Baja diferenciación genética entre poblaciones de sardina, Sardinella aurita, del oriente venezolano

Low genetic differentiation among sardine populations, Sardinella aurita, from eastern Venezuela

Marcos De Donato^1*, Isabel Mimbela de Loroño², Isidra Ramírez³ y Baumar Marín⁴

¹ Laboratorio de Genética Molecular, Departamento de Biomedicina, IIBCA. Universidad de Oriente Cerro del Medio, Cumaná, Venezuela. * E-mail: marcosdedonato@yahoo.com

³ Departamento de Biología Marina, IOV. Universidad de Oriente Cerro del Medio, Cumaná, Venezuela.

⁴ Departamento de Biología Pesquera, IOV Universidad de Oriente Cerro del Medio, Cumaná, Venezuela.

Recibido en febrero de 2005;
aceptado en mayo de 2005.

Resumen

Debido a la gran importancia de Sardinella aurita como recurso pesquero de la región del Caribe, se estudió la diferenciación genética entre las poblaciones de Mochima, Golfo de Cariaco y Morro de Puerto Santo, en el oriente de Venezuela, y se compararon los niveles de variación y subdivisión poblacional con las poblaciones del Mediterráneo y la costa Atlántica de África, anteriormente reportadas. Para esto, se obtuvieron 15 individuos de cada una de tres poblaciones, utilizando una muestra de músculo para extraer el ADN total. Se amplificó un fragmento que incluye la región de control del ADN mitocondrial y se determinaron los patrones de restricción por medio del análisis por RFLP con las enzimas Taq I, Eco RI, Hae III y Alu I. La amplificación de esta región produjo un fragmento de aproximadamente 1000 bp o, rara vez, uno de 1100 pb. El análisis de RFLP demostró la presencia de sólo un haplotipo con las dos variantes de tamaño. El F_ST resultante del análisis de las diferencias entre poblaciones venezolanas fue menor de 0.06 y el AMOVA demostró que no existían diferencias significativas entre ellas. Estos resultados concuerdan con la presencia de poca diferenciación genética entre estas poblaciones, por lo que no se puede descartar la presencia de una población panmíctica en esta región. Una comparación de las poblaciones venezolanas con las poblaciones del Mediterráneo y África, reportadas con anterioridad, produjeron valores de F_ST muy bajos entre las venezolanas y las del Mediterráneo, mientras que las comparaciones entre las de Mauritania, Senegal, Costa de Marfil y Ghana produjeron valores de F_ST diez veces mayores.

Palabras clave: PCR-RFLP, ADN mitocondrial, genética de poblaciones, Clupeidae.

Abstract

In view of the great importance of Sardinella aurita as a fisheries resource in the Caribbean region, we studied the genetic differentiation among the populations from Mochima, Gulf of Cariaco and Morro de Puerto Santo, eastern Venezuela, and compared the levels of variation and population subdivision with populations from the Mediterranean and Atlantic coast of Africa (previously reported). For this, we extracted DNA from 15 muscle samples for each population. A fragment containing the control region of the mitochondrial DNA was amplified and the restriction patterns were determined using restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis with the enzymes Taq I, Eco RI, Hae III and Alu I. The amplification of this region produced a fragment approximately 1000 bp long or, rarely, one of approximately 1100 bp long. No further difference was found through the RFLP analysis. The comparison of the Venezuelan populations produced F_ST values under 0.06 and the analysis of molecular variance showed no significant differences between them. This is an indication of very low genetic differentiation among these populations, so it is not possible to discard the presence of a panmictic population in this region. The comparison of the Venezuelan and Mediterranean populations produced very low F_ST values, while the comparison of the former with African populations from Mauritania, Senegal, Ivory Coast and Ghana produced F_ST values ten times larger.

Key words: PCR-RFLP, mitochondrial DNA, population genetics, Clupeidae.

