Regulación de la liberación de serotonina en distintos compartimientos neuronales

Regulation of serotonin release from different neuronal compartments

Citlali Trueta,¹ Montserrat G Cercós¹

¹Departamento de Neurofisiología, Subdirección de Investigaciones en Neurociencias, Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz.

Correspondencia:
Citlali Trueta. Departamento de Neurofisiología,
Subdirección de Investigaciones en Neurociencias,
Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz.
Calz. México-Xochimilco 101, San Lorenzo Huipulco,
Tlalpan, 14370, México, DF.
E-mail: ctrueta@imp.edu.mx

SUMMARY

Key words: Serotonin, synapse, extrasynaptic, exocytosis, autoinhibition, firing rate.

RESUMEN

La serotonina es fundamental para la modulación de la conducta social, las emociones y una gran cantidad de funciones fisiológicas. La función de los sistemas serotonérgicos se ha conservado a lo largo de la escala evolutiva y, en general, números pequeños de neuronas inervan prácticamente todo el Sistema Nervioso. Estas neuronas son capaces de ejercer múltiples efectos, dependiendo de si liberan serotonina de pozas sinápticas, que ejercen efectos rápidos y locales o de pozas extrasinápticas en la periferia de las sinapsis, el axon, el cuerpo celular o las dendritas, con lo que se producen efectos lentos y difusos, característicos de los estados de ánimo. La liberación de serotonina en las terminales sinápticas es producida por la exocitosis de vesículas claras pequeñas y se activa con impulsos sencillos o a baja frecuencia. La estimulación con trenes de impulsos a frecuencias crecientes produce facilitación y depresión sináptica. En contraste, la liberación a partir del soma es producida por la exocitosis de vesículas de núcleo denso y requiere de la estimulación a frecuencias altas, la activación de canales de calcio tipo L y de la liberación de calcio de los depositos intracelulares. La serotonina liberada por las terminales sinápticas activa de manera inmediata autorreceptores en las propias terminales que la liberaron, disminuyendo la excitabilidad subsiguiente y, por lo tanto, la frecuencia de disparo y la liberación de manera localizada. La regulación diferencial de la liberación en cada compartimiento celular permite que la misma neurona produzca diferentes tipos de efectos dependiendo de la frecuencia de disparo.

Palabras clave: Serotonina, sinapsis, extrasináptico, exocitosis, autoinhibición, frecuencia de disparo.

INTRODUCCIÓN

La 5-hidroxitriptamina, también conocida como serotonina por la primera función que se describió para esta molécula, es un neurotransmisor y neuromodulador de gran relevancia en la regulación de estados de ánimo, funciones fisiológicas y conductas en los animales a lo largo de toda la escala filogenética, incluido el ser humano. En los mamíferos, los efectos de la serotonina se hacen evidentes en la regulación de diversos aspectos de la conducta social,¹ la alimentación,^2,3 el sueño, la atención,⁴ la ansiedad,⁵ los ritmos circadianos,⁶ la conducta sexual^7,8 y la generación de patrones motores rítmicos como la locomoción, masticación y respiración,^8-11 entre muchos otros. En los humanos, las alteraciones en el sistema serotonérgico están relacionadas con trastornos conductuales y neurológicos que incluyen los alimenticios, la depresión,¹² la epilepsia,¹³ la esquizofrenia¹⁴ y la ansiedad.¹⁵

