y A5 (Casado-Martínez et al. 2006b); cuatro para el ensayo con anfípodos, identificados como B1, B3, B4 y B5 (Casado-Martínez et al. 2006c); dos para el ensayo con bivalvos, C1 y C2 (Casado-Martínez et al. 2006d); y cuatro para el ensayo con larvas de erizo de mar, D2, D3, D4 y D5 (Casado-Martínez et al. 2006e).

Los resultados del análisis agruparon los datos originales en tres nuevos factores que explicaban 80% de la varianza original. Estos nuevos factores van a ser descritos según las variables dominantes con un peso positivo de 0.25 o superior (tabla 2) aunque los valores negativos en los nuevos factores son de igual importancia. El primer factor, que suma 35% de la varianza total, combina el porcentaje de finos y los compuestos As y Cu así como el Pb y Zn, y los compuestos Ni, PCBs y PAHs con pesos negativos. Las variables biológicas con pesos positivos para este factor incluyen los resultados del Microtox^® en los laboratorios 4 y 5, los resultados de los ensayos con anfípodos y con almejas y todos los resultados del ensayo con embriones de erizo de mar excepto los correspondientes al laboratorio 2. El segundo factor explica 20% de la varianza total y aparece relacionado con el contenido de ciertos metales (Cd, Cr, Hg, Ni, Pb y Zn obtienen pesos positivos mayores a 0.6) y el efecto tóxico registrado para el ensayo de anfípodos, los resultados de un laboratorio con el Microtox^® y los resultados de otro laboratorio con el ensayo de desarrollo larvario. Por último, el tercer factor extraído, que explica 18% de la varianza, representa el porcentaje de finos en el sedimento y el contenido en materia orgánica. Las variables químicas Ni, PCBs y PAHs y los efectos registrados con el ensayo Microtox^® obtuvieron los mayores pesos en cada caso para este factor.

Los resultados de este análisis se presentan gráficamente en la figura 1, que representa la contribución de los factores en cada caso de estudio (muestras). Al parecer, los compuestos químicos agrupados en los factores 1 y 2 son los causantes de los efectos letales registrados, con una importante contribución de este factor en las muestras C, E y F, aunque es difícil identificar los compuestos causantes de esta toxicidad ya que las respuestas tóxicas no se agrupan uniformemente en ninguno de los nuevos factores. Los efectos letales registrados mediante el ensayo con almejas en los dos laboratorios tienen pesos positivos alrededor de 0.9 para el factor 1 y con una importante contribución de la muestra C. Esta medida tóxica parece reproducible entre los laboratorios y los efectos pueden relacionarse principalmente con las concentraciones de As y Cu y en menor medida de Pb y Zn. Para el ensayo con anfípodos los valores más altos se localizan también en el factor 1 aunque con pesos positivos en todos los nuevos factores extraídos: parece que la mortalidad de anfípodos se ve afectada principalmente por las especies metálicas As, Cu, Cd, Cr, Hg, Ni, Pb y Zn pero también por los compuestos orgánicos analizados. En cualquier caso los resultados parecen reproducibles entre laboratorios aunque se encuentran ligeras diferencias para el laboratorio 5, que utilizó la especie Mycrodeutopus gryllotalpa y obtuvo pesos más elevados para el factor 3, donde se encuentran los mayores pesos para el porcentaje de finos, el contenido en materia orgánica pero también de los compuestos de naturaleza orgánica.

Los resultados del ensayo Microtox^® obtuvieron pesos positivos para el factor 3, aunque los laboratorios 4 y 5 tuvieron pesos positivos también para el factor 1. Los resultados del análisis multivariante muestran que los resultados son reproducibles entre los laboratorios ya que en todos los casos se han obtenido pesos positivos elevados en el factor 3 y por lo tanto las respuestas tóxicas estarían relacionadas principalmente a las variables incluidas en este factor (porcentaje de finos y materia orgánica en el sedimento y los compuestos químicos As y Cu así como el Pb y Zn, y los compuestos Ni, PCBs yPAHs con pesos negativos. Las variables biológicas con pesospositivos para este factor incluyen los resultados del Microtox^® en los laboratorios 4 y 5, los resultados de los ensayos con anfípodos y con almejas y todos los resultados del ensayo conembriones de erizo de mar excepto los correspondientes allaboratorio 2. El segundo factor explica 20% de la varianzatotal y aparece relacionado con el contenido de ciertos metales (Cd, Cr, Hg, Ni, Pb y Zn obtienen pesos positivos mayores a 0.6) y el efecto tóxico registrado para el ensayo de anfípodos, los resultados de un laboratorio con el Microtox^® y los resultados de otro laboratorio con el ensayo de desarrollo larvario. Por último, el tercer factor extraído, que explica 18% de lavarianza, representa el porcentaje de finos en el sedimento y elcontenido en materia orgánica. Las variables químicas Ni,PCBs y PAHs y los efectos registrados con el ensayo Microtox^® obtuvieron los mayores pesos en cada caso para estefactor.

