La liberación de calcio de los depósitos intracelulares promueve la secreción de serotonina en terminales sinápticas

Calcium release from intracellular stores promotes serotonin secretion at synaptic terminals

Citlali Trueta¹

¹ Departamento de Neurofisiología. Subdirección de Investigaciones en Neurociencias, Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz.

Correspondencia:
Dra. Citlali Trueta.
Departamento de Neurofisiología.
Subdirección de Investigaciones en Neurociencias,
INPRFM. Calz. México-Xochimilco 101,
San Lorenzo Huipulco, Tlalpan,
14370, México, DF.
Teléfono: +52 55 4160 - 5100.
Fax: +52 55 5655 - 9980. ]]> E-mail: ctrueta@imp.edu.mx

Recibido: 8 de octubre de 2013.
Aceptado: 15 de noviembre de 2013.

RESUMEN

En este trabajo se estudió la participación que tiene la liberación de calcio del retículo endoplásmico en la liberación de serotonina en terminales sinápticas. Los experimentos se llevaron a cabo en sinapsis formadas en cultivo entre neuronas serotonérgicas de Retzius y neuronas mecanosensoriales sensibles a presión, aisladas del Sistema Nervioso Central de la sanguijuela. En esta preparación la estimulación con pares de impulsos produjo facilitación sináptica. La estabilización de los receptores de rianodina en un estado de sub-conductancia por la incubación con rianodina 100 μM produjo un alargamiento del potencial sináptico en respuesta a impulsos presinápticos, sugiriendo que el calcio liberado por estos canales puede alcanzar las vesículas y promover la secreción. En contraste, el vaciamiento de los depósitos intracelulares de calcio con tapsigargina 500 nM produjo una disminución gradual de la facilitación sináptica ante impulsos presinápticos pareados y abolió la liberación extrasináptica en el axón neuronal en respuesta a trenes de impulsos. Todo esto ocurrió sin cambios en las propiedades de la membrana postsináptica, lo cual sugiere que la liberación de calcio intracelular participa en un mecanismo de retroalimentación positiva que promueve la liberación presináptica y perisináptica en las neuronas serotonérgicas.

Palabras clave: Serotonina, sinapsis, liberación de calcio inducida por calcio, facilitación, retículo endoplásmico.

ABSTRACT

Key words: Serotonin, synapse, calcium-induced calcium release, facilitation, endoplasmic reticulum.

INTRODUCCIÓN

La serotonina es un neurotransmisor y neuromodulador de gran relevancia en la regulación de diversas funciones fisiológicas y conductas en los animales a lo largo de toda la escala filogenética, incluyendo al ser humano. Por ejemplo, la conducta agresiva y el establecimiento de la dominancia social son reguladas por la serotonina desde los crustáceos^1-3 hasta los primates,^4-7 donde la serotonina regula también los estados de ánimo. La serotonina regula además la alimentación,^8,9 el sueño, la atención,¹⁰ la ansiedad,¹¹ los ritmos cir-cadianos,¹² la conducta sexual^13,14 y la generación de patrones motores rítmicos como la locomoción, la masticación y la respiración,^14-17 entre muchos otros. En los humanos, las alteraciones en el sistema serotonérgico están relacionadas con trastornos conductuales y neurológicos que incluyen a los alimenticios, la depresión,¹⁸ la epilepsia,¹⁹ la esquizofrenia,²⁰ y la ansiedad,²¹ por lo que estudiar cómo se regula su liberación en el Sistema Nervioso podría contribuir a desarrollar tratamientos para este tipo de patología.

Las neuronas serotonérgicas secretan esta monoamina a partir de las terminales sinápticas,^22-24 donde actúa como neurotransmisor produciendo efectos rápidos y localizados sobre terminales postsinápticas en circuitos neuronales fijos, y también a partir de sitios extrasinápticos en el soma,^25-30 el axón y las dendritas,³¹ donde actúa como modulador produciendo efectos lentos y difusos de tipo parácrino.

