Niveles plasmáticos de hormona luteinizante en machos de lubina (Dicentrarchus labrax L.) alimentados con dietas con distinta composición en ácidos grasos

Luteinizing hormone plasma levels in male European sea bass (Dicentrarchus labrax L.) feeding diets with different fatty acid composition

José María Navas¹*, Evaristo Mañanós², Jesús Ramos², Silvia Zanuy², Manuel Carrillo²

¹ INIA, Departamento de Medio Ambiente A6 Km. 7, 28040, Madrid, España

Recibido en abril de 2003;
aceptado en febrero de 2004.

Resumen

Se estudió el efecto de la composición en ácidos grasos de la dieta sobre los niveles plasmáticos de hormona luteinizante (LH) y sobre el porcentaje de machos espermiantes de lubina (Dicentrarchus labrax L.) en el ciclo reproductor. El grupo control recibió una dieta natural (boga, Boops boops L., troceada). Otros dos grupos recibieron pienso con 10% o 22% de lípidos (grupos 10% y 22% respectivamente). El pienso con 22% de lípidos se obtuvo sumergiendo el de 10% en un aceite refinado de pescado rico en ácidos grasos de la serie n-3. El grupo control mostró los porcentajes más altos de machos espermiantes, con valores cercanos a 100% entre diciembre y marzo. Este signo de elevada eficacia reproductora estuvo asociado con los valores más altos de LH, que aumentaron desde noviembre hasta febrero. En el grupo alimentado con 10% de lípidos el porcentaje de machos espermiantes fue mayor de 75% sólo entre enero y marzo. En este grupo, los niveles plasmáticos de LH se mantuvieron bajos a lo largo de toda la estación reproductora, siendo en febrero significativamente más bajos que los observados en el grupo control. El grupo alimentado con 22% mostró en general porcentajes de machos espermiantes menores a los observados en el grupo control, pero mayores a los del grupo de 10%. En el grupo 22%, los niveles plasmáticos de LH fueron significativamente más bajos que en el grupo control en diciembre. Las diferencias observadas en las concentraciones plasmáticas de LH entre grupos no están claramente asociadas con diferencias en la composición de ácidos grasos de la dieta, lo que sugiere que en los machos de lubina los ácidos grasos de la dieta tienen una influencia más moderada sobre la producción y liberación de LH que en las hembras.

Palabras clave: hormona luteinizante, gonadotropina, lubina, ácido graso.

Abstract

Key words: luteinizing hormone, gonadotropin, sea bass, fatty acid.

Introducción

En muchas especies de teleósteos se han descrito los ciclos estacionales de actividad gonadal. La asociación de los cambios en el desarrollo gonadal con los niveles plasmáticos de esteroides gonadales y de gonadotropinas ha demostrado ser una herramienta muy valiosa para el estudio del control endocrino de la reproducción en teleósteos. Diversas revisiones han puesto de relieve la extraordinaria importancia de las gonadotropinas en la regulación de los procesos reproductores (Swanson, 1991; Nagahama, 1994; Kah et al., 1997). Durante muchos años se pensó que la hipófisis de los peces contenía un único tipo de gonadotropina, denominada gonadotropina maduracional, la cual regularía todo el proceso de la reproducción (Burzawa-Gerard, 1982). Al final de los años ochenta varios trabajos realizados en salmónidos parecían indicar la presencia de dos gonadotropinas diferentes (Suzuki et al., 1988a, 1988b). La hormona folículo estimulante (FSH, previamente denominada GTH I, Quérat, 1994) se libera durante el periodo de crecimiento gonadal y estimula la producción folicular de 17β-estradiol (E2) y testosterona (T) (Prat et al., 1996; Nagahama, 1994). Por su parte, la LH (antes denominada GTH II, Quérat, 1994) regula el final de la maduración gonadal, la ovulación y la espermiación. La falta de inmunoensayos para determinar los niveles de FSH ha hecho que la información sobre las variaciones estacionales de las concentraciones plasmáticas de esta hormona estén limitadas a los salmónidos.

