Ejercicio interlaboratorio de bioensayos marinos para la evaluación de la calidad ambiental de sedimentos costeros. IV. Ensayo de toxicidad sobre sedimento con crustáceos anfípodos
Interlaboratory assessment of marine bioassays to evaluate the environmental quality of coastal sediments in Spain. IV. Whole sediment toxicity test using crustacean amphipods
MC Casado-Martínez1*, R Beiras2, MJ Belzunce3, MA González-Castromil4, L Marín-Guirao5, JF Postma6, I Riba7, TA DelValls1
1 Departamento de Química Física, Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales, Polígono Río San Pedro s/n, 11510 Puerto Real, Cádiz, España. * E-mail: mcarmen.casado@uca.es
]]> 2 Area de Ecoloxia, Facultade de Ciencias do Mar, Universidade de Vigo, Vigo, Galicia, España.3 AZTI-Fundación, Unidad de Investigación Marina, Herrera kaia, Portualdea z/g, 20110 Pasajes, Guipúzcoa, España.
4 CIS Centro de Investigaciones Submarinas, Laboratorio de Calidad y Medioambiental, Vía Nobel 9, 15890 Santiago de Compostela, A Coruña, España.
5 Departamento de Ecología e Hidrología, Facultad de Biología, Universidad de Murcia, 30100 Murcia, España.
6 AquaSense Laboratories, PO Box 95125, 1090 HC Amsterdam, The Netherlands.
7 Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía, Polígono Río San Pedro s/n, 11510 Puerto Real, Cádiz, España.
Recibido en noviembre de 2004;
aceptado en septiembre de 2005.
]]> Resumen
Se estudió la precisión interlaboratorio del bioensayo con crustáceos anfípodos. Se recogieron nueve series de datos procedentes de distintos laboratorios europeos y de cuatro especies distintas (Ampelisca brevicornis, Corophium volutator, Corophium multisetosum y Microdeutopus gryllotalpa), todas ellas usadas previamente para la caracterización de la toxicidad de sedimentos en España. Esos resultados se estudiaron para evaluar la variabilidad interlaboratorio de acuerdo a las diferentes especies y los distintos tiempos de almacenamiento de las muestras antes del ensayo. Los resultados mostraron coeficientes de variación similares a los encontrados en estudios previos y permitieron una clasificación homogénea de las muestras entre los laboratorios que completaron el ejercicio con éxito. No se identificaron tendencias significativas debidas al uso de distintas especies y, al parecer, el factor que puede afectar más críticamente la clasificación de las muestras y, por lo tanto, el uso de los resultados para la toma de decisiones, es el tiempo de almacenamiento de los sedimentos previamente al desarrollo del ensayo.
Palabras clave: material de dragado, bioensayo, calidad de sedimentos, España.
Abstract
Interlaboratory variability was studied for the bioassay using crustacean amphipods. Nine series of data were obtained from different laboratories using four different species (Ampelisca brevicornis, Corophium volutator, Corophium multisetosum and Microdeutopus gryllotalpa), all previously used for sediment toxicity assessment in Spain. Results were studied for interlaboratory variability and according to different confounding factors. The coefficients of variation were similar to those previously reported for this bioassay and sample classification was homogeneous among the laboratories that succesfully completed the exercise. No significant tendencies related to test species were identified and it seems that the factor most critically affecting test results and the classification of samples is storage time before testing.
Key words: dredged material, bioassay, sediment quality, Spain.