Debido a la complejidad anatómica de las neuronas serotonérgicas en los vertebrados, los mecanismos finos de la liberación sináptica de serotonina se han estudiado sobre todo en sinapsis formadas en cultivo entre neuronas identificadas aisladas del Sistema Nervioso Central de la sanguijuela Hirudo medicinalis.^32,33 Las neuronas en cultivo, al ser isopotenciales, presentan grandes ventajas para estos estudios. Los mecanismos básicos de liberación en estas terminales sinápticas son similares a los de las sinapsis clásicamente estudiadas como la placa neuromuscular³⁴ y la sinapsis gigante del calamar,^35,36 es decir, la liberación ocurre de manera cuántica, dependiente del calcio y del potencial de membrana presináptico.^37,38 En la zona activa de las terminales sinápticas la serotonina se libera a partir de vesículas sinápticas claras, de las cuales hay una poza lista para liberarse y una poza de reserva.³⁹ Dependiendo de la probabilidad de liberación y de la cantidad de vesículas disponibles se presentan fenómenos de plasticidad a corto plazo como la facilitación y la depresión.⁴⁰ Como en muchas otras terminales sinápticas, las vesículas claras en estas terminales están rodeadas de vesículas electrodensas que también contienen serotonina^39,41 y la liberan en zonas perisinápticas o extrasinápticas, produciendo también efectos postsinápticos, aunque más lentos (Trueta y De-Miguel, en preparación).

Las terminales serotonérgicas contienen retículo endoplásmico, que es un depósito intracelular de calcio.^42,43 El retículo endoplásmico almacena calcio en grandes concentraciones gracias a la función de una ATPasa que transporta activamente calcio del citoplasma hacia el lumen del retículo en contra de su gradiente de concentración.⁴² El calcio de este reservorio intracelular se puede liberar hacia el citoplasma a través de canales llamados receptores de rianodina que se abren en respuesta a incrementos moderados en la concentración citoplásmica de calcio, produciendo la llamada liberación de calcio inducida por calcio (CICR por sus siglas en inglés).⁴³ Este mecanismo desempeña un papel fundamental en la secreción en las células endocrinas excitables^44,45 y en algunos tipos neuronales se ha mostrado que contribuye a la liberación espontánea de neurotransmisor,^46-48 así como a la facilitación sináptica⁴⁷ y a la liberación en respuesta a trenes de impulsos.^49,50 Además, en algunas neuronas que utilizan vesículas electrodensas la liberación de calcio de los depósitos intracelulares tiene una contribución importante en el incremento de la concentración de calcio intracelular en respuesta a la actividad eléctrica⁵¹ y participa en la movilización de estas vesículas hacia la membrana y su fusión con ésta para producir la secreción de péptidos.^52-54 En el cuerpo celular de las neuronas serotonérgicas de Retzius la liberación de calcio inducida por calcio también tiene una contribución importante a la secreción somática al producir la movilización de las vesículas hacia la membrana⁵⁵ (León-Pinzón et al. en preparación). La presencia de cisternas de retículo endoplásmico en las terminales sinápticas en estas neuronas sugiere que este mecanismo de liberación de calcio podría participar también en la regulación de la liberación sináptica de serotonina, pero esta participación no se ha estudiado. Si bien la secreción sináptica en respuesta a un impulso es muy rápida y es poco probable que tenga una contribución por parte de esta fuente de calcio, que se activa más lentamente, la liberación de calcio inducida por calcio podría participar en la movilización de vesículas claras de la poza de reserva y/o de las vesículas electrodensas que liberan en zonas perisinápticas en respuesta a la actividad eléctrica repetitiva.