Las características del sistema serotonérgico y sus funciones se han mantenido altamente conservadas a lo largo de la escala evolutiva. Por ejemplo, la conducta agresiva y el establecimiento de la dominancia social son reguladas por la serotonina desde los crustáceos^16-18 hasta los primates.^1,19-21 Una característica especial que define a este sistema es que el número de neuronas serotonérgicas es pequeño comparado con el total de neuronas en el Sistema Nervioso; sin embargo, estas pocas neuronas regulan una gran diversidad de funciones. Por ejemplo, mientras en los anélidos el sistema serotonérgico está formado por siete neuronas (de un total de alrededor de 400) en cada ganglio segmental, los mamíferos tienen alrededor de 9000 neuronas serotonérgicas, lo que representa una proporción de sólo una por cada 200 000 neuronas en el Sistema Nervioso Central. Los somas de estas neuronas en los mamíferos se encuentran agrupadas en una serie de núcleos conocidos como los núcleos del raphé en el tallo cerebral, pero inervan todo el Sistema Nervioso Central.^4,22 Los axones de las neuronas en los núcleos más posteriores ascienden para inervar el encéfalo, incluidos los ganglios basales, el tálamo, la corteza y el cerebelo, mientras que los de las neuronas de los núcleos anteriores descienden para inervar la médula espinal.

DIFERENTES MODOS DE LIBERACIÓN EN LAS MISMAS NEURONAS

Los axones de las neuronas serotonérgicas en el encéfalo se ramifican de manera profusa y dan lugar a miles de millones de terminales varicosas^23,24 que inervan grandes volúmenes cerebrales de manera difusa. A pesar de que en algunas áreas del Sistema Nervioso, como la médula espinal y la substantia nigra reticulata, estas terminales establecen contactos sinápticos especializados; en muchas otras áreas la gran mayoría de estas terminales no establecen contactos sinápticos,^25-29 sino que parecen ser sitios de liberación extrasináptica, en los que la serotonina es liberada al medio extracelular, por el que se difunde hasta encontrar receptores en neuronas a distintas distancias del sitio de liberación. Además de estos sitios de liberación extrasináptica en las varicosidades, el soma de las neuronas serotonérgicas tanto de vertebrados como de invertebrados libera grandes cantidades de serotonina al medio extracelular.^30-32 Las neuronas serotonérgicas, entonces, liberan serotonina tanto a partir de terminales sinápticas, como a partir de sitios extrasinápticos en el soma, los axones y las dendritas.

La serotonina liberada por las terminales sinápticas produce efectos rápidos y localizados sobre las terminales postsinápticas, que se propagan únicamente a través de las neuronas que se conectan de manera directa con las serotonérgicas, como en un circuito eléctrico alambrado. Por el contrario, la serotonina liberada en sitios extrasinápticos se difunde en el medio extracelular en un volumen variable y puede activar cualquier neurona que tenga receptores para este transmisor, siempre que la concentración de serotonina que difunde sea suficiente para activar dichos receptores. Esto requiere de la liberación de grandes cantidades de moléculas y tiene efectos mucho más difusos que la liberación sináptica. Este mecanismo de acción, llamada transmisión paracrina, o transmisión por volumen,^33,34 parece ser fundamental para la modulación de la actividad de los circuitos neuronales que regulan la conducta y las emociones.³⁵ La liberación de neurotransmisores por el cuerpo celular de las neuronas parece ser una fuente importante de moléculas que median la transmisión por volumen y la modulación de los circuitos neuronales.³²

Dado que el sistema serotonérgico está compuesto por un número relativamente pequeño de neuronas, que sin embargo regulan una gran cantidad de funciones diversas, y dado que estas neuronas liberan serotonina a partir de diferentes compartimientos celulares, con funciones distintas, no es difícil imaginar que la liberación de serotonina deba estar regulada de manera muy precisa y que la liberación a partir de cada compartimiento celular sea regulada de manera diferente, a pesar de ocurrir en la misma neurona. Nuestro grupo de trabajo se ha enfocado en el estudio de la regulación diferencial de la liberación de serotonina a partir de sitios sinápticos y extrasinápticos.

REGULACIÓN DE LA LIBERACIÓN SINÁPTICA Y EXTRASINÁPTICA DE SEROTONINA

Una propiedad fundamental de las neuronas es su capacidad para producir impulsos eléctricos y codificar la información que reciben y transmiten mediante cambios en la frecuencia de disparo de dichos impulsos. La frecuencia de disparo de potenciales de acción es fundamental para determinar la cantidad de neurotransmisor que libera una neurona, porque determina la cantidad de calcio que entra a través de canales de calcio sensibles al voltaje en la membrana plasmática. Por ello, hemos estudiado cómo la liberación sináptica y la extrasináptica dependen de la frecuencia de disparo de la neurona.