Introducción
El bioensayo con crustáceos anfípodos se ha convertido en un ensayo de referencia para la caracterización de sedimentos contaminados y material de dragado, y es usado rutinariamente para evaluar los efectos biológicos potenciales de este tipo de muestras ambientales. Existen en la actualidad protocolos estandarizados (ASTM 1991, Environment Canada 1992, USEPA 1994, RIKZ 1999) para distintas especies (p.e. Corophium volutator, Ampelisca abdita, Rhepoxynius abronius) pero se han utilizado otras especies autóctonas con algunas modificaciones a las condiciones de ensayo (Costa et al. 1998, Onorati et al. 1999). En España se han usado con éxito distintas especies para la caracterización de sedimentos y materiales de dragado: Corophium volutator (Casado-Martínez et al. 2004), C. multisetosum (Belzunce et al. 2004), Ampelisca brevicornis (Riba et al. 2003, 2004) y Microdeutopus gryllotalpa (DelValls et al. 1998, César et al. 2002). La principal razón de la variabilidad en la selección de la especie con la que se realiza el ensayo radica en la distribución a lo largo de las costas españolas de cada una de ellas, ya que su abundancia depende de la zona geográfica y de su disponibilidad a lo largo del año. Aunque todas ellas parecen recomendables para la caracterización de materiales de dragado y el efecto de la sensibilidad en la toma de decisiones puede ser evitado mediante el uso de análisis estadísticos para la clasificación de las muestras como tóxicas o no tóxicas, otros factores pueden ser causantes de toxicidad y deben tenerse en cuenta para el análisis de los resultados. Entre éstos, el tamaño de grano parece tener efectos en algunas especies de anfípodos. Por ejemplo Rhepoxynius abronius parece verse afectado por sedimentos muy finos y aunque estas diferencias pueden ser mínimas cuando se estudian sedimentos contaminados, la supervivencia puede llegar a reducirse en un 15% cuando los porcentajes de limos y arcillas son del 80% aun en ausencia de contaminación (Tay et al. 1998). Cabe mencionar que estos porcentajes de sedimentos de tamaños finos son comunes en muestras de materiales de dragado (DelValls et al. 2001, 2003).
]]> Para el ejercicio se distribuyó un protocolo general a cada uno de los laboratorios participantes ya que la mayoría de ellos disponía de personal experimentado en el uso de este ensayo de toxicidad. Los principales factores que pueden causar variabilidad en los resultados interlaboratorio son el uso de distintas especies de anfípodos de distintas poblaciones que, por lo tanto, estuvieron sujetas a distinta aclimatación, manipulación y mantenimiento de los organismos. Los objetivos principales fueron evaluar la habilidad de los distintos laboratorios para caracterizar sedimentos contaminados como tóxicos o no tóxicos, determinar diferencias en la supervivencia media registrada en los distintos laboratorios y detectar las causas de estas diferencias. En caso de introducir cualquier modificación al protocolo común, ésta se incluyó en la memoria de los resultados. Otros factores, como el tiempo de almacenamiento, han sido estudiados para intentar esclarecer su posible influencia en la toxicidad registrada.
Material y métodos
Los anfípodos fueron recogidos por los laboratorios participantes en las zonas donde cada uno los recogía normalmente para sus ensayos de toxicidad. En todos los casos se trataba de áreas libres de contaminación. Los organismos se aclimataron a las condiciones del laboratorio en acuarios de 20 L con unos 3 cm de sedimento aproximadamente y agua de mar, y con aireación ajustada para no remover el sedimento del fondo. Los organismos se alimentaron con una mezcla de microalgas o alimento comercial (dependiendo del laboratorio) una vez por semana y el agua sobrenadante se cambió al día siguiente. Durante el periodo de aclimatación se controlaron el pH, la concentración de oxígeno disuelto, la salinidad y la temperatura.
El ensayo con anfípodos se desarrolló a 10 días de exposición en condiciones estáticas y sobre el sedimento en bruto. Los parámetros para la realización del ensayo en el laboratorio se incluyen en la tabla 1, aunque se tuvieron en cuenta ciertas modificaciones en las condiciones dependiendo de la especie utilizada. Los sedimentos se añadieron a las cámaras de exposición hasta una profundidad de 3 cm y posteriormente se les añadió agua de mar en relación 1:4 v/v sedimento:agua. Una vez que los sedimentos hubieron decantado se inició la aireación al menos durante 12 h previamente a la introducción de los organismos. Se usaron 20 anfípodos por replica y un mínimo de tres replicas por muestra. Pasados los 10 días de exposición se registró el porcentaje de supervivencia mediante el tamizado (0.5 mm) de las muestras y se calculó el porcentaje medio de mortalidad en cada una. Los organismos desaparecidos se consideraron como muertos.