Introducción

La distribución de Sardinella aurita Valenciennes, se extiende desde Massachusetts, a través del Golfo de México y el Mar Caribe, hasta el sur de Río de Janeiro (Fischer, 1978; Whitehead, 1985), en el continente americano, y desde el Mediterráneo hasta el sur de Angola, en la costa este del Atlántico. La pesca de esta sardina se desarrolla mayormente en la costa oeste del África subsahariana, en el Mediterráneo y en las costas de Venezuela oriental y sur de Brasil, con capturas de más de 480 000 t anuales (FAO, 2002). La pesca tiene particular relevancia en la socioeconomía de las regiones donde se tiene una alta producción, tanto por el beneficio económico que significan los volúmenes de captura, como por representar una fuente muy barata de proteínas para la población (Freon et al., 1997).

Estudios de determinación de la variación genética en especies de sardina, a través del análisis del polimorfismo protéico, han encontrado una muy baja variabilidad poblacional y escasa diferenciación genética (Fujio y Kato, 1979; Hedgecock et al., 1989; Wilson y Alberdi, 1991; Kinsey et al., 1994; Meneses 1994; Chikhi et al., 1998). Esto puede estar afectado en parte por los altos niveles de monomorfismo de las distintas proteínas estudiadas, lo que pudiera disminuir considerablemente la probabilidad de detectar diferenciación genética por esta técnica, especialmente cuando el monomorfismo es producido por selección.

Desde hace mucho se viene argumentando que, en ocasiones, el polimorfismo de alozimas no detecta la variación genética existente entre poblaciones naturales subdivididas. Hoy en día, con la utilización de métodos moleculares más modernos, que son más sensibles al polimorfismo genético (como por ejemplo el ADN mitocondrial), es posible obtener más información de los análisis y de esta forma aumentar la probabilidad de detectar diferencias genéticas entre subpoblaciones divididas y/o especies similares, especialmente si se usan marcadores genéticos neutrales. Por ejemplo, Chikhi et al. (1997) encontraron un nivel de magnitud mayor en la variabilidad genética de poblaciones de S. aurita de las costas Atlánticas de África utilizando análisis de RFLP (Polimorfismo de Longitud por Restricción de Fragmentos) del ADN mitocondrial comparado con lo encontrado para el análisis de alozimas reportado por ellos mismos (Chikhi et al., 1998).

Por su parte Kinsey et al. (1994) encontraron también un bajo nivel de variación alozímica en poblaciones de S. aurita de las costas Atlánticas de Carolina del Sur y Florida y del Golfo de México, lo cual no se correlacionó con la variación morfométrica y merística encontrada. Debido a la gran importancia que tiene la pesquería de este recurso natural para las regiones donde es abundante, se planteó este trabajo con el fin de estudiar la diferenciación genética entre las poblaciones de S. aurita del oriente de Venezuela y comparar los niveles de variación y subdivisión poblacional con las poblaciones del Mediterráneo y las costas Atlánticas de África.

Materiales y métodos

Se obtuvieron un total de 45 muestras de S. aurita, directamente de los pescadores y justo después de su captura, provenientes de tres áreas (fig. 1): Tocuchare (Golfo de Cariaco), Santa Fe (Parque Nacional Mochima) y Morro de Puerto Santo. De cada sardina se tomó una muestra de músculo blanco de 100 a 200 mg, aproximadamente, con navajas estériles. El ADN fue extraído usando el kit de extracción de ADN Wizard Genomic (Promega Corp., Madison, WI, USA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante, con modificaciones menores. En síntesis, el tejido fue homogeneizado con 600 µL de lisante de núcleos-EDTA, añadiendo Proteinasa K (250 µg mL^-1, Boehringer Mannheim, IN, USA) e incubado por 3 h a 55°C. Se añadieron 200 µL de solución precipitante de proteínas y se agitó por 20 s. El precipitado de proteínas fue eliminado por centrifugación y el ADN precipitado con isopropanol. El ADN fue luego lavado con etanol al 70%, secado y resuspendido con buffer Tris-EDTA. El ADN total fue corrido electroforéticamente en un gel de agarosa al 1% y diluido a una concentración de aproximadamente 50 a 100 ng µL^-1.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue llevada a cabo para amplificar un segmento variable de la región de control (el asa D o D-loop en inglés) del ADN mitocondrial, usando los oligonucleótidos siguientes como iniciadores (Chikhi et al., 1997):

HN20: 5'-GTG TTA TGC TTT AGT TAA GC-3'