La liberación de serotonina a partir de terminales sinápticas es muy difícil de analizar en neuronas in situ dentro del Sistema Nervioso, porque las terminales sinápticas se encuentran en ramificaciones axonales lejanas al soma y sus efectos son difíciles de localizar. Por ello, prácticamente todo lo que se sabe acerca de los mecanismos de liberación sináptica de serotonina se ha estudiado en una sinapsis formada entre neuronas en cultivo, aisladas del Sistema Nervioso Central de la sanguijuela.³⁶

El Sistema Nervioso Ccentral de la sanguijuela contiene 21 ganglios segmentales, que controlan de manera relativamente independiente cada segmento del animal y son similares entre sí. El número de neuronas en cada ganglio es relativamente pequeño y constante (alrededor de 400) y el gran tamaño de sus somas facilita los registros electrofisiológicos, de manera que la mayoría de las neuronas han sido identificadas por su función, sus conexiones y su patrón de actividad eléctrica, además de tener una forma, tamaño y localización característica en el ganglio. Este Sistema Nervioso tiene además la capacidad de regenerarse después de una lesión, formando de nuevo conexiones específicas y funcionales.^37,38 Gracias a estas características, las neuronas identificadas pueden ser aisladas una a una y mantenidas en cultivo, donde sobreviven por semanas conservando sus características fisiológicas.³⁹ Además, en cultivo forman sinapsis específicas, algunas de las cuales han sido ampliamente estudiadas.^39-41

En las terminales presinápticas de las células de Retzius, la serotonina se encuentra tanto en vesículas claras pequeñas (40nm de diámetro), similares a las contenidas en la mayoría de las sinapsis, como en vesículas grandes (100nm de diámetro) de núcleo denso.^45-47 Las vesículas claras se encuentran cerca de la membrana presináptica y liberan su contenido directamente a la hendidura sináptica fusionándose en la zona activa de la sinapsis. Las vesículas de núcleo denso liberan 17 veces más serotonina que las claras,⁴⁶ y generalmente se encuentran rodeando a la poza de vesículas claras,^45,47 por lo que se cree que no liberan su contenido directamente en la zona activa de la sinapsis, sino en sitios alrededor de ésta; es decir, producen liberación perisináptica, como ocurre con este tipo de vesículas en otros tipos neuronales. ^48-50 En esta sinapsis, la liberación de serotonina depende del potencial de membrana presináptico y del calcio^44,51 y presenta fenómenos de plasticidad similares a los de las sinapsis centrales, tales como facilitación causada por el calcio residual⁵² y depresión ante la actividad repetitiva.⁴³

La liberación sináptica de serotonina se ha estudiado estimulando de manera controlada la neurona de Retzius presináptica y registrando las respuestas de la célula P post-sináptica en sinapsis formadas en cultivo. En esta preparación, las sinapsis se forman directamente sobre el soma de la célula postsináptica, o muy cerca de éste, y por ello las corrientes postsinápticas se pueden registrar directamente con microelectrodos en el soma de la célula postsináptica. Las corrientes postsinápticas son entonces un indicador fiel de la cantidad de serotonina liberada por la neurona presináptica.

Para producir la liberación de serotonina a partir de las vesículas claras contenidas en las terminales presinápticas, es suficiente el disparo de un potencial de acción, que produce la fusión de unas cuantas vesículas sinápticas⁴⁴ (figura 1B). La estimulación con impulsos pareados produce facilitación sináptica,^51,52 es decir, un incremento en la cantidad de transmisor liberado ante el segundo impulso, siempre que el intervalo entre los impulsos exceda unas cuantas centenas de milisegundos. La estimulación con trenes de impulsos produce, por otro lado, una facilitación al principio del tren, debida al incremento de la probabilidad de liberación por la entrada repetitiva de calcio, seguida de depresión sináptica, es decir, una disminución de la cantidad de transmisor liberado, debida al agotamiento de la poza de vesículas listas para liberar (figura 2). El balance entre la facilitación y la depresión cambia dependiendo de la frecuencia de disparo (Trueta y De-Miguel, en preparación), pero en cualquier caso, un tren de diez impulsos produce la liberación de únicamente unas decenas de vesículas de serotonina.

