Respuesta inmunomoduladora de la superóxido dismutasa en juveniles de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) expuestos a inmunoestimulantes
Immunomodulatory response of superoxide dismutase in juvenile American white shrimp (Litopenaeus vannamei) exposed to immunostimulants
A.I. Campa-Córdova1, N.Y. Hernández-Saavedra1, G. Aguirre-Guzmán2 y F. Ascencio1*
1 Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste Unidad de Patología Marina La Paz, Baja California Sur, México. * E-mail: ascencio@cibnor.mx
]]> 2 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Universidad Autónoma de Tamaulipas Cd. Victoria, Tamaulipas, México.
Recibido en junio de 2004;
aceptado en junio de 2005.
Resumen
Se estudió la actividad inmunomoduladora de la manganeso superóxido dismutasa (MnSOD) en juveniles de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) expuestos a diferentes inmunoestimulantes. Organismos cuyo peso varió entre 0.7 y 1.0 g fueron inmersos durante 6 h en soluciones de β-glucano, lipopolisacárido (LPS), fucoidán, y Vibrio penaeicida muerto por calor. Se determinó la actividad enzimática de la MnSOD en los organismos para evaluar si los diferentes inmunoestimulantes utilizados eran capaces de inducir actividad antioxidante. Los inmunoestimulantes probados activaron el sistema inmune de los camarones, mostrando un incremento generalizado en la respuesta antioxidante 48 h después del ensayo. El mayor incremento en la actividad de la enzima (3.2 veces superior al grupo control) se registró cuando se utilizó la bacterina. Se expusieron los camarones a V. penaeicida 10 días después de la exposición a los inmunoestimulantes, obteniendo un incremento en la actividad antioxidante de los camarones expuestos previamente a β-glucano, LPS y fucoidán. La respuesta enzimática más alta se obtuvo con los organismos estimulados con β-glucano (2.5 veces superior al control). Este estudio demostró la capacidad de los juveniles de camarón para mejorar la respuesta antioxidante después de ser expuestos a inmunoestimulantes y a una bacteria patógena.
Palabras clave: inmunoestimulantes, Litopenaeus vannamei, SOD, LPS, β-glucano.
Abstract
]]> Immunomodulatory action of manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) in juvenile American white shrimp (Litopenaeus vannamei) was studied. Shrimp between 0.7 and 1.0 g were immersed in aerated β-glucan, lipopolysaccharide (LPS), fucoidan, and heat-killed Vibrio penaeicida solutions for 6 h. The enzymatic activity of Mn-SOD in entire organisms was investigated to evaluate whether different immunostimulants were able to induce antioxidant activity. The immunostimulants tested activated the immune system in juvenile shrimp and the highest antioxidant response was observed 48 h after the challenge with β-glucan, LPS, fucoidan and heat-killed V. penaeicida. The bacterin caused 3.2 times more Mn-SOD activity than the control group. Immunostimulated shrimp were challenged with live V. penaeicida on the tenth day and a second antioxidant response was observed 48 h after exposure to live pathogenic bacteria. Immunostimulated shrimp with β-glucan showed the highest Mn-SOD response (2.5 times more than the control group). This study showed the capacity of juvenile shrimp to enhance antioxidant response during a challenge with pathogenic bacteria after exposure to immunostimulants.Key words: immunostimulants, Litopenaeus vannamei, SOD, LPS, β-glucan.
Introducción
La necesidad de utilizar métodos alternativos para la regulación de bacterias patógenas en los tanques de cultivo ha llevado a los investigadores a utilizar tratamientos con probióticos e inmunoestimulantes (Scholz et al., 1999). Los inmunoestimulantes ayudan al mejoramiento de los mecanismos de defensa no específicos en animales, incluyendo el camarón (Song y Sung, 1990).
Cuando una partícula extraña logra pasar al interior de un organismo y es reconocida por el mismo, esta partícula es fagocitada. Durante el proceso de fagocitosis se producen sustancias oxidantes bactericidas que actúan en contra del intruso, pero estas sustancias denominadas especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden dañar también a las células del hospedero. La eliminación rápida y efectiva de las ROS es esencial para mantener el estado de salud y la supervivencia de los organismos. Por tal motivo, los organismos han desarrollado defensas antioxidantes, incluyendo mecanismos enzimáticos y no enzimáticos. Las defensas enzimáticas antioxidantes incluyen ascorbato peroxidasa, glutatión reductasa, catalasa y peroxidasas, las cuales eliminan eficientemente el peróxido de hidrógeno de las células. Por otro lado, la superóxido dismutasa (SOD) posee la capacidad de dismutar el anión superóxido (Homblad y Söderhäll, 1999) generando como resultado agua y peróxido de hidrógeno. Las superóxido dismutasas se han clasificado dentro de tres grupos mayores, dependiendo del ión metálico que contengan. La Mn-SOD se encuentra en las mitocondrias, la Fe-SOD en bacterias, y la Cu/Zn-SOD en eucariotas. La Cu/Zn-SOD se subdivide en SOD extracelular y citosólica. La SOD extracelular (EC-SOD) coopera en la destrucción de parásitos ingeridos o encapsulados durante la explosión respiratoria generada durante la fagocitosis (Homblad y Söderhäll, 1999).