Los resultados del ensayo sobre la fase líquida mostraron en la Fase I una respuesta más variable entre laboratorios: el laboratorio 2 no mostró factores con pesos positivos en ninguno de los nuevos factores y por lo tanto no se podría establecer ningún tipo de relación entre las respuestas tóxicas y las variables fisicoquímicas. Las diferencias en los resultados han sido previamente discutidas (Casado-Martínez et al. 2006e) y pudieron estar influenciadas por otros factores relacionados con la preparación de las muestras y no incluidos en el análisis multivariante. En cualquier caso las muestras se distribuyeron desde un mismo laboratorio al mismo tiempo y posibles cambios en las propiedades químicas del sedimento pudieron haberse debido a cambios durante el almacenamiento, extracción o pre-tratamiento de las muestras. Los efectos registrados para los otros tres laboratorios parecen debidos a las variables explicadas por el factor 1 y, por lo tanto, el desarrollo anormal de las larvas aparecería relacionado con las especies químicas As, Cu, Pb y Zn aunque para un laboratorio en particular también se relacionan con las concentraciones de Cd, Cr, Hg, Ni, y PCBs. Los pesos negativos tan elevados en el factor 3 parecen indicar que los posibles efectos no sólo se relacionan con los compuestos metálicos sino que cuestionan los posibles efectos causados por la presencia de compuestos orgánicos en los lixiviados.

El conjunto de datos originales comprendía 13 variables relacionadas con las propiedades del sedimento (As, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Zn, Σ₇-PCBs y Σ₁₆-PAHs y el porcentaje de arenas, porcentaje de finos y contenido en material orgánica del sedimento) y 14 variables de efectos biológicos (tabla 3): siete laboratorios para el ensayo Microtox^® siguiendo el protocolo SPT (A1 a A7), tres siguiendo el protocolo BSPT (B1 a B3) y cuatro para el ensayo de desarrollo larvario con embriones de erizo de mar (C1 a C4). Los resultados clasifican las variables originales en cinco nuevos factores que explican el 100% de la varianza total. La tabla 4 incluye los porcentajes de varianza explicada por cada uno de los nuevos factores y los pesos de cada variable original. En la figura 2 los coeficientes de los nuevos factores para cada uno de los casos (muestras) se representan frente al centroide de todos los casos de los datos originales para estimar la contribución de cada uno de los casos en las nuevas variables o factores. El primer factor, que explica más del 45% de la varianza total, representa las variables contenido en materia orgánica, Cd, Cr y Pb, con los pesos más elevados para las concentraciones de PCBs y PAHs. Este factor también explica la mayor parte de la variabilidad asociada al Microtox^® con ambos protocolos (SPT y BSPT), y a los efectos del ensayo con embriones de erizo de mar de dos laboratorios. El factor 2 representa el porcentaje de finos y el contenido en materia orgánica del sedimento, aunque para esta última variable con pesos inferiores a los encontrados para el factor 1 y las especies metálicos As, Cr y Hg. Este factor explica la mayor parte de la variabilidad asociada con el ensayo con embriones de erizo de mar, que también parece influido por el Ni, representado por el factor 5 y con altos pesos positivos. El factor 3, que explica algo más del 15% de la varianza total, explica parte de la varianza asociada al As, Cu, Pb y Zn y a uno de los laboratorios para el Microtox^®. Los otros dos factores (4 y 5) explican cada uno algo menos del 10% de la varianza total pero con correlaciones interesantes para algunas de las variables. El factor 4 agrupa el contenido en material orgánica de los sedimentos con los compuestos Hg y PCBs, así como los efectos tóxicos registrados en la mitad de los laboratorios que realizaron el Microtox^®. Por otro lado, el factor 5 agrupa las concentraciones de Ni, los efectos tóxicos registrados con el ensayo con embriones de erizo de mar y, en menor medida, ciertos efectos en la disminución de la luminiscencia.

Aunque los resultados obtenidos en la Fase II son similares a los obtenidos en la Fase I la reproducibilidad de las respuestas tóxicas parece mucho más conservativa, especialmente con relación al nuevo protocolo del Microtox^® (BSPT). El análisis multivariante ha identificado una mayor correlación entre Hg, PCBs y el contenido en materia orgánica en el factor 4, que también explica parte de la varianza de los resultados tóxicos con este protocolo. Por otro lado la contribución de ciertos compuestos metálicos en las respuestas tóxicas del ensayo de embriones de erizo de mar, como por ejemplo las de As, Cr, Pb y Zn, aparecen en el análisis de los resultados de ambas fases aunque la Fase II identifica también los compuestos Hg y Ni.