Por otro lado, la liberación a partir de las vesículas de núcleo denso que rodean las terminales sinápticas requiere de la estimulación repetitiva⁴⁶ y se incrementa con la frecuencia de estimulación. La serotonina liberada a partir de esta poza de vesículas produce efectos en las terminales postsinápticas, pero es posible que también difunda en el espacio extrasináptico y alcance receptores en otras neuronas y medie efectos paracrinos.

En contraste con la liberación sináptica de serotonina, la liberación extrasináptica a partir del cuerpo celular de estas neuronas ocurre únicamente a partir de vesículas grandes de núcleo denso, que no están cerca de la membrana, y por lo tanto su movilización y fusión requieren de la estimulación con trenes de impulsos a frecuencias mucho mayores, cercanas a los 20 impulsos por segundo, para activarse.^30,53 La liberación extrasináptica en el soma de las neuronas de Retzius se ha estudiado utilizando el colorante fluorescente FM1-43, que es un compuesto lipofílico que cuando se une a la membrana plasmática emite fluorescencia al ser iluminado con luz de una longitud de onda de 488nm, tiñendo la membrana. Cuando la neurona es estimulada y libera neurotransmisor, las vesículas secretoras que se fusionan con la membrana plasmática también se tiñen con el colorante que hay en el medio extracelular, haciendo que la intensidad de la fluorescencia se incremente.⁵⁴ Posteriormente, cuando las vesículas se endocitan, se llevan consigo el colorante, y después de lavar el colorante del medio extracelular y de la membrana plasmática se observan puntos fluorescentes que indican los sitios donde ocurrió la exocitosis y la endocitosis. En las neuronas de Retzius hemos mostrado que el número de puntos fluorescentes se puede utilizar para estimar la cantidad de liberación que ocurrió en respuesta a la estimulación en presencia del colorante.³⁰ La liberación somática de serotonina ocurre a partir de cúmulos de vesículas de núcleo denso, que actúan como unidades funcionales para la secreción. Cada cúmulo contiene entre 100 y 200 vesículas⁵³ y su fusión con la membrana ocurre a lo largo de varios minutos después de un tren corto de estimulación eléctrica.³⁰ La estimulación con un tren de diez impulsos a 10 o 20Hz produce la fusión de cerca de cien cúmulos vesiculares, es decir, se libera el contenido de 10 000 a 20 000 vesículas de núcleo denso, en contraste con la cantidad de vesículas que liberan su contenido en las termínales sinápticas. Debido a que los cúmulos vesiculares en las neuronas en reposo no están cerca de la membrana, sino que se encuentran a varias micras de distancia,⁵³ la liberación tiene además una latencia de varias decenas de segundos, que se requieren para mover las vesículas hacia la membrana plasmática. Esto también contrasta con la liberación sináptica, que ocurre en milisegundos. Además, mientras que la liberación de transmisores en las terminales sinápticas está generalmente asociada a la apertura de canales de calcio de tipo N o P/Q,⁵⁵ la liberación somática requiere de la activación de canales de tipo L³⁰ y también de la liberación de calcio de depósitos intracelulares como el retículo endoplásmico.⁵⁶