En este trabajo estudiamos la participación de la liberación de calcio inducida por calcio en la liberación sináptica y perisináptica de serotonina en respuesta a pares y trenes de impulsos. Para ello utilizamos sinapsis formadas entre neuronas serotonérgicas de Retzius y neuronas mecanosensoriales sensibles a presión (células P), aisladas del Sistema Nervioso Central de la sanguijuela Hirudo medicinalis y haciendo contacto en cultivo. La neurona presináptica de Retzius se estimuló mediante la inyección de corriente con un electrodo intracelular y la liberación de serotonina se analizó a partir de los potenciales sinápticos registrados en la célula P postsináptica. La liberación de calcio del retículo endoplásmico fue promovida utilizando rianodina, que estabiliza los receptores de rianodina en un estado semi-abierto, o fue inhibida mediante el uso de la tapsigargina, que inhibe a la ATPasa de calcio del retículo endoplásmico, produciendo el vaciamiento del depósito intracelular mediante la fuga pasiva de calcio.

Aislamiento y cultivo neuronal

Se aisló la cadena de ganglios nerviosos que forma el Sistema Nervioso Central de la sanguijuela y se abrieron las cápsulas ganglionares utilizando pinzas finas. Después del tratamiento con colagenasa-dispasa (2mg/ml), se aislaron individualmente las neuronas de Retzius (Rz) y las neuronas sensibles a presión (P) mediante succión a través de una pipeta de vidrio. Las neuronas se sembraron sobre platos de cultivo (Falcon, primaria) cubiertos con concanavalina-A, colocando el muñón axonal de la neurona de Retzius en contacto con el soma de la neurona P. La figura 1A muestra una imagen de un par de neuronas Rz-P en cultivo. Las neuronas se registraron después de 2-7 días en cultivo.

Registro intracelular

La neurona presináptica se estimuló mediante la inyección de pulsos de corriente despolarizante a través de un micro-electrodo intracelular con una resistencia de 20-30 ΜΏ lleno de cloruro de potasio 3M, utilizando un amplificador intracelular (Getting, modelo 5) en modo de balance de puente. Se utilizaron pulsos con una duración de 100 ms para producir dos potenciales de acción o de 200 ms para producir trenes de 5-6 potenciales de acción. Los potenciales sinápticos se registraron en la célula P con un microelectrodo lleno de cloruro de cesio 2M. Las señales fueron adquiridas y digitalizadas con un convertidor Digidata 1322 (Axon Instruments) a 10 KHz para su análisis posterior.

Farmacología

Aplicación de serotonina por iontoforesis

Se llenaron microelectrodos similares a los utilizados para el registro intracelular con una solución de 5-hidroxitriptamina-HCl 150 mM. Para retener la serotonina en el electrodo se aplicó una corriente directa constante de -1 nA al electrodo. La punta del electrodo se colocó cerca del soma de la neurona P postsináptica. Para producir la salida de serotonina se aplicaron pulsos de corriente positiva de 2 nA con una duración de 200 ms.

RESULTADOS

En pares de neuronas Rz-P (figura 1A) que habían formado sinapsis, el disparo de un potencial de acción por la neurona presináptica de Retzius evocó un potencial sináptico en la neurona P postsináptica (figura 1B), producido por la liberación presináptica de serotonina. Mientras que un par de potenciales de acción producidos con un intervalo de 300 ms o más en la neurona presináptica produjo dos potenciales sinápticos de amplitud similar en la célula P (figura 1C), la reducción de este intervalo a 100 ms o menos, produjo facilitación sináptica, determinada por la presencia de un potencial sináptico compuesto de amplitud mayor que la suma de los dos potenciales sinápticos individuales (figura 1D).

Los botones sinápticos de las neuronas de Retzius contienen cisternas de retículo endoplásmico a una distancia mayor a 500 nm de las zonas activas (ver, por ejemplo, la figura 1 en la referencia ³⁹). Por ello, para estudiar si la liberación de calcio de estos depósitos intracelulares participa en la liberación de neurotransmisor, fue necesario investigar si el calcio que se libera a través de los receptores de rianodina se difunde hasta los sitios donde están las vesículas. Para ello se registraron las respuestas postsinápticas tras el disparo presináptico de potenciales de acción sencillos, pareados y en trenes a una frecuencia de 20 Hz en condiciones control y entonces se indujo la salida continua de calcio del retículo endoplásmico hacia el citoplasma incubando pares de neuronas con rianodina 100 μΜ, que estabiliza los canales de los receptores de rianodina en un estado de sub-conductancia.^56-58