Discusión

Los resultados del ejercicio interlaboratorio con el ensayo Microtox^® y el ensayo con anfípodos parecen ofrecer resultados satisfactorios con relación a las condiciones de desarrollo y en especial incluyendo las circunstancias particulares de cada laboratorio. El ensayo con almejas no ofreció los resultados esperados posiblemente debido a los pocos de laboratorios que participaron en el estudio; sin embargo, este ensayo parece factible para la evaluación de la toxicidad de sedimentos. Se requiere un mayor desarrollo de los protocolos para las medidas letal y subletal, para poder ser usadas en la gestión de material de dragado. Del mismo modo la sensibilidad de esta especie parece menor a la de las especies de anfípodos utilizadas, que parecen más recomendables para la caracterización de este tipo de materiales durante su gestión. El ejercicio interlaboratorio se repitió para el ensayo con larvas de erizo y para el ensayo Microtox^®, ya que los resultados obtenidos inicialmente no fueron tan contundentes como se esperaban. La presencia de algunos factores de confusión a la hora de interpretar los resultados de la Fase I se evitó en la Fase II. Tras el segundo ejercicio la variabilidad interlaboratorio disminuyó hasta encontrarse en rangos similares a los de estudios previos. La homogeneidad de los protocolos para asegurar la compatibilidad de los resultados obtenidos por los diferentes operadores indica que los bioensayos sobre sedimento parecen recomendables. Si los resultados van a ser utilizados con fines de regulación ambiental, el personal debería estar convenientemente formado y sería recomendable su participación en ejercicios y cursos de evaluación continuada, lo que permitiría la evaluación de la variabilidad inter e intralaboratorio para cada uno de los bioensayos que se utilizan en la gestión del material de dragado en España.

Es difícil interpretar los resultados de los ensayos de toxicidad con relación a los resultados de contaminación y otros factores fisicoquímicos del sedimento. La conclusión más convincente sería la de relacionar estadísticamente los resultados de toxicidad con concentraciones de contaminantes específicos o con determinados grupos de contaminantes. Según los resultados del análisis multivariante parece de especial interés la correlación con altos pesos para el Hg, los PCBs y el contenido en materia orgánica del sedimento identificada en el factor 4, que también explica parte de los efectos tóxicos registrados en el ensayo Microtox^®. Si suponemos que estas tres variables normalmente registran valores altos en sedimentos de puertos y áreas urbanas, principalmente relacionados con el vertido de residuos sin depurar, el Microtox^® parece recomendable para la evaluación inicial de la toxicidad de sedimentos provenientes de este tipo de zonas.

La batería de efectos tóxicos medidos no se relaciona con las mismas especies de contaminantes. Además la toxicidad para cada una de las especies y las medidas registradas no siguen las mismas tendencias en todos los casos (tabla 5) y estas diferencias se pueden también identificar mediante el análisis multivariante de los resultados. Se recomienda una batería de ensayos que incluya distintas medidas y distintos medios de exposición para proteger de modo efectivo todos los compartimentos ambientales. En este sentido y de acuerdo con los resultados de este ejercicio, una batería que incluya el ensayo Microtox^®, el bioensayo con anfípodos desarrollado sobre la fase sólida y el ensayo de desarrollo larvario con embriones de erizo de mar sobre los lixiviados de los sedimentos, parece ser adecuada para la gestión de la toxicidad de sedimentos de dragado. Las distintas especies que se usaron han mostrado resultados satisfactorios si los criterios de toxicidad se refieren a los resultados de un control de toxicidad negativo y si se utilizan técnicas estadísticas adecuadas para identificar diferencias en las respuestas. La selección de las especies para cada caso de estudio debe hacerse de acuerdo a las circunstancias particulares, pero siempre que se pueda asegurar que los resultados pueden ser utilizados para la toma de decisiones. Las agencias españolas a utilizar los resultados de los ensayos deberían ser las encargadas de decidir los criterios de aceptabilidad.

Finalmente, y de acuerdo con los resultados obtenidos para contaminantes bioacumulables no asociados a ninguno de los efectos agudos medidos, debería recomendarse para el futuro ensayos nuevos y específicos para evaluar la bioacumulación y sus efectos potenciales en el ambiente y en la salud humana, especialmente para contaminantes especialmente dañinos como por ejemplo las dioxinas o los PAHs. En resumen, esta es la primera iniciativa española para la evaluación interlaboratorio de ensayos de toxicidad con muestras de dragados portuarios. En cualquier caso los resultados no son definitivos ya que los ensayos deberían someterse a ejercicios periódicos que ayudasen a la mejora continua de los protocolos y a asegurar que los resultados de los laboratorios cumplen ciertos requisitos de calidad.

Este estudio se realizó como parte de un proyecto conjunto entre el CEDEX y la Universidad de Cádiz. Parte del trabajo fue financiado por el Ministerio Español de Ciencia y Tecnología (REN2002 01699/TECNO). MC Casado-Martínez agradece la financiación mediante una beca del programa Nacional de Formación de Personal Investigador al Ministerio de Educación y Ciencia. Nuestro agradecimiento a A. Luque por sus comentarios durante la preparación del manuscrito final.

Referencias

Casado-Martínez MC, Buceta JL, Forja JM, DelValls TA. 2006a. Interlaboratory assessment of marine bioassays to evaluate the environmental quality of coastal sediments in Spain. I. Exercise description and sediment quality. Cienc. Mar. (this issue).

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