AUTORREGULACIÓN EN NEURONAS SEROTONÉRGICAS

Un mecanismo importante de regulación de la liberación de neurotransmisores es la autorregulación que el propio transmisor ejerce sobre las neuronas que lo liberan. En el caso de la serotonina, es bien conocido que las neuronas serotonérgicas, tanto de vertebrados como de invertebrados, tienen receptores para este neurotransmisor, que participan en la regulación de su actividad eléctrica. Los autorreceptores de serotonina en los mamíferos son todos miembros de la familia de receptores 5-HT₁. Estos receptores tienen una alta afinidad por la serotonina y están acoplados a proteínas G_i/ _o,⁵⁷ que a su vez activan canales de potasio,⁵⁸ con lo cual se produce una hiperpolarización que disminuye la frecuencia de disparo de las neuronas. En invertebrados, los autorreceptores de serotonina activan sobre todo canales de cloro.⁵⁹ Un caso interesante son las neuronas de caracol, que tienen activación de conductancias tanto de cloro como de potasio en respuesta a la serotonina.⁶⁰

En los mamíferos, los autorreceptores 5-HT_1A se encuentran localizados en el área somatodendrítica de las neuronas serotonérgicas en los núcleos del raphé.^61,62 Por el contrario, las terminales presinápticas de las mismas neuronas contienen a los autorreceptores 5-HT_1B y 5-HT_1D.^63-66 El hecho de que las neuronas tengan varios tipos de autorreceptores ubicados en distintas partes sugiere que las neuronas serotonérgicas quizás también tengan una auto-inhibición diferencial en distintos compartimentos celulares. Una especulación interesante es que, mediante la distribución de diferentes mecanismos de autoinhibición en sus membranas, las neuronas serotonérgicas regulen sus patrones de actividad eléctrica y sus diferentes modos de liberación de serotonina al nivel local. La compartimentalización del mecanismo de autoinhibición podría permitir la regulación local de la liberación de 5-HT en distintas áreas en el Sistema Nervioso Central, donde se controlan diferentes funciones.

La mayor parte de la evidencia de autorregulación serotonérgica proviene de estudios en los que se han aplicado agonistas o antagonistas de los autorreceptores serotonérgicos para evaluar su efecto sobre la actividad de las neuronas que liberan serotonina. Por ejemplo, el incremento de los niveles de serotonina extracelular o la aplicación de agonistas serotonérgicos disminuye la frecuencia de disparo de las neuronas serotonérgicas, mientras que la aplicación de antagonistas de los autorreceptores serotonérgicos incrementa su frecuencia de disparo.^67-79 De manera consistente, la síntesis y la liberación de serotonina en respuesta a la estimulación extracelular son reducidas por agonistas e incrementadas por antagonistas de los autorreceptores serotonérgicos.^71,80-94 Estos estudios han demostrado que la actividad eléctrica de las neuronas serotonérgicas se regula, en parte, por la concentración extracelular de serotonina, es decir, lo que llamamos el "tono" serotonérgico. Sin embargo, el efecto inmediato que tiene la serotonina liberada por una neurona sobre la misma neurona en el sitio de liberación no ha sido estudiado en forma exhaustiva.