El sistema antioxidante de los organismos aeróbicos no sólo previene el efecto de las ROS, sino que también es utilizado como un indicador potencial de estrés oxidativo en organismos marinos. Downs et al. (2001) reportaron el papel inmunomodulatorio de la enzima mitocondrial superóxido dismutasa en el camarón Palaemonetes pugio en respuesta a factores ambientales estresantes. El incremento de la actividad respiratoria (Muñoz et al., 2000) y antioxidante en hemocitos inmunoestimulados se debe a cambios en la composición lipídica de su membrana celular que induce la producción de activadores celulares (citocinas o chaperonas), los cuales mejoran su capacidad fagocítica (Itami et al., 1998).
En hemocitos de penaeidos se ha demostrado la activación de la respuesta celular mediante antígenos microbianos de superficie como β-glucanos, lipopolisacáridos (LPS), zymosan (Leonard et al., 1985; Song y Hsieh 1994), péptidoglicanos (Itami et al., 1998) y de bacterias como Vibrio vulnificus y V parahaemolyticus (Sung et al., 1994; Campa-Córdova et al., 2002). La respuesta inmune a los inmunoestimulantes puede variar significativamente, dependiendo de la estructura química del inmunoestimulante o del número de receptores presentes en las membranas celulares del camarón (Bowie y O'Neill, 2000).
Este trabajo reporta el efecto de algunos inmunoestimulantes en la respuesta antioxidante de juveniles de camarón blanco obtenidos de tanques de cultivo. Se pone atención a descubrimientos recientes relacionados con la actividad celular de la SOD (De la Fuente y Victor, 2000; Matsuda et al., 2003), que juega un papel importante como modulador de la respuesta inmune generada por inmunoestimulantes al incrementar o disminuir la actividad de la enzima y las proteínas celulares, ofreciendo potencial protección al hospedero contra agentes patógenos.
]]> Materiales y métodos
Animales experimentales
Se pesaron camarones juveniles de Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) (Pérez-Farfante y Kensley, 1997) entre 0.7 y 1.0 g obtenidos del laboratorio húmedo de cultivo del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR, La Paz, Baja California Sur, México) y se aclimataron durante 15 días antes de los experimentos en tanques de fibra de vidrio de 1500 L conteniendo agua de mar filtrada (0.2 µm), 10 mg L-1 de sal disódica EDTA y aireación constante. El agua de mar filtrada fue mantenida a pH 7.8-8.2, 27°C y 35%o de salinidad. Los camarones fueron alimentados diariamente con alimento comercial.
Inmunoestimulantes
Se utilizaron como inmunoestimulantes β-1,6 glucano extraído de Saccharomyces cerevisiae (Biotec Mackzymal, Tromse, Noruega), lipopolisacárido aislado de Escherichia coli (Sigma, Cat. No. L-2880), fucoidán aislado de Fucus vesiculosus (Sigma, Cat. No. F-5631) y V. penaeicida muerto por calor. Las suspensiones de β-1,6 glucano, lipopolisacárido y fucoidán se mezclaron en 50 L de agua de mar para obtener una concentración final de 0.5 mg mL-1, mL-1 y 10 ng mL-1, respectivamente.
Preparación de la bacteria
La bacteria V. penaeicida (cepa AM-101) fue donada por el Dr. Saulnier del IFREMER, Francia. La cepa se mantuvo en medio LB (Laboratorios DIFCO, Cat. No. 0446-17-3) conteniendo 15% de glicerol a -80°C. Al momento de ser utilizada, la bacteria fue descongelada e incubada en medio LB con 3.5% de NaCl. Los cultivos fueron incubados por 24 h a 30°C, cosechados, suspendidos en agua de mar estéril y, mediante un espectrofotómetro, se les determinó la densidad óptica (540 nm), la cual se ajustó a 1 para obtener una concentración final de 1 x 109 UFC mL-1 (Harzevili et al., 1998). La cepa de Vibrio se sometió a una temperatura de 120°C y 15 lb de presión en autoclave por 20 min.