LN20: 5'-ACC ACT AGCACC CAA AGC TA-3'

La amplificación se realizó en un volumen de 100 µL usando 2 µL de ADN diluido (alrededor de 100 ng), 1 U de Taq polimerasa (Promega Corp., Madison, WI, USA), buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 0.1% (v/v) Triton X-100), 200 nM de cada primer, 200 µM de cada desoxirribonu-cleótido (dNTP), 1.5 mM de MgCl2. Para el protocolo de amplificación se realizó una desnaturalización del ADN a 94°C por 5 min, seguido de 35 ciclos de los pasos de desnaturalización, apareamiento de los iniciadores y síntesis del ADN a 94°C por 45 s, 50°C por 60 s y 72°C por 60 s, respectivamente. Se realizó un paso de extensión final a 72°C por 10 min. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis usando un gel de agarosa al 2% y se visualizaron con bromuro de etidio (0.1µg µL^-1) bajo un transiluminador. Los tamaños de los fragmentos fueron estimados comparándolos con los tamaños de los fragmentos del patrón de peso molecular de 100 pares de bases (Promega Corp., Madison, WI, USA).

Los productos amplificados fueron precipitados usando 100 µL de isopropanol, lavados con etanol al 70%, secados y resuspendidos en agua desionizada estéril. Éstos fueron luego digeridos con las enzimas de restricción Taq I, Eco RI, Hae III y Alu I, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega Corp., Madison, WI, USA), con el fin de producir los patrones del Polimorfismo de Longitud por Restricción de Fragmentos (RFLP). Las enzimas se incubaron con el ADN amplificado a 37°C para todos los casos, excepto para Taq I que trabaja en forma óptima a los 65°C, durante 4 h. Los patrones de restricción fueron generados al correr los fragmentos resultantes en geles de agarosa al 3%, visualizados con bromuro de etidio (0.1 µg µL^-1), bajo un transiluminador, y los tamaños de las bandas fueron estimados comparándolas con el patrón de peso molecular de 100 pb. Los patrones de digestión y los haplotipos fueron designados según los descritos por Chikhi et al. (1997), con el fin de facilitar la comparación.

Resultados y discusión

La amplificación de las muestras produjo dos tipos de fragmentos, uno con un tamaño de aproximadamente 1000 pb y otro de aproximadamente 1100 pb (fig. 2, tabla 1). Los patrones de restricción encontrados fueron iguales para todas las muestras, con excepción de la presencia de un segmento de 100 pb en alguna de las bandas para los fragmentos de 1100 pb. Así, la enzima Taq I cortó al fragmento amplificado en tres sitios distintos, produciendo dos fragmentos de 320 pb, además de fragmentos de 260 y 100 pb; mientras que las enzimas Eco RI, Hae III y Alu I cortaron el fragmento en un sitio. El fragmento mayor se observó en menor proporción que el de 1000 pb, siendo más frecuente para la población de sardinas del Morro de Puerto Santo, que para las muestras de las otras poblaciones (tabla 2).

La comparación de las poblaciones venezolanas con las estudiadas por Chicki et al. (1997) produjo valores de FST muy bajos entre las poblaciones venezolanas y las de Francia y Argelia (Mediterráneo), mientras que las comparaciones con las poblaciones de Mauritania, Senegal, Costa de Marfil y Ghana produjeron valores de FST con un orden de magnitud mayor (tabla 4). Esto implica que las poblaciones del Mediterráneo son genéticamente más similares a las de Venezuela que las de las costas de África subsahariana, sugiriendo un proceso de especiación que debe estar operando para separar las poblaciones africanas del resto. Además, la similitud observada entre las poblaciones de Venezuela y el Mediterráneo sugiere la presencia de un flujo de genes importante, pero que tendría que pasar por las Islas Azores y el norte de Estados Unidos y el Caribe. Una explicación alternativa podría ser que el fragmento amplificado y el sistema de enzimas utilizado no es capaz de revelar las diferencias genéticas que existen entre las poblaciones de Venezuela y el Mediterráneo. Con el fin de continuar el estudio de la dinámica de los procesos genéticos entre estas poblaciones, nuestro grupo adelanta investigaciones en las que se comparan secuencias del fragmento de la región de control del ADN mitocondrial y de genes nucleares de las poblaciones de Venezuela, el Mediterráneo y África.