AUTOINHIBICIÓN LOCAL INMEDIATA PRODUCIDA POR LA LIBERACIÓN DE SEROTONINA EN TERMINALES SINÁPTICAS

Nuestros estudios han mostrado que la liberación de serotonina por las terminales sinápticas de las neuronas de Retzius produce una autoinhibición local en los sitios de liberación.⁹⁵ La estimulación de estas neuronas aisladas en cultivo produce un potencial de acción, seguido de una hiperpolarización pospotencial que dura varios cientos de milisegundos (figura 3, A1). Al invertir el gradiente transmembranal de cloro inyectando cloruro por medio del electrodo intracelular lleno de KCl, esta respuesta se invirtió, produciendo una despolarización después del potencial de acción (figura 3, A2), lo que sugiere que es producida por corrientes de cloro. Como la serotonina activa en estas neuronas receptores acoplados a canales de cloro, este resultado sugirió que dicha respuesta podría ser producida por la serotonina liberada por la propia neurona. Para probar esta posibilidad, bloqueamos la liberación de serotonina, sustituyendo el calcio de la solución extracelular por magnesio. Esto abolió por completo y de manera reversible la respuesta observada después del potencial de acción (figura 3, B1), sugiriendo que dicha respuesta es causada por alguna sustancia liberada por la propia neurona en respuesta a la estimulación eléctrica. Para probar que la serotonina es responsable de esta respuesta, vaciamos la reserva de serotonina de las neuronas incubándolas por siete días con reserpina, que impide que se empaque la serotonina en vesículas. Las neuronas tratadas de esta manera no mostraron la respuesta postpotencial (figura 3, B2), confirmando que la serotonina produce dicha respuesta. La inhibición producida por la serotonina disminuyó la resistencia de entrada de las neuronas y la excitabilidad subsiguiente, lo cual se hizo evidente al estimular con trenes de pulsos de corriente intracelular idénticos a frecuencias altas, que incrementan la liberación de serotonina. Los primeros pulsos produjeron potenciales de acción, pero más adelante en el tren de estimulación estos pulsos fueron insuficientes para producir el disparo, y se produjeron algunas fallas en los potenciales de acción. Las fallas desaparecieron al bloquear los receptores de serotonina con el antagonista metisergida, confirmando que efectivamente la disminución en la excitabilidad es producida por la serotonina que libera la propia neurona (figura 3 C).

Estos resultados muestran que la serotonina que libera una neurona de Retzius en respuesta a la estimulación eléctrica actúa sobre receptores en la propia neurona de manera inmediata y disminuye la excitabilidad subsiguiente, reduciendo la frecuencia de disparo y por lo tanto la liberación subsiguiente de serotonina. En las neuronas aisladas, las terminales sinápticas se forman muy cerca del soma y por ello los registros en el soma muestran esta autoinhibición. Sin embargo, en las neuronas in situ cabe esperar que la autoinhibición producida en las terminales sinápticas tenga únicamente efectos locales. Esta hipótesis fue validada mediante un modelo eléctrico de las neuronas de Retzius, en el que se simularon las corrientes producidas por la serotonina únicamente en las terminales y se estudiaron los cambios en los potenciales de acción que se propagan del axón hacia éstas. El modelo mostró que la activación de la corriente de cloro producida por la serotonina es capaz de reducir significativamente la amplitud de los potenciales de acción que invaden la terminal hasta niveles que probablemente no sean suficientes para producir la liberación de serotonina. Sin embargo, la producción de potenciales de acción en su sitio de origen no se afecta por la autoinhibición, que tiene únicamente efectos locales (figura 3 D).

La autoinhibición local en las terminales presinápticas parece ser un mecanismo de regulación diferencial de la liberación de serotonina en diferentes compartimentos de la misma neurona. Será interesante estudiar cómo la liberación somática es modulada de manera inmediata por la propia serotonina liberada en este otro compartimiento. La auto-inhibición podría ser un factor importante para regular la liberación de 5-HT durante períodos de actividad eléctrica sostenida lo cual puede reducir al mismo tiempo las consecuencias de una liberación excesiva de serotonina.

CONCLUSIONES

Las neuronas serotonérgicas liberan serotonina por las terminales sinápticas, produciendo efectos locales y rápidos, y por sitios extrasinápticos, en particular en el cuerpo celular, produciendo efectos difusos y de larga duración. La liberación sináptica ocurre a partir de vesículas claras, ante impulsos sencillos o trenes de impulsos a bajas frecuencias, y con frecuencias crecientes presenta facilitación y depresión sináptica, que se equilibran y mantienen la liberación promedio constante. En contraste, la liberación somática ocurre a partir de vesículas electrodensas y requiere de trenes de impulsos a frecuencias altas para activarse.

La liberación perisináptica a partir de vesículas de núcleo denso en el axón parece tener características intermedias entre las de la liberación sináptica y la somática.

La serotonina liberada por las terminales sinápticas activa autorreceptores en las propias terminales de manera inmediata, que producen una hiperpolarización local mediada por corrientes de cloro y una disminución en la excitabilidad que reducen la frecuencia de disparo y la liberación subsiguiente.

AGRADECIMIENTOS

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