Un ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) para LH desarrollado para especies de moronidae (Mañanós et al., 1997) permitió describir las modificaciones experimentadas por la concentración plasmática de LH a lo largo del ciclo reproductor en las hembras de lubina (Dicentrarchus labrax L.) (Navas et al., 1998). En las hembras, los niveles plasmáticos de LH aumentaron a lo largo del periodo de puesta y alcanzaron un máximo en el punto medio de este periodo de puesta. Estas observaciones sugieren que la LH juega un papel fundamental en el control de la ovulación en la lubina. Además, también se estudió la influencia de la composición en ácidos grasos de las dietas administrados a los reproductores de lubina sobre las concentraciones plasmáticas de E2 y LH (Navas et al., 1998). Las hembras alimentadas con dietas artificiales mostraron niveles plasmáticos de E2 y LH mayores que los de las hembras alimentadas con boga (Boops boops L.) troceada. Estos resultados indicaron que la composición en ácidos grasos de la dieta puede influir sobre los niveles plasmáticos de E2. También se observó una relación directa entre las concentraciones plasmáticas de E2 y de LH, lo que se atribuyó a una retroalimentación positiva causada por el E2 sobre la producción y liberación de LH en la hipófisis.

Varios trabajos han mostrado la influencia de la composición en ácidos grasos de la dieta sobre la eficacia reproductora de las hembras de lubina. Se ha observado que la composición en ácidos grasos de la dieta afecta a la composición en ácidos grasos de los huevos y, con ello, a su calidad. Los ácidos grasos de la serie n-3, en particular el docosahexaenoico (DHA, 22:6 n-3) y el eicosapentaenoico (EPA, 20:5 n-3), parecen tener una profunda influencia sobre la calidad de los huevos (Thrush et al., 1993; Bell et al., 1997; Navas et al., 1997; Bruce et al., 1999). En los machos se ha observado que la alimentación con dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) aumenta la capacidad reproductiva mediante un aumento del volumen de esperma y de la movilidad de los espermatozoides (Asturiano et al., 2001). Sin embargo no se han realizado estudios sobre el efecto de la nutrición en la regulación hormonal de la reproducción en machos.

El objetivo de este trabajo fue determinar si variaciones en la composición en ácidos grasos de las dietas administradas a lubinas en edad reproductora afecta a las concentraciones plasmáticas de LH a lo largo del ciclo reproductor de los machos y comparar los efectos que se observaran con los que se describieron previamente para hembras (Navas et al., 1998).

Material y métodos

En el experimento se utilizaron noventa lubinas de 5 años de edad (1327.1 ± 39.8 g y 46.2 ± 0.4 cm) que habían sido criadas en el Instituto de Acuicultura de Torre de la Sal (costa este de España, 40°N 0°). Las lubinas se mantuvieron en tanques rectangulares de 4 x 2 x 1.5 m³ con 8000 L de agua marina (37.8%o de salinidad) en flujo continuo, bajo condiciones naturales de fotoperiodo y temperatura. Todos los peces recibieron diariamente una ración correspondiente a 0.7% de su peso corporal entre diciembre y marzo (periodo de puesta), y una ración de 1.8% de su peso corporal entre julio y septiembre (periodo de reposo reproductor). El experimento comenzó en abril (periodo de post-puesta) y duró 14 meses, para cubrir completamente un ciclo reproductor anual.

Los peces se dividieron en tres grupos de 20 a 26 peces con una proporción machos:hembras de 3:2. Igual que en experimentos anteriores (Bell et al., 1996; Cerdá et al., 1994; Navas et al., 1998), uno de los grupos se alimentó con boga troceada y sirvió como control. Los otros grupos se alimentaron con dietas formuladas que contenían distintas cantidades de lípidos (tabla 1). Así, un grupo se alimentó con una dieta comercial para lubina que contenía un 10% de lípidos (Fulmar, Scotland); y el otro se alimentó con la misma dieta comercial, pero los granos de pienso fueron sumergidos en un aceite refinado de pescado (Super Selco, Artemia Systems, Bélgica) con una concentración elevada de PUFA de la serie n-3, particularmente 22:6 n-3. De ese modo la cantidad total de lípidos en el pienso que recibió este otro grupo se elevó hasta un 22%.