En estas condiciones se produjo un alargamiento del 552 ± 174%, en la fase de caída del potencial sináptico, de 70.5 ± 28.9 ms en condiciones control (n=11; figura 2A, panel izquierdo, trazo negro) a 389.7 ± 100.3 ms después de cinco minutos (n=3; figura 2A, panel izquierdo, trazo gris). Para comprobar que este alargamiento del potencial sináptico no fue producido por un decaimiento gradual del estado de las neuronas a lo largo del tiempo, registramos las respuestas postsinápticas de pares de neuronas que no se trataron con rianodina. En estos casos, el tiempo medio de caída del potencial sináptico se incrementó sólo marginalmente a lo largo de cinco minutos de registro (figura 2B, triángulos negros) de 106.1 ± 21.6 ms a 131.2 ± 25.2 ms después de cinco minutos de registro (n=11).

El efecto de la rianodina fue más notable ante pares o trenes de impulsos en la neurona presináptica (figura 2). Con impulsos pareados, el potencial sináptico en presencia de rianodina se incrementó en un 436 ± 168%, de 140.82 ± 19.3 ms a 689.2 ± 271.3 ms (n=5), mientras que en los controles sólo cambió de 168 ± 34.6 ms a 188.5 ± 28.1 ms (n=13). Con trenes de cinco o seis impulsos a 20 Hz la rianodina incrementó el tiempo de caída del potencial sináptico en un 420 ± 105%, de 335.9 ± 116.7 ms a 1454.3 ± 325.8 ms (n=5), mientras que en condiciones control el cambio fue de 392.7 ± 108 ms a 441.9 ± 100.1 ms (n=8).

Para comprobar que los efectos de la rianodina no fueron causados por cambios en las propiedades eléctricas de la neurona postsináptica, se registraron respuestas de las células P antes y después de la aplicación del fármaco (figura 3). Los potenciales de acción producidos por pulsos despolarizantes en la neurona postsináptica en condiciones control (figura 3A, trazo negro) y en presencia de rianodina (figura 3A, trazo gris) fueron idénticos, descartando posibles efectos sobre la actividad eléctrica postsináptica inducidos por la rianodina. Además, la resistencia de entrada y la constante de tiempo de la membrana postsináptica ante un pulso de corriente hiperpolarizante también permanecieron sin cambios (figura 3B, trazo negro) en presencia de rianodina (figura 3B, trazo gris). Más aún, la respuesta de la neurona postsináptica a la aplicación de serotonina por iontoforesis tampoco fue alterada por la rianodina (figura 3C), descartando cambios en la sensibilidad postsináptica a la serotonina por el tratamiento con rianodina. Todo esto sugiere que el calcio que se libera del retículo endoplásmico a través de los receptores de rianodina alcanza los sitios de liberación en las terminales sinápticas y es capaz de promover la fusión de las vesículas con la membrana.

Para comprobar que la actividad eléctrica presináptica estimula la liberación de calcio inducida por calcio y este mecanismo participa en la liberación de serotonina, se vaciaron los depósitos intracelulares de calcio utilizando tapsigargina. Dado que dicho vaciamiento ocurre lentamente, se registraron las respuestas cada cinco minutos durante al menos 30 minutos.

Después de 15 minutos de incubación con tapsigargina se mantuvo la generación de potenciales sinápticos en respuesta a un impulso, pero el potencial sináptico compuesto en respuesta a impulsos pareados disminuyó en un 33%, mostrando una disminución en la facilitación sináptica después de 15 minutos de incubación con tapsigargina (figura 4A). Esto no fue causado por un decaimiento del estado de las neuronas, dado que en pares registrados en ausencia de tapsigargina la amplitud del potencial sináptico compuesto disminuyó sólo marginalmente incluso después de 45 minutos de registro (figura 4B).