Nuestros análisis de RFLP mitocondriales no concuerdan con los reportados por Chicki et al. (1998), quienes estudiaron las poblaciones de S. aurita de Venezuela (Isla de Margarita), Costa de Marfil, Ghana y Congo, por medio de electroforesis de proteínas. Estos investigadores reportaron una muy baja variabilidad genética (diversidad alozímica, H = 0.011) a pesar de la gran extensión geográfica existente entre las muestras analizadas, donde se observa que 3 de 25 loci fueron polimórficos. Aquí, el valor medio de FST fue de 0.006; es decir, no encontraron diferencias genéticas significativas entre las poblaciones de Venezuela y Costa de Marfil, Ghana y Congo, mientras que nuestra comparación produjo un valor promedio de FST = 0.576 entre las poblaciones de Venezuela y africanas. Por otro lado, en ese estudio, los valores medios de FST entre las poblaciones africanas mostraron un promedio de 0.003, mientras que en el estudio del mismo grupo (Chicki et al., 1997) en el que utilizaron ADN mitocondrial para caracterizar las poblaciones de Mauritania, Senegal, Costa de Marfil y Ghana, éstos promediaron 0.050 (más de 10 veces mayor).

Con anterioridad se han reportado bajos niveles de diferenciación genética, usando electroforesis de proteínas, entre grupos de sardina de S. aurita provenientes de lugares distantes entre sí. Kinsey et al. (1994) estudiaron poblaciones de la costa de Carolina del Sur y las costas Atlántica y del Golfo de México de Florida, encontrando muy baja variabilidad de alozimas y ninguna diferenciación entre poblaciones. Por el contrario, el estudio morfométrico y merístico demostró diferencias importantes entre las poblaciones provenientes de bahías y las de mar abierto, con una alta correlación entre los parámetros cuantitativos con el hábitat del pez. Asimismo, Bowen y Grant (1997), estudiando las relaciones filogeográficas entre las sardinas del género Sardinops por medio de la secuencia de la región de control del ADN mitocondrial, encontraron una fuerte estructura geográfica pero sólo una moderada diferenciación genética inter e intraespecífica. Este mismo grupo ya había reportado una muy baja diferenciación genética por medio del análisis alozímico (Grant y Leslie, 1996), de forma similar a lo discutido anteriormente.

De esta manera se puede inferir de la comparación entre los estudios alozímicos y de ADN mitocondrial reportados por este estudio y Chikhi et al. (1997, 1998) para esta especie, que el análisis alozímico no ha mostrado ser adecuado para estudiar la variabilidad y diferenciación genética entre poblaciones, ya que ésta tiende a ser muy baja, producto del bajo grado de polimorfismo electroforético que presentan las proteínas estudiadas. Adicionalmente, debido a que los patrones electroforéticos de las proteínas resultan de cambios en la secuencia de sus aminoácidos, éstos pueden estar influenciados por fuerzas biológicas, como la selección natural sobre loci específicos, que podrían no reflejar los patrones de diferenciación genética de todo el genoma.

Los datos aquí reportados son congruentes con la hipótesis de que las poblaciones de sardina del oriente de Venezuela deben ser manejadas como una sola, desde el punto de vista pesquero, dado que no es posible descartar la presencia de una población panmíctica. Es por lo tanto importante que se establezcan regulaciones regionales que tomen en cuenta este hecho a modo de velar por la preservación de este importante recurso pesquero. Por otra parte, los resultados encontrados de la comparación entre las poblaciones venezolanas y africanas no soportan la idea de que estos dos stocks tengan que ser manejados de manera conjunta, ya que parece no existir flujo importante de genes entre ellos.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente, Venezuela, bajo el proyecto número CI-5-1001-0899/99, y por el FONACIT, Venezuela, bajo el proyecto número S1-2000000823. Los autores quieren expresar su agradecimiento a María Alejandra Balza y Ana Rosa Albornoz, por la colaboración prestada para la realización de esta investigación.

Referencias

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