Influencia de la salinidad sobre crecimiento y composición bioquímica de la cianobacteria Synechococcus sp.
Influence of salinity on the growth and biochemical composition of the cyanobacterium Synechococcus sp.
Néstor Rosales, José Ortega, Roberta Mora y Ever Morales*
* Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias, La Universidad del Zulia, Bloque A-1, Grano de Oro, Av. Universidad Apartado 526 Maracaibo, Venezuela. * E-mail: everm@iamnet.com
]]>Recibido en septiembre de 2004;
aceptado en diciembre de 2004.
Resumen
El estudio de cianobacterias aisladas de ambientes hipersalinos es de interés debido a su versatilidad metabólica y ecofisiológica para adaptarse a condiciones extremas de salinidad, temperatura, irradiancia y limitación de nutrientes. Se reporta el efecto de la salinidad a 0%o, 35%o, 70%o y 100%o sobre el crecimiento, masa seca y producción de pigmentos, proteínas, carbohidratos y lípidos de la cianobacteria Synechococcus sp. Los bioensayos fueron mantenidos con medio ALGAL equivalente a 8 mM NaNO3, aireación constante, fotoperiodo 12:12 h, 28 ± 2°C y 156 µmol quanta m-2 s-1 de irradiancia. La cianobacteria fue capaz de crecer bajo todas las salinidades probadas. La densidad celular fue mejorada a 35%o, con 607.64 ± 14.35 cél mL-1. A 100%o se alcanzaron los máximos valores de masa seca, clorofila a, β-caroteno, zeaxantina, proteínas y carbohidratos con 3.87 ± 0.03 ng cél-1; 41.86 ± 0.39 fg cél-1; 9.03 ± 0.15 fg cél-1; 9.74 ± 0.24 fg cél-1; 1.95 ± 0.05 y 1.80 ± 0.05 pg cél-1, respectivamente. Sin embargo, el mayor contenido de lípidos fue alcanzado a 0%o con 0.45 ± 0.04 pg cél-1. Esta cepa halotolerante de la cianobacteria Synechococcus muestra capacidad para modular la producción de biomasa enriquecida con pigmentos, proteínas, carbohidratos y lípidos en función de la salinidad.
Palabras clave: cianobacteria, crecimiento, HPLC, nutrientes, nitrato, pigmentos, exopolisacáridos, salinidad, Synechococcus.
Abstract
The study of cyanobacteria isolated from hypersaline environments is of interest because of their metabolic and ecophysiologic versatility in adapting to extreme conditions of salinity, temperature, irradiance and nutrient availability. The effect of salinity at 0%o, 35%o, 70%o and 100%o on the growth, dry weight, and pigment, protein, carbohydrate and lipid production of the cyanobacterium Synechococcus sp. was determined. Bioassays were kept in ALGAL medium equivalent to 8mM NaNO3, constant aeration, 12:12 h photoperiod, 28 ± 2°C and 156 µmol quanta m-2 s-1 of irradiance. The cyanobacterium was able to grow under all salinities tested. Cell density was optimized at 35%o, with 607.64 ± 14.35 cells mL-1. The highest values of dry weight (3.87 ± 0.03 ng cell-1), chlorophyll a (41.86 ± 0.39 fg cell-1), P-carotene (9.03 ± 0.15 fg cell-1), zeaxanthin (9.74 ± 0.24 fg cell-1), proteins (1.95 ± 0.05 pg cell-1) and carbohydrates (1.80 ± 0.05 pg cell-1) were obtained at 100%o; however, the highest lipid content (0.45 ± 0.04 pg cell-1) was reached at 0%o. This Synechococcus strain shows halotolerance and the capacity to modulate the production of enriched biomass with pigments, proteins, carbohydrates and lipids in terms of salinity.
]]> Key words: cyanobacterium, growth, HPLC, nutrients, nitrate, pigments, exopolysaccharides, salinity, Synechococcus.