Para evaluar la variación interlaboratorio se ha calculado el coeficiente de variación (CV) para cada muestra como el cociente entre la desviación estándar (SD) y la media de los laboratorios (X):
Además se estudió el efecto de esta variabilidad en la clasificación de las muestras según los resultados del ensayo en cada laboratorio individualmente. El porcentaje de mortalidad se normalizó mediante transformación angular y fue tratado como una distribución normal para posteriormente buscar diferencias entre el control negativo de toxicidad (sedimento A) y cada una de las muestras. Las muestras significativamente homogéneas (P ≤ 0.05) fueron identificadas mediante un test ANOVA y test de Tukey mediante el programa estadístico SPSS 11.0.
Resultados
]]> En total se recogieron datos de nueve laboratorios participantes. Los laboratorios (identificados del 1 al 9), las fechas de ensayo y las especies utilizadas por cada uno de ellos se presentan en la tabla 2. Se encontraron diferencias importantes en el tiempo de almacenaje de las muestras de sedimento previamente al inicio del ensayo, muy por encima de los tiempos recomendados que son de tres a cuatro semanas (USEPA 1994), sin embargo, por diversas razones este tiempo varió desde las tres semanas hasta tres meses para algunos laboratorios. Los resultados de mortalidad media y la desviación estándar se presentan en la figura 1, en la que se aprecia la disminución de la toxicidad registrada por los laboratorios 7, 8 y 9 para todas las muestras excepto la F. Todos los laboratorios excepto el 6 y el 9 alcanzaron los valores mínimos de supervivencia en el sedimento control para la aceptabilidad del ensayo (90%). Por ello los resultados de los laboratorios 6 y 9 no fueron considerados para el cálculo de los parámetros estadísticos. Los parámetros de calidad del agua (concentración de oxígeno disuelto, pH, salinidad, temperatura y amonio total) estuvieron en el rango permitido para las especies.
Los resultados del análisis para identificar las muestras estadísticamente homogéneas (P ≤ 0.05) se muestran en la figura 2. Como puede observarse, todos los laboratorios clasifican a la muestra A como no tóxica y a las muestras F y C como las más tóxicas. El resto de las muestras (B, D y E) podrían ser clasificadas como moderadamente tóxicas aunque se observan diferencias en sus valores de mortalidad y en su clasificación respecto al resto de muestras.
Los resultados del estudio interlaboratorio se resumen en la tabla 3. Si incluimos para el cálculo todos los resultados excepto aquellos que no cumplen los criterios de aceptabilidad para el control negativo, el coeficiente de variación interlaboratorio fue alto para la muestra A (114.5%) debido principalmente a los bajos valores de mortalidad en todos los laboratorios, que distorsionan el valor de la estimación de la variabilidad mediante este método. Con el resto de las muestras el CV varía entre 69% y 19%, para las muestras D y F respectivamente. Si se calculan estos parámetros excluyendo también los laboratorios que desarrollaron el ensayo fuera del tiempo máximo de almacenamiento recomendado (cuatro semanas) los CV se encuentran entre 81% para la muestra A y 10.5% para la muestra F, con un CV medio del 33% (23% si excluimos la muestra A). Con todas las muestras se obtuvieron valores medios de mortalidad mayores a 50% excepto con la muestra A.
Discusión
El bioensayo con crustáceos anfípodos se realizó con éxito en casi todos los laboratorios. Excepto dos laboratorios (los laboratorios 6 y 9) que superaron los valores de mortalidad permitidos para el control de toxicidad negativo, el resto de los resultados se consideraron aceptables y no se encontraron factores importantes de confusión para el análisis de dichos resultados. Si el laboratorio tiene cierto nivel de experiencia previa, como en la mayoría de los casos, el ensayo puede ser desarrollado con facilidad. Cabe mencionar que en uno de los laboratorios cuyos resultados quedaron invalidados por la elevada mortalidad en el control negativo de toxicidad era la primera vez que se realizaba el ensayo.