La composición de la dieta comercial de Fulmar aparece en la tabla 1. La composición en ácidos grasos de los lípidos de la dieta aparece en la tabla 2. Los lípidos totales se extrajeron utilizando el método de Folch et al. (1957) y se determinaron por gravimetría. La derivatización de los lípidos totales a ésteres de metilo se llevó a cabo tratando 250 mg de los lípidos extraídos con ácido sulfúrico al 1% en methanol y tolueno (2:1 v:v) a 40°C durante 16 h (Christie, 1982). Los ésteres se purificaron por cromatografía en capa fina y, finalmente, se llevó a cabo el análisis de ácidos grasos utilizando un cromatógrafo de gases Packard 436 tal y como detallan Tocher et al. (1985).

Muestreos

A lo largo del experimento se llevaron a cabo muestreos mensuales anestesiando los peces con metanosulfonato de 3-(etoxicarbonil) anilina (metanosulfonato de 3-aminobenzoato de etilo) (MS-222) a una concetración de 0.1 g L^-1, tras un día de ayuno. En los machos, después de limpiar el área genital con agua fresca, se determinó la presencia de esperma mediante un ligero masaje abdominal. Se extrajo sangre de los vasos caudales mediante una jeringa heparinizada, siempre en el mismo momento del día (entre las 10 y las 14 horas). A partir de la sangre se obtuvo plasma por centrifugación (1500 g durante 30 minutos a 4°C), el cual fue alicuotado y guardado a -20°C hasta su análisis.

Los huevos de las lubinas son pelágicos y, en cautividad, machos y hembras liberan oocitos y esperma espontáneamente en los tanques. La presencia de huevos en los tanques se determinó diariamente observando si había huevos en unas pequeñas redes cónicas que se colocaron a la salida de los tanques. El periodo entre la primera y la última puesta se considera como la "estación de puesta". El "punto medio de puesta" se calculó utilizando un valor igual a la media del número de días que pasaron entre la primera y las siguientes puestas (Zanuy et al., 1995). Previamente se han publicado diversos datos relativos a las puestas de estos grupos (Navas et al., 1998).

Análisis de la concentración plasmática de LH

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± error estándar de la media (s.e.m.). La presencia de diferencias significativas entre grupos se estableció utilizando el programa Sigma Statt de Jandel Scientific (San Rafael, CA). Este programa determina automáticamente la normalidad de los datos mediante el test de Kolmogorov Smirnoff, y la homogeneidad de las varianzas observando la variabilidad del grupo de medias. Puesto que los datos resultaron ser no paramétricos se aplicó el test de Kruskal-Wallis tanto a los resultados de puesta como a los de los análisis hormonales; y a continuación se aplicó el test de Dunns para comparaciones múltiples. Las diferencias se consideraron significativas a un nivel de P < 0.05.

Resultados

Los porcentajes de machos espermiantes se muestran en la figura 1. En el grupo control, el 100% de los machos fueron espermiantes en diciembre y enero. Este porcentaje disminuyó hasta alrededor de un 85% en febrero y marzo, y alrededor de un 75% en abril. En el grupo alimentado con el 10% de lípidos, el porcentaje de machos espermiantes fue de aproximadamente el 25% en diciembre, aumentando hasta un 100% en enero y oscilando alrededor de 80% en febrero y marzo. En abril no se detectaron machos espermiantes en este grupo. El grupo alimentado con un 22% mostró aproximadamente el 80% de machos espermiantes en diciembre. Este porcentaje aumentó a un 100% en enero y estuvo cercano al 80% en febrero y marzo, descendiendo hasta aproximadamente el 50% en abril.