Para realizar el ensayo con la bacteria, los camarones se mantuvieron 2 h en tanques de cultivo con 50 L de agua de mar filtrada y se agregaron 500 mL de bacteria viva o muerta (1 x 109 UFC mL-1) para obtener una concentración final de 1 x 107 UFC mL-1.
Protocolo experimental
Se utilizaron grupos de 60 organismos mantenidos en contenedores de fibra de vidrio de 200 L. Se sumergieron grupos de camarones durante 6 h en β-glucano (BG-1), fucoidán (FC-1), LPS (LPS-1), o V. penaeicida muerto por calor (VP-1). Se sumergió un grupo control (C-1) en agua de mar libre de inmunoestimulantes, bajo las mismas condiciones de cultivo que los grupos de camarones tratados. Después de la exposición a los inmunoestimulantes, los organismos se colocaron en agua de mar con aireación constante y se alimentaron tres veces al día. Se tomaron tres camarones al azar, por tratamiento, a las 6, 24, 48, 72 y 96 h posteriores al ensayo con los inmunoestimulantes y se almacenaron a -80°C.
]]> Al décimo día del experimento los camarones previamente inmunoestimulados se expusieron a V. penaeicida vivo durante 2 h y posteriormente los organismos se colocaron en tanques con agua de mar filtrada libre de V. penaeicida. Como control positivo (C-2), un grupo de camarones sin previa inmunoestimulación fue expuesto a la bacteria. A las 2, 24 y 48 h posteriores a la exposición a la bacteria patógena, se tomaron tres camarones al azar por tratamiento y se almacenaron a -80°C.Extracción de la SOD
Para el rompimiento celular se colocaron 100 mg de músculo de camarón congelado en un homogenizador mecánico conteniendo 0.5 mL de una solución amortiguadora de fosfatos (50 mM, pH 7.8). El homogenizado obtenido se centrifugó a 5724g por 5 min a 4°C y el sobrenadante recuperado se calentó en baño María durante 5 min a 65°C. Se obtuvo un nuevo sobrenadante centrifugando por segunda ocasión el extracto crudo y se almacenó a -20°C. Las muestras se mantuvieron en hielo durante todo el proceso de extracción.
Actividad de la SOD
La actividad de la SOD se determinó de acuerdo con el método propuesto por Beauchamp y Fridovich (1971), utilizando nitro azul de tetrazolio (NBT) en presencia de riboflavina. Brevemente, se mezclaron 2 mL de la mezcla de reacción (EDTA 0.1 mM, metionina 13 uM, NBT 0.75 mM y riboflavina 20 µM, en solución amortiguadora de fosfatos 50 mM, pH 7.8) y se colocaron de 0 a 100 µL de extracto crudo bajo luz fluorescente por 2 min o hasta que los tubos control alcanzaron una densidad óptica de 0.2 a 0.25 a 560 nm. La actividad específica se calculó en unidades por miligramo de proteína utilizando un programa de computadora (Vázquez-Juárez et al., 1993). Los resultados se expresaron como actividad enzimática relativa (SODA) utilizando el cociente entre la actividad específica de los camarones tratados y la actividad específica de los camarones control.
Proteína
El contenido total de proteína soluble en los extractos crudos se determinó de acuerdo al método descrito por Bradford (1976), utilizando albúmina sérica de bovino (BSA) como estándar. Los resultados se expresaron como contenido relativo de proteína (RPC), dividiendo los valores de proteína (mg mL-1) obtenidos en los tratamientos entre los valores de proteína obtenidos en los grupos control.
Análisis estadísticos
Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Los resultados se estudiaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey para estudiar las diferencias (Statistica). Los valores obtenidos a P < 0.05 se consideraron significativamente diferentes.
]]> Resultados
Actividad de SOD
La exposición de juveniles de camarón blanco a inmunoestimulantes generó un incremento significativo (P < 0.05) en la actividad SODA en los grupos tratados con LPS a las 24 h y en los grupos tratados con β-glucano, LPS o V. penaeicida muerto por calor a las 48 h después de la exposición (fig. 1). Se obtuvo una disminución en la actividad de la enzima entre las 72 y 96 h. La respuesta antioxidante más alta (3.28 veces respecto al grupo control) se obtuvo en los grupos tratados con V. penaeicida muerto por calor a las 48 h después del ensayo (fig. 1).