]]> El ensayo parece adecuado para la caracterización en laboratorio de la toxicidad de muestras de dragado ya que los laboratorios clasificaron eficazmente las muestras de acuerdo con la contaminación presente (Casado-Martínez et al. 2006). Dentro de la reglamentación para el proceso de este tipo de sedimentos se han usado distintas aproximaciones para la clasificación de las muestras según la respuesta del ensayo de toxicidad. Algunos países han optado por criterios absolutos en forma de valores de mortalidad que clasifican las muestras como tóxicas si éstos son superados (por ejemplo el Reino Unido considera tóxicas las muestras con mortalidades superiores al 40% en el ensayo con Corophium volutator). Otras agencias utilizan el doble criterio de un valor mínimo de mortalidad superior a un sedimento de referencia o control y además la diferencia estadística (den Besten 2003). En este caso se ha utilizado el criterio del 20% de mortalidad superior al sedimento control y la diferencia estadística para considerar una muestra como tóxica (USEPA 1998, Environment Canada 2000). Como se ha mencionado anteriormente, la clasificación de las muestras según su toxicidad fue similar en todos los laboratorios aunque ciertamente existe variabilidad en los porcentajes de mortalidad registrados en cada uno de ellos. Una de las causas de esta variabilidad es el tiempo de almacenamiento de las muestras que parece provocar la disminución de la toxicidad medida. El laboratorio 7, que realizó el ensayo cuatro semanas después del muestreo de los sedimentos, obtuvo resultados de toxicidad para las muestras D y E estadísticamente similares (P ≤ 0.05) al control de toxicidad negativo y las muestras B y C podrían ser consideradas moderadamente tóxicas. Cuando el tiempo de almacenamiento aumenta a más de cuatro semanas, como es el caso del laboratorio 8, sólo los efectos producidos por la muestra F serían considerados como estadísticamente diferentes al sedimento control (P ≤ 0.05), mientras que las otras cuatro muestras C, E, B y D se considerarían, al igual que la muestra A (P ≤ 0.05), no tóxicas. Dado que el aumento del tiempo de almacenamiento parece afectar la toxicidad registrada y, por lo tanto, la clasificación de los materiales, éste debería ser un factor crítico a considerar por las agencias reguladoras para aceptar los resultados. Aunque los resultados de este ejercicio deben tomarse con precaución, cabe destacar que los resultados de los ensayos realizados tras ocho semanas desde la recogida de las muestras ya no obtuvieron la misma clasificación de los sedimentos, clasificando como no tóxicos materiales de categoría III con altas concentraciones químicas (Casado-Martínez et al. 2006).En cuanto a la variabilidad de los resultados, el valor de CV encontrado con la muestra A, considerada control de toxicidad negativo, es notablemente superior a los valores encontrados con el resto de las muestras. Esto no significa que esta variabilidad afecte al análisis de los resultados obtenidos ya que los resultados clasifican claramente en todos los casos la muestra como no tóxica, sino más bien refleja los inconvenientes del uso de este valor para estimar la variabilidad, ya que si expresásemos los resultados como porcentaje de supervivencia, el CV tomaría valores muy elevados con aquellas muestras con valores medios más bajos, que en este caso corresponderían a las muestras más tóxicas. Del mismo modo parece haber mayor variabilidad en el ensayo de muestras medianamente tóxicas, la cual disminuye al aumentar la toxicidad: las muestras D y E, con valores de mortalidad de ~50%, obtuvieron CV ~30%; con la muestra B la mortalidad fue de 60% y el CV de 28%; mientras que las muestras C y F, las más tóxicas de las analizadas con valores medios de mortalidad de 85% y 95%, registraron menor variabilidad con CVs de 18% y 10%, respectivamente.