El periodo de puesta se representa como una barra horizontal en la base del gráfico de concentraciones de LH (fig. 2). En todos los grupos, las puestas comenzaron en la segunda mitad de diciembre y finalizaron en los últimos días de marzo (grupo 22%) o a inicios de abril (grupos control y 10%). El punto medio del periodo de puesta, marcado como una línea vertical en las mismas gráficas, se observó alrededor de mitad de febrero.

El perfil anual de los niveles plasmáticos de LH a lo largo del ciclo reproductivo de todos los grupos se representa en la figura 2. En el grupo control las concentraciones de LH fueron bajas en octubre y noviembre, aumentaron gradualmente en diciembre y enero, y alcanzaron un pico en febrero, coincidiendo con el punto medio del periodo de puesta. Después descendieron a lo largo de marzo y abril hasta los valores basales observados en mayo. En el grupo 10% las concentraciones plasmáticas de LH a lo largo del ciclo reproductivo mostraron una tendencia similar a las del grupo control, pero en febrero se observó un fuerte descenso de los niveles plasmáticos de LH hasta alcanzar valores similares a los que se observaron fuera de la época reproductora (es decir en octubre o mayo). Como consecuencia, los niveles plasmáticos de LH en febrero fueron significativamente menores en el grupo 10% que en el grupo control. El grupo 10% también mostró en abril una concentración plasmática de LH significativamente más baja que la de los animales controles. El grupo 22% presentó concentraciones plasmáticas de LH similares a las del control, con la única excepción de diciembre, mes en el que las concentraciones de LH fueron significativamente más bajas que en los controles.

Discusión

La mayor parte del trabajo realizado acerca de la regulación hormonal de la reproducción en peces, y particularmente en la lubina, se ha concentrado en las hembras. Por el contrario, la investigación sobre la regulación de la espermatogénesis y la espermiación en los machos se ha descuidado. Esto es especialmente grave si se tiene en cuenta que las diferencias hormonales entre sexos, y en particular las bajas concentraciones o incluso total ausencia de E2 en los machos, puede usarse como una herramienta muy eficiente en estudios comparativos, 10 que permitiría realizar avances importantes en el campo de la endocrinología de peces. Siguiendo este razonamiento, este trabajo presenta por primera vez el perfil de los niveles plasmáticos de LH a lo largo del ciclo reproductivo de los machos de lubina.

En este experimento, los niveles plasmáticos de LH en los machos estuvieron por encima de los niveles basales entre diciembre y abril, es decir a lo largo del periodo de espermiación, y el máximo se alcanzó en febrero (con excepción del grupo 10%), coincidiendo con el punto medio del periodo de puesta. En la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss Walbaum) los niveles plasmáticos de LH en los machos aumentan durante la espermiación, lo que sugiere que esta hormona está implicada en el control de los estadíos tardíos de la espermatogénesis (Prat et al., 1996). En las hembras de la lubina las concentraciones máximas de LH se observaron en febrero, en el punto medio del periodo de puesta (Navas et al., 1998), pero desde enero a marzo, a lo largo de todo el periodo de puesta, se observaron niveles elevados de LH (Navas et al., 1998). En las hembras de salmónidos los niveles plasmáticos de LH muestran un incremento en el periodo de prepuesta, alcanzando niveles máximos en los estadíos de ovulación y postovulación (Suzuki et al., 1988 b; Swanson, 1991; Prat et al., 1996). En una especie que, igual que la lubina presenta un ovario de tipo síncrono por grupos, como el carpín (Carassius auratus L), el crecimiento oocitario tiene lugar con niveles bajos de LH en plasma, produciéndose un fuerte incremento de esta hormona en el momento de la ovulación (Kobayashi et al., 1987, 1988). Las variaciones que se han observado en las concentraciones plasmáticas de LH en los machos a lo largo de la estación reproductora, junto con el hecho de que el periodo en que aparecen concentraciones altas de LH en machos es más amplio que en hembras, sugieren que la LH es también importante en la lubina, al igual que en otras especies de peces, en el control de la maduración final de los gametos y en la espermiación/ovulación.