Al décimo día de iniciado el experimento de inmunoestimulación, los camarones fueron expuestos o no (control negativo) a V. penaeicida vivo y se determinó la actividad antioxidante de la SOD como se muestra en la figura 2. Se obtuvo un incremento de SODA más temprano en los grupos tratados con LPS y en el control positivo (2 h) que en los grupos tratados con β-glucano o fucoidán (48 h). Además, los valores de SODA obtenidos en el control positivo fueron similares a los obtenidos con los grupos tratados con β-glucano (fig. 2).
Los camarones tratados con β-glucano mostraron una respuesta antioxidante más intensa después de la exposición a la bacteria (2.5 veces superior al grupo control, fig. 2) que después de la exposición al inmunoestimulante (dos veces más respecto al grupo control, fig. 1). La actividad SOD de los juveniles tratados con fucoidán no se incrementó significativamente (P > 0.05) durante el primer experimento (fig. 1), pero si se incrementó significativamente (P < 0.05) después de la exposición a la bacteria viva en el segundo experimento (fig. 2).
Proteína soluble
]]> La exposición de los juveniles a los inmunoestimulantes durante 6 h generó un incremento significativo (P < 0.05) en el contenido de RPC a las 24 h después del ensayo (fig. 3). La exposición a β-glucano o fucoidán indujo un incremento significativo (P < 0.05) en RPC de las 24 a las 72 h (fig. 3). Los camarones tratados con β-glucano tuvieron el contenido más alto de RPC a las 72 h (tres veces superior al control) y alcanzaron valores similares al control a las 96 h. Los valores más bajos de RPC se registraron con LPS a las 48 h, y con β-glucano y con la bacterina a las 96 h. Los valores del contenido de proteína más altos registrados con LPS fueron a las 24, 72 y 96 h (fig. 3).
El contenido de proteína en los grupos tratados con β-glucano se incrementaron significativamente (P < 0.05) de 2 a 24 h después de la exposición a la bacteria patógena viva (fig. 4). Se registró una disminución en el contenido de RPC en los grupos tratados con bacterina o fucoidán 2 h después de la exposición a la bacteria patógena (fig. 4). El contenido de RPC en los organismos inmunoestimulados no registró un incremento al menos durante las primeras 48 h después de su exposición al V. penaeicida vivo (fig. 4).
Discusión
Algunos autores han reportado que la administración de inmunoestimulantes vía inmersión mejora la respuesta inmune del camarón (Itami et al., 1998; Alabi et al., 1999). Asimismo, otros trabajos han reportado que los inmunoestimulantes mejoran la supervivencia del camarón (Itami et al., 1989; Sung et al., 1994), pero aún no se ha determinado cuáles componentes del sistema inmune se incrementan.
El incremento de las superóxido dismutasas en respuesta a estrés oxidativo es uno de los principales mecanismos de defensa antioxidante en los organismos aeróbicos. El incremento de los niveles de la Mn-SOD han sido relacionados con la longevidad y la tolerancia a eventos de isquemia o reperfusión, así como a factores inductores de estrés oxidativo (Fridovich, 1995).
]]> La respuesta antioxidante obtenida en los juveniles expuestos a β-glucano (dos veces superior al control, fig. 1), fue similar a la reportada en camarones adultos de L. vannamei (Campa-Córdova et al., 2002) y a la respuesta oxidativa generada en el camarón tigre Penaeus monodon (Song y Hsieh, 1994). En este estudio se obtuvieron incrementos significativos (P < 0.05) en la respuesta antioxidante de juveniles de camarón blanco 48 h después de la exposición a β-glucano, LPS o V. penaeicida muerto por calor (fig. 1), pero los valores de la Mn-SOD fueron diferentes entre tales tratamientos. Los camarones expuestos a V. penaeicida registraron una respuesta antioxidante mayor (3.2 veces superior al grupo control) que los camarones expuestos a β-glucano, LPS o fucoidán. Los receptores transmembranales de invertebrados no sólo detectan la presencia de microorganismos infecciosos, sino que también pueden diferenciar entre distintas clases de patógenos (Bowie y O'Neill, 2000) y presentar una respuesta inmune ante ciertos antígenos, o no presentarla ante otros (Arala-Chaves y Sequeira, 2000). Por lo tanto, la magnitud de la respuesta inmune puede variar con los diferentes antígenos de prueba (Song y Hsieh 1994). Song y Hsieh (1994) compararon el efecto de diferentes inmunoestimulantes en la generación de anión superóxido en hemocitos del camarón tigre P. monodon, encontrando