La posibilidad de falsos negativos, entendidos como sedimentos tóxicos que son clasificados por un ensayo como no tóxicos, debe ser estudiada por sus implicaciones ambientales. En este sentido, parece que el mayor factor que puede hacer aumentar el número de falsos negativos es el aumento del tiempo de almacenamiento. Por el contrario los falsos positivos, entendidos como los sedimentos no tóxicos clasificados como tóxicos, son también de importancia cuando se deben usar los resultados de estos ensayos para la toma de decisiones, especialmente si han de ser utilizados como principal herramienta legislativa en procesos de gestión. Para minimizar el número de decisiones erróneas y, por lo tanto, los costes ambientales y económicos asociados a este tipo de actividades, deben conocerse los factores que pueden aumentar la toxicidad de las muestras; es decir, los factores que pueden aumentar el número de falsos positivos asociados al método. No sólo la variabilidad y la naturaleza de los sedimentos van a causar efectos tóxicos. Existen numerosos factores que pueden enmascarar la respuesta tóxica, como por ejemplo cambios en el pH o la presencia de determinados compuestos como sulfuros o amonio, aunque una correcta caracterización de la calidad del agua puede ayudar a identificar estos factores y asegurar que se encuentran dentro de los límites de tolerancia para la especie. Otro posible factor de confusión es la distribución de tamaños de grano del sedimento. Las distintas especies utilizadas se encuentran normalmente en sedimentos de distinta naturaleza: las especies Ampelisca brevicornis y Corophium multisetosum son características de sedimentos arenosos (<5% de limos <63 μm) pero Corophium volutator predomina en sedimentos limosos (contenido en limos <63 μm mayor al 20%). Se han realizado distintos estudios para identificar posibles efectos adversos de este factor y para establecer los rangos óptimos para determinadas especies. Un estudio realizado por la agencia ambiental canadiense incluso estableció una clasificación de las especies recomendadas en ese país según el grado de sensibilidad al tamaño de grano (Environment Canada 1992). Dado que los resultados de este ejercicio no pueden llevar a conclusiones de este tipo, se recomienda el estudio de los resultados en cada caso y de acuerdo a los factores que pueden afectar a la especie utilizada hasta que no se disponga de rangos de aplicabilidad y/o recomendaciones explícitas por parte de las agencias competentes.
En general, se puede considerar que los resultados de este primer ejercicio son similares a los obtenidos previamente en otros ejercicios interlaboratorio aún cuando se incluyen los resultados de ensayos realizados tras 8 y 12 semanas del muestreo de los sedimentos (CV = 61%). Cuando se cumplen todos los criterios de aceptabilidad, el valor medio de CV de 33% está incluso por debajo del valor de 46% desarrollado por Parkhurst et al. (1992) tras la revisión de la variabilidad en ensayos agudos realizados con compuestos químicos individuales. Este último valor, que se desarrolló con resultados para distintas especies, puede ser considerado como el CV esperado cuando se realizan ensayos de toxicidad debido al factor biológico (Still et al. 2000). Además, la variabilidad en nuestros resultados es similar a la obtenida con C. volutator por Bowmer (1993), quien registró CVs entre 39% y 52% aunque con sedimentos contaminados artificialmente y gran experiencia de los laboratorios en el desarrollo del ensayo. En el mismo rango, Schlekat et al. (1995) estudiaron la variabilidad para el ensayo con Eohaustorius estuarius (CV de 1.5-45%), Leptocheirus plumosus (CV de 5-65%) y Ampelisca abdita (CV de 5-146%) y Mearns et al. (1986) con Rhepoxynius abronius obtuvieron CVs de 6-81%. Aunque la posible influencia de la experiencia en el desarrollo del ensayo en los resultados y en su interpretación puede evitarse mediante cursos de perfeccionamiento, es más difícil encontrar especies comunes para las distintas zonas geográficas; no obstante, parece que el uso del doble criterio para la clasificación de las muestras como tóxicas puede evitar la variabilidad debida al uso de distintas especies con distintas sensibilidades.
Agradecimientos
Los autores expresan su agradecimiento a Pablo Vidal por su ayuda durante el muestreo y la preparación de los sedimentos, así como a María José Salamanca, Nuria Fernández, Laura Martín y Natalia Jiménez por la ayuda durante los ensayos de toxicidad. Este estudio se realizó como parte de un proyecto conjunto entre el CEDEX y la Universidad de Cádiz. Parte del trabajo fue financiado por el Ministerio Español de Ciencia y Tecnología (REN2002 01699/TECNO). MC Casado-Martínez agradece la financiación mediante una beca del programa Nacional de Formación de Personal Investigador al Ministerio de Educación y Ciencia. Nuestro agradecimiento a A Luque por sus comentarios durante la preparación del manuscrito final.
Referencias
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