Introducción
Las cianobacterias son un grupo de microorganismos fotosintéticos con características fisiológicas y morfológicas específicas que les permiten adaptarse a cambios ambientales (Tandeau De Marsac y Houmard, 1993; Liotenberg et al., 1996). Algunas especies son capaces de sobrevivir bajo condiciones ambientales extremas, como en desiertos, aguas termales y lagos alcalinos (Morvan et al., 1997; Oren, 2000).
Las cianobacterias han sido descritas como fuentes útiles de clorofilas, carotenoides, ficobiliproteínas, exopolisacáridos, proteínas y otros metabolitos biológicamente activos (Borowitzka, 1995; Ventosa y Nieto, 1995; Lagarde et al., 2000). Este potencial biotecnológico parece incrementarse en cepas que pueden tolerar condiciones extremas de salinidad para evitar parcialmente la competencia de otros organismos menos tolerantes. Así, los organismos halotolerantes son candidatos muy atractivos para su cultivo en masa en ambientes hipersalinos o áridos con gran radiación solar, que no serían utilizables para algún otro tipo de cultivo (Ben-Amotz y Avron, 1983; Rodríguez, 1992).
El crecimiento de cianobacterias en ambientes acuáticos está controlado por una variedad de factores ambientales y, para su cultivo, son necesarias condiciones adecuadas de nutrientes, temperatura, pH e iluminación (Abalde et al., 1995; Kebede y Ahlgren, 1996). El conocimiento de sus características fisiológicas y bioquímicas en cultivos de laboratorio, en un amplio rango de parámetros, puede ayudar no sólo a determinar su potencial biotecnológico sino también a determinar e interpretar de manera más eficiente los resultados adquiridos del crecimiento de estos microorganismos en su ambiente natural.
Es de interés la evaluación de la posible capacidad halotolerante o el comportamiento halofílico en cianobacterias aisladas de ambientes marinos. Por ejemplo, las cianobacterias capaces de crecer tanto en medios salinos como no salinos, muestran una mayor probabilidad de colonizar diversos ambientes acuáticos, comparados con aquellos que son estrictamente de aguas dulces o halófilos.
El objetivo de este trabajo fue evaluar el crecimiento, masa seca y producción de pigmentos, proteínas, carbohidratos y lípidos de una cepa de Synechococcus, aislada de un ambiente hipersalino a diferentes salinidades en condiciones de laboratorio.
Materiales y métodos
]]> Material biológicoLa cianobacteria marina Synechococcus sp. (Komárek y Anagnostidis, 1999) fue aislada del pozo de agua Salina Rica, ubicado en las coordenadas geográficas 10°47' N y 71°38' O al norte de la ciudad de Maracaibo, Venezuela. Dicho cuerpo de agua se caracteriza por ser hipersalino, de muy baja profundidad y por ser utilizado para la recolección de sal en época de sequía. Esta cepa de Synechococcus se presenta en células solitarias ovales o cilíndricas, con 3.57 ± 0.12 Lim de largo y 1.47 ± 0.09 µm de ancho, o formando tricomas de hasta 10 células.
Condiciones de cultivo
Los cultivos por triplicado se realizaron en frascos de 350 mL, con 150 mL de medio de cultivo ALGAL, a una concentración de nitrato de 8 mM (Fábregas et al., 1984). Los frascos fueron inoculados a una densidad celular de 15 x 106 cél mL-1, equivalente a una absorbancia de 0.08 a 750 nm, y mantenidos a 29 ± 2°C, con aireación constante de 5 mL s-1, fotoperiodo luz/oscuridad 12:12 h y 156 µmol quanta m-2 s-1 de irradiancia con lámparas fluorescentes.
Los cultivos no salinos fueron llevados a cabo con agua destilada y los cultivos salinos con agua de mar, a los cuales se les ajustó la salinidad con agua destilada o NaCl (Baker) a las salinidades probadas de 0%o, 35%%, 70%o y 100%%.
Los cultivos se mantuvieron durante 24 días, utilizando como inóculo células crecidas a 35% y sin adaptación previa al resto de las salinidades. La toma de muestras se realizó el día 12 de cultivo para los tratamientos de 0-70% y a los días 12 y 21 para el tratamiento de 100%, durante la fase estacionaria.