Este resultado sugiere que la liberación de calcio de los depósitos intracelulares desempeña un papel importante en la facilitación de la liberación sináptica de serotonina ante la actividad eléctrica repetitiva.

DISCUSIÓN

Los resultados mostrados en este trabajo indican que la liberación de calcio inducida por calcio modula la liberación sináptica y extrasináptica axonal de serotonina. El alargamiento de los potenciales sinápticos en pares de neuronas tratadas con rianodina sugiere que el calcio liberado del retículo endoplásmico a través de los receptores de rianodina alcanza las vesículas sinápticas y puede participar en su fusión retrasada con la membrana. Asimismo, la disminución de la liberación de serotonina después del vaciamiento de los depósitos intracelulares de calcio sugiere que la liberación de calcio inducida por calcio participa en la liberación de serotonina en las terminales en respuesta a la actividad eléctrica repetitiva.

La liberación de calcio del retículo endoplásmico desempeña un papel fundamental en el acoplamiento excitación-secreción en células endocrinas excitables^44,45 y también en la liberación extrasináptica de neurotransmisores en el soma de varios tipos neuronales, incluyendo a las neuronas de Retzius,^55,59-61 así como en células gliales.⁶² En particular la liberación de calcio inducida por calcio provee un mecanismo de retroalimentación positiva que amplifica las señales intracelulares de calcio producidas por la entrada transmembranal de este ión a través de canales dependientes de voltaje. A pesar de que en muchas neuronas se ha descrito la presencia de depósitos intracelulares de calcio e incluso su participación en la generación de señales postsinápticas en las dendritas,^63-66 su papel en la liberación de neurotransmisor en las terminales presinápticas se ha estudiado poco. La presencia de retículo endoplásmico cerca de las terminales presinápticas de las neuronas serotonérgicas de Retzius sugiere que funcionalmente la liberación de calcio de estos compartimentos pudiera tener efectos sobre la movilización de las vesículas y la liberación de serotonina, como ocurre en neuronas parasimpáticas, cerebelares e hipocampales, en donde la liberación de calcio de los depósitos intracelulares favorece la liberación de transmisor.^46,47,50 Sin embargo, dado que las cisternas del retículo endoplásmico no se encuentran muy cerca de las zonas de liberación y que la difusión del calcio en el citoplasma es limitada, era necesario investigar en primer lugar si el calcio liberado de este depósito alcanza los sitios de liberación para poder participar en la exocitosis. El alargamiento del potencial sináptico en presencia de rianodina sugiere que cuando se produce una liberación de calcio a través de los receptores de rianodina éste puede alcanzar las vesículas en los sitios de liberación y sostener la liberación de serotonina después de la estimulación eléctrica. La rianodina estabiliza a los canales de los receptores de rianodina en un estado de sub-conductancia en el que puede fluir calcio de manera continua, pero a una velocidad menor que a través del canal completamente abierto. En distintos tipos celulares de mamíferos, la rianodina, en la concentración utilizada en este trabajo, bloquea los receptores de rianodina, impidiendo que ocurra la liberación de calcio inducida por calcio. Sin embargo, las neuronas de la sanguijuela son poco sensibles a muchos fármacos utilizados para bloquear canales iónicos, por lo que no es sorpresivo que esta concentración alta de rianodina no bloquee los canales, sino que los estabilice en el estado semi-abierto, como hace la rianodina a concentraciones menores en células de mamífero. Sin embargo, para comprobar este efecto es necesario realizar mediciones de las señales intracelulares de calcio en respuesta a la estimulación eléctrica en presencia de rianodina en las neuronas de Retzius.