Las diferencias en las concentraciones plasmáticas de LH que se detectaron en diciembre en el grupo 22% con respecto a los controles probablemente son debidas a variaciones puntuales en el estatus fisiológico del pez en un momento dado. En los machos de peces de muchas especies, la T y la 11 -ceto-testosterona (11KT) regulan la producción y liberación de LH (Nagahama, 1994). En un trabajo previo (Asturiano et al., 2002) se observaron valores altos de estos dos andrógenos a lo largo de todo el periodo de espermiación en lubinas macho. Sin embargo, cuando los machos se muestrearon varias veces en un periodo corto de tiempo se observó que en una misma oleada de producción de esperma había variaciones muy fuertes de esta hormona (Asturiano et al., 2002). De hecho dentro del mismo mes los valores de estos andrógenos podían descender bruscamente de casi 1 ng mL^-1 hasta 1 ng mL^-1, para después aumentar de nuevo. Tales diferencias eran provocadas por los cambios que se producían en la esteroidogénesis gonadal desde la producción de T hacia la de los esteroides inductores de la maduración, la 17,20β-dihidroxi-4-pregnen-3-ona (17,20βP) y la 17,20β,21-trihidroxi-4-pregnen-3-ona (20βS) (Asturiano et al., 2002). Vizziano et al. (1996) observaron cambios similares en machos de trucha arco iris. Si la T y la 11KT influencian directamente los niveles plasmáticos de LH, es de esperar que también se observen variaciones fuertes en las concentraciones de LH que, no obstante, son difíciles de detectar en muestreos mensuales. En este experimento, es posible que uno de los muestreos del grupo 10% en febrero haya coincidido con un momento de bajas concentraciones plasmáticas de LH.

También puede haber ocurrido que los niveles de LH en el grupo 10% estuvieran relacionados con una alteración global de la regulación hormonal de la reproducción. Tal alteración estaría relacionada con los bajos porcentajes de machos espermiantes observados en este grupo en el periodo de espermiación. Sin embargo, en los meses centrales de este periodo el porcentaje de machos espermiantes también fue alto, lo que parece indicar que, una vez iniciado, el proceso de espermiación tiene lugar incluso con niveles bajos de LH. No obstante, la LH tendría una influencia directa en la cantidad de esperma producido, tal y como se ha observado en otra especie de lubina (Morone saxatilis Walbaum) (Mylonas et al., 1997). Estas reducciones en el volumen de esperma producido también se han observado en la lubina europea cuando se realizaron varios muestreos dentro de la misma oleada de espermiación (Asturiano et al., 2002).

Los datos acerca del efecto de diferentes factores nutricionales sobre los machos de lubina son escasos. En el caso de las hembras, se ha observado que dietas experimentales que contenían 51% de proteína cruda no afectaban negativamente la fecundidad o la calidad de los huevos (Cerdá et al., 1994). Si los machos necesitan un contenido similar de proteína en la dieta, entonces las diferencias observadas entre los grupos en el presente experimento no pueden atribuirse a deficiencias proteicas puesto que en todos los casos el contenido de proteínas era mayor del 51%. El grupo 10%, que mostró el menor contenido de LH y también los menores porcentajes de machos espermiantes, fue alimentado con una dieta comercial que tenía los contenidos más bajos de ácido araquidónico (AA, 20:4 n-6) y de DHA. Estos ácidos grasos son esenciales para los peces marinos ya que éstos no pueden sintetizarlos y, por lo tanto, deben ser ingeridos a través de la dieta para mantener un adecuado funcionamiento y la estructura celular (Mourente y Tocher, 1994; Sargent et al., 1995). Diversos trabajos (revisado por Núñez et al., 1995) han mostrado que el AA y/o sus metabolitos median en la liberación de gonadotropina inducida por GnRH. Parece ser que el AA actúa en la fase inicial de exocitosis de la LH almacenada. El AA también estimula la producción de T in vitro en piezas de testículo de carpín (Wade y Van der Kraak, 1993), y es sabido que la T juega un papel fundamental en la regulación de la producción de LH. El bajo porcentaje de AA en el pienso administrado al grupo 10% podría estar relacionado con las bajas concentraciones de LH observadas en este grupo. Aunque el contenido porcentual de AA en el pienso administrado al grupo 22% fue similar al del pienso con 10% de lípidos, la cantidad total de AA en la dieta con 22% de lípidos debió de ser mayor puesto que el contenido total de lípidos fue 2.2 veces mayor que en el otro pienso. El otro PUFA que apareció en un porcentaje muy bajo en la dieta con 10% de lípidos fue el DHA. Este ácido graso juega un papel muy importante en el mantenimiento de la plasticidad y funcionalidad de las membranas celulares (Bell et al., 1986). La baja proporción de DHA en la dieta con 10% de lípidos con respecto a la dieta natural, y el bajo contenido absoluto de este ácido graso en la dieta con 10% de lípidos, con respecto a la dieta con 22%, podría haber afectado la eficacia reproductora del los machos del grupo 10%.