Análisis de la biomasa
La densidad celular fue determinada por recuento en microscopio, usando un hematocitómetro Neübauer. La biomasa fue cosechada por centrifugación a 18 x 103 g por 15 min. La biomasa congelada, almacenada a -20°C, fue usada para todos los análisis bioquímicos, excepto para el contenido de pigmentos, donde se utilizó biomasa fresca. La masa seca fue determinada utilizando un sistema de filtración Millipore©, con filtros de fibra de vidrio de 0.45 Lm de poro, por el método de Utting (1985).
Análisis bioquímico
El contenido de proteína fue determinado por el método de Lowry-Folin (Lowry et al., 1951) modificado por Herbert et al. (1971). Los pigmentos fueron determinados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) usando el método descrito por Vidussi et al. (1996). Se utilizó para ello una columna Agilent Hypersil MOS (4.6 x 100 mm, 5 Lim de tamaño de partícula), con estándares para la calibración y cuantificación de los pigmentos (clorofila a y β-caroteno de Sigma; zeaxantina de DHI Water & Environment). El solvente utilizado fue una mezcla de metanol (A) y acetato de amonio al 75% (B), con una elusión por gradiente con la siguiente relación: min 1, 50% de A y 50% de B; min 15, 100% de B; min 18, 100% de B; y min 19, 75% de A y 25% de B.
]]> Los carbohidratos fueron medidos por el método de fenol-ácido sulfúrico (Kochert, 1978). El contenido de lípidos fue determinado por el método de carbonización simple (Marsh y Weinstein, 1966) luego de una extracción lipídica (Bligh y Dyer, 1959).Análisis estadístico
Los análisis estadísticos fueron llevados a cabo con el programa SPSS para Windows versión 11.0, usando un análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Sheffé para examinar las diferencias entre los tratamientos.
Resultados y discusión
La cepa de Synechococcus creció a todas las salinidades evaluadas, aún en medio no salino (fig. 1). En fase estacionaria, la mayor densidad celular de 607.64 ± 14.35 x 106 cél mL-1 se obtuvo a 35%, y la menor a 100% con 192.7 ± 13.58 x 106 cél mL-1 con diferencias significativas (P < 0.05); aunque, la fase estacionaria de estos cultivos fue más larga (fig. 1). Estos resultados muestran que el crecimiento de la cianobacteria en función de la salinidad, sigue este orden: 35% > 70% > 0% > 100‰.
Aunque esta cepa de cianobacteria, aislada de un pozo hipersalino, ha sido mantenida a 35% y sin exposición previa a un ambiente no salino, alcanzó una densidad celular de 411.84 ± 9.39 x 106 cél mL-1 en agua dulce; lo cual representa el 67.6% de la salinidad óptima de 35%. Por otro lado, los tratamientos de 0% y 70% no mostraron una fase de adaptación, mientras que el tratamiento de 100% no mostró una fase logarítmica bien diferenciada, alcanzando la fase estacionaria el día 12 de cultivo. El resto de los tratamiento iniciaron su fase estacionaria el día 9 de cultivo (fig. 1).
El hecho de que Synechococcus sp. muestre un excelente crecimiento en agua dulce sugiere una alta eficiencia para colonizar ambientes no salinos. Sin embargo, el que alcance una máxima producción de biomasa en un ambiente marino puede ser un indicador de un requerimiento de las sales inherentes al agua de mar.
]]> El amplio rango de salinidad bajo el cual puede crecer esta cepa puede estar relacionado con la variación de salinidad en su hábitat, de acuerdo a las estaciones seca y húmeda. Por ejemplo, 16 aislados de la cianobacteria Nodularia, aisladas de algunos lagos de la Columbia Británica, crecieron entre 1% y 60% de salinidad con un máximo en 5-10%; sugiriendo que ellas están restringidas a lagos salobres con cambios extremos de salinidad, de acuerdo a la estación (Nordin y Stein, 1980). En Aphanothece sp. se ha descrito una rápida adaptación a la salinidad entre 34% y 174% debido a su capacidad halotole-rante (Berland et al., 1989).La mayor masa seca fue obtenida en los cultivos a 100% y con diferencias significativas (P < 0.05; fig. 2). El efecto de elevadas salinidades sobre la masa seca se ha reportado en Synechococcus sp., aislada de las salinas de Araya, Venezuela; con un incremento del volumen celular y disminución de la tasa de crecimiento con una concentración de NaCl de hasta 175% (Díaz y Reyes, 1990, 1992).