que β-glucano indujo una mayor respuesta oxidativa, seguido por PMA (acetato de forbol miristato) y zymosan (2.5, 2.0 y 1.3 veces superior al grupo control, respectivamente). Henning et al. (1998) reportaron un incremento en el contenido de hemocitos circulantes (THC) 1.53 veces respecto al control en Penaeus japonicus estimulado con peptidoglicano. Muñoz et al. (2000) encontraron diferencias en la actividad fagocítica en hemocitos de L. vannamei después del ensayo con bacterias gram positivas y gram negativas. Namikoshi et al. (2004) reportaron la eficiencia del β-glucano y V. penaeicida muerto por calor contra infecciones experimentales inducidas con el virus de la mancha blanca (WSSV) en P. japonicus. Hou y Chen (2005) inyectaron juveniles de camarón blanco (L. vannamei) con extracto del alga roja Gracilaria tenuistipitata, conocida por su contenido de polisacáridos antitumorales, encontrando un incremento en la respuesta inmune y resistencia a infecciones experimentales con V. alginolyticus.Después de un incremento en la actividad de la Mn-SOD, se registró una disminución de la actividad antioxidante entre las 72 y 96 h (fig. 1). Campa-Córdova et al. (2002) relacionaron la disminución de la actividad enzimática de la SOD en adultos de L. vannamei con el estrés oxidativo ocasionado por activadores del sistema inmune. La exposición de adultos de L. vannamei a algunos inmunoestimulantes como β-glucano o LPS ocasiona una disminución en el contenido de hemocitos circulantes relacionada con la susceptibilidad a patógenos y un incremento posterior con el efecto protector en contra de patógenos potenciales (Lorenzon et al., 1999; Campa-Córdova et al., 2002; Lorenzon et al., 2002).
La SODA más alta se obtuvo al exponer a los juveniles a la bacterina (fig. 1) y la respuesta antioxidante más temprana (2 h) fue obtenida en los controles positivos 2 h después de exponer a los juveniles a la bacteria patógena viva (fig. 2). Esta respuesta enzimática fue similar a la respuesta inmune encontrada en crustáceos y camarones penaeidos (De la Peña et al., 1995). Campa-Córdova et al. (2002) encontraron un incremento rápido y transitorio en la producción de anión superóxido en L. vannamei expuesto durante 1 h a V. parahaemolyticus vivo. Martin et al. (1993) sugirieron que la bacteria viva puede invadir los tejidos del camarón en un periodo corto de exposición.
Los grupos tratados con β-glucano registraron un incremento significativo en el contenido de RPC (fig. 4) durante las primeras 24 h posteriores a la exposición a la bacteria viva, pero el incremento de la actividad de la enzima SOD se registró hasta las 48 h (fig. 2). Aunque la SODA de los grupos tratados con β-glucano no se incrementó durante las primeras 24 h posteriores a la exposición a la bacteria viva (fig. 2), el incremento en RPC podría indicar que otras inmunoproteínas podrían estar actuando en respuesta a la bacteria (fig. 4). De igual manera, se observó que la actividad de la Mn-SOD de los camarones tratados con fucoidán no se incrementó significativamente (P > 0.05), pero los niveles de RPC se incrementaron significativamente (P < 0.05) desde las 24 a las 72 h (figs. 1, 3). Downs et al. (2001) reportaron que el incremento en RPC registrado en el camarón Palaemonetes pugio expuesto a estrés por temperatura se debió al incremento de diferentes inmuno-proteínas.
La determinación de la respuesta antioxidante (Downs et al., 2001; Campa-Córdova et al., 2002) y oxidante (Muñoz et al., 2000; González y Arenas, 2002; Campa-Córdova et al., 2002) podrían utilizarse como herramientas útiles para medir respuesta inmune in vivo e in vitro de organismos en cultivo (vertebrados e invertebrados) expuestos constantemente a condiciones ambientales como temperatura, pH, oxígeno disuelto, salinidad u otros parámetros abióticos, así como a microorganismos patógenos. También es importante diseñar estudios dirigidos a conocer dosis adecuadas de inmunoestimulantes para evitar estrés fisiológico en los organismos de cultivo y con el propósito de mejorar la respuesta inmune de los camarones.
Agradecimientos
Este trabajo fue realizado con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT 28884B), del Sistema de Investigación del Mar de Cortés (SIMAC 980106033) y del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR ABM-11). Agradecemos el apoyo técnico de Viridiana Peraza y María Jesús Romero.
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