Junto con el bajo contenido absoluto de DHA y AA, las proporciones de estos dos ácidos grasos con respecto al EPA, es decir las proporciones DHA:EPA y AA:EPA, son muy importantes en la determinación de la eficacia reproductora de los peces. El DHA y el EPA compiten por las mismas enzimas para ser incluidos en la estructura de los fosfolípidos de las membranas (Bell et al., 1986). Por otra parte, AA y EPA compiten por las mismas enzimas que sintetizan las prostaglandinas; sin embargo, las prostaglandinas derivadas del AA tienen mayor actividad biológica que las derivadas del EPA (Crawford, 1983). Puede observarse que las relaciones DHA:EPA y AA:EPA son mayores en la dieta control que en las dietas comerciales, y esto se puede relacionar con la mayor eficacia reproductora observada en los machos del grupo control. Eficacia reproductora que se refleja en las mayores concentraciones plasmáticas de LH y los mayores porcentajes de machos espermiantes con respecto a los grupos alimentados con dietas articiales.

Los niveles plasmáticos de LH en las hembras de los grupos experimentales utilizados en este trabajo han sido presentados previamente (Navas et al., 1998). Las hembras de los grupos 10% y 22% exhibieron niveles plasmáticos de LH significativamente mayores que los de las hembras control en el punto medio del periodo de puesta (Navas et al., 1998). Estos incrementos en la concentración plasmática de LH con respecto a los controles han estado siempre asociados a incrementos de E2 en plasma (Navas et al., 1998). Se ha mantenido la hipótesis (Navas et al., 1998) de que los niveles altos de E2 provocan incrementos de los niveles plasmáticos de LH debido al control que el E2 ejerce, mediante mecanismos de retroalimentación positivos y negativos, sobre la producción y liberación de LH en la hipófisis (revisado por Kah, 1997). En el caso de los machos, el punto medio del periodo de espermiación coincide aproximadamente con el punto medio del periodo de puesta. En ese momento, contrariamente a lo que ocurre en las hembras los niveles de LH en los machos fueron más bajos (grupo 10%) o similares (grupo 22%) a los observados en el grupo control. Este hecho sugiere que en los machos los mecanismos hormonales que controlan el funcionamiento endocrino del hipotálamo y de la hipófisis difieren de los de las hembras.

En conclusión, en este trabajo se presentan por primera vez los datos de las variaciones estacionales de LH en machos de lubina. Contrariamente a lo observado previamente en hembras (Navas et al., 1998), en los machos no se observa una influencia marcada de la composición en ácidos grasos de la dieta sobre los niveles plasmáticos de LH, lo que sugiere que hay diferencias intersexuales en los mecanismos que controlan la producción y liberación de LH.

Agradecimientos

JM Navas ha sido contratado dentro del programa Ramón y Cajal del Ministerio Español de Ciencia y Tecnología (MCYT). Este trabajo ha sido financiado en parte por los proyectos FAR n° AQ 2 406 E UK y AIR n° 2-CT93 1005 de la CE, y por el proyecto ACU02-004 del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA).

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