De igual forma, un incremento en la salinidad produce una disminución en la tasa de crecimiento hasta 0.25 d-1 para 100%, lo cual corresponde a una reducción del 50% en relación con la tasa de crecimiento máxima alcanzada a 35% (fig. 2). Así, bajo estas condiciones, las células tienden a poseer un mayor tamaño y una mayor producción y acumulación de metabolitos, aunque no son capaces de crecer tan rápido (Rosales et al., 2004).
La salinidad a 100% también produjo los mayores contenidos de pigmentos con 41.9 ± 0.39, 9.0 ± 0.15 y 9.7 ± 0.24 fg cél-1 para clorofila a, β-caroteno y zeaxantina, respectivamente, y con diferencias significativas (P < 0.05), en relación con las otras salinidades (fig. 3). El aumento de la síntesis de carotenoides a esta salinidad, reflejada en la relación clorofila a/carotenoides, disminuyó de 3.74 a 2.20 entre 0% y 100‰.
Los mayores valores de proteínas y carbohidratos se produjeron a 100% con 2.0 ± 0.05 y 1.8 ± 0.05 pg cél-1 (fig. 4), lo que sugiere un cambio metabólico en las células cuando se cultivan a altas salinidades. El aumento de la salinidad de 29% a 117% en Cyanothece 16Som2, reduce la producción de proteínas y carbohidratos (De Philippis et al., 1993). Sin embargo, en Aphanothece sp. el aumento de la salinidad produce un aumento de la producción proteica, tanto celular como por volumen de cultivo (Berland et al., 1989).
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Es posible que esta cepa de Synechococcus estimule la síntesis de carbohidratos y proteínas relacionadas con la osmorregulación a altas salinidades (Galindo, 1985). De igual forma, se ha registrado la excreción de polisacáridos bajo condiciones desfavorables de nutrientes y bajo altas condiciones de salinidad e iluminación (Brüll et al., 2000).
Los lípidos mostraron una clara tendencia a disminuir con la salinidad, alcanzando los valores máximos a 0% con 0.5 ± 0.04 pg cél-1, siendo casi el doble de lo obtenido a 100% (fig. 4). Estudios previos en cianobacterias como Scytonema geitleri muestran una disminución de la producción de lípidos al aumentar la salinidad (Singh et al., 2002). Existen muchos reportes que sugieren que los lípidos están relacionados con la protección contra altas salinidades (Hufleijt et al., 1990; Ritter y Yopp, 1993). La exposición a altas concentraciones salinas produce una disminución de los lípidos y un aumento en la relación ácidos grasos desaturados:saturados (Tasaka et al., 1996; Allakhverdiev et al., 2001).
En muchas otras cianobacterias se han reportado resultados similares a los hallados con esta cepa de Synechococcus, entre ellas Microcoleus (López y Tovar, 1992), Synechocystis (Zuther et al., 1998), Aphanothece (Berland et al., 1989), otras cepas de Synechococcus (Díaz y Reyes, 1990, 1992; Roux, 1996), Spirulina (Vonshak et al., 1996), Nostoc (Blumwald y Tel-Or, 1984) y Cyanothece (De Philippis et al., 1993).
Estos resultados sugieren que el crecimiento y el contenido de metabolitos de Synechococcus sp. está determinado por la salinidad, con lo cual se ha demostrado su capacidad haloto-lerante entre 0% y 100% y con una salinidad óptima de crecimiento de 35%. Por otro lado, esta cepa exhibe competencia fisiológica en medio hipersalino debido a su capacidad de alcanzar los mayores contenidos celulares de clorofila a, carotenoides, proteína y carbohidratos a 100% y en condiciones de suficiencia de nutrientes.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por FONACIT, Venezuela, a través del proyecto # S1-2000000786.
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