Dado que la rianodina se une a sus receptores por la parte interna de la membrana reticular, es necesario estimular a las neuronas eléctricamente para que se introduzca el compuesto y abra a los canales. Por ello es de esperarse que únicamente ocurra la liberación de calcio después de la estimulación eléctrica que produce la entrada de calcio transmembranal y con ello un incremento en la concentración citoplásmica de calcio suficiente para activar a los receptores de rianodina. Además, el efecto de la rianodina se observa decenas de milisegundos después del potencial de acción y es más evidente en respuesta a la estimulación repetitiva, presumiblemente porque el calcio que entra a través de la membrana necesita difundirse hasta el retículo endoplásmico para poder activar a los receptores de rianodina. Una vez que esto ocurre, el calcio liberado necesita también tiempo para difundirse hasta la zona activa. En el caso en que el calcio evoca la liberación de vesículas electrodensas, el esquema es más complejo y retrasado ya que estas vesículas no están en contacto con la membrana plasmática y su fusión requiere del transporte previo a la membrana, lo que añade un retraso al proceso.

En diversas preparaciones que se han utilizado para estudiar los mecanismos de liberación sináptica de neuro-transmisores la facilitación es producida por el calcio residual que permanece en la terminal después de un impulso nervioso cuando un segundo impulso ocurre antes de que la concentración de calcio haya regresado a sus niveles basales.³⁴ Este es el caso de las neuronas de Retzius aquí estudiadas.⁴⁰ La suma del calcio residual al calcio que entra por la membrana en respuesta a un segundo impulso incrementa la probabilidad de liberación del neurotransmisor,⁶⁷ produciendo la fusión de un número mayor de vesículas con la membrana en respuesta al segundo impulso. La disminución gradual de la facilitación que se observó aquí después de vaciar la poza por la incubación con tapsigargina sugiere que la liberación de calcio inducida por calcio contribuye a la facilitación sináptica. Esto podría ocurrir si el calcio que se libera del retículo endoplásmico se suma al calcio residual, contribuyendo a incrementar la probabilidad de liberación. También es posible que el calcio liberado de los depósitos intracelulares promueva la movilización de vesículas de la poza de reserva hacia la poza liberable, incrementando el número de vesículas disponibles para liberar.

La inhibición que produjo la tapsigargina de las respuestas postsinápticas en los casos en que no se formaron sinapsis y únicamente ocurre liberación perisináptica, sugiere que la liberación de calcio de los depósitos intracelulares es necesaria para producir la movilización de las vesículas electrodensas hacia los sitios de liberación extrasináptica y su fusión con la membrana. La participación de la liberación de calcio inducida por calcio en la movilización de vesículas electrodensas ocurre también en el soma de las propias neuronas de Retzius durante la secreción somática,⁵⁵ así como en otras preparaciones en donde la liberación ocurre a partir de este tipo de ve-sículas.^53,68 Es posible que la liberación de calcio del retículo endoplásmico participe también en el proceso de fusión de las vesículas electrodensas con la membrana plasmática, ya que la entrada transmembranal de calcio en respuesta a la estimulación eléctrica posiblemente termina antes de que estas vesículas alcancen la membrana, mientras que la liberación de calcio intracelular es un proceso más lento, adecuado al curso temporal de movilización y fusión de este tipo de vesículas.

Dado que la disminución en la amplitud de las respuestas postsinápticas en presencia de tapsigargina ocurrió en aproximadamente 15 minutos y no se observaron cambios posteriormente, el vaciamiento de los depósitos intracelulares de calcio parece haberse completado en este tiempo.

Los efectos de la liberación de calcio del retículo endoplásmico parecen ser puramente presinápticos sobre la liberación del neurotransmisor y no sobre la sensibilidad de la membrana postsináptica a la serotonina o sobre sus propiedades eléctricas, ya que las características eléctricas de las neuronas P postsinápticas y su sensibilidad a la serotonina no fueron afectadas por la rianodina o por la tapsigargina.

En resumen, los resultados mostrados en este trabajo sugieren que la liberación de calcio inducida por calcio participa en un mecanismo de retroalimentación positiva que incrementa la liberación de neurotransmisor y ofrecen una explicación complementaria a la hipótesis del calcio residual.

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