Caracterización Molecular y de Ensayos de Patogenicidad de Colletotrichum acutatum, Agente Causal de la Antracnosis del Limón en Texas
Molecular Characterization and Pathogenicity Assays of Colletotrichum acutatum, Causal Agent for Lime Anthracnose in Texas
Amy Ruiz1, Cynthia C. Parra2, John V. da Graça3, Bacilio Salas4, Nasir S. A. Malik5, Madhurababu Kunta6
1 South Texas College, 400 N. Border, Weslaco, Texas 78596.
]]> 2 Texas A & M University-Kingsville Citrus Center, 312 N. International Blvd. Weslaco, TX 78599, USA.3 Texas A & M University-Kingsville Citrus Center, 312 N. International Blvd. Weslaco, TX 78599, USA.
4 USDAAPHIS-PPQ-CPHST, 22675 N Moorefield Rd, Edinburg, TX 78541.
5 USDA-ARS, ERRC, 600 E Mermaid Lane, Wyndmoor, PA 19038.
6 Texas A & M University-Kingsville Citrus Center, 312 N. International Blvd. Weslaco, TX 78599, USA. Correspondence: madhura.kunta@tamuk.edu
Recibido: Junio 12, 2014
Aceptado: Noviembre 05, 2014
Resumen
]]> Varias muestras de fruto, hojas y ramas de limón mexicano [Citrus aurantiifolia (Christm). Swingle] afectadas con síntomas típicos de antracnosis del limón fueron recolectadas de tres árboles en zonas residenciales de Brownsville, Texas. El hongo causante de la antracnosis, Colletotrichum acutatum J. H. Simmonds fue aislado de las muestras de hoja y de fruto. La amplificación de la región de repetición del ADN ribosomal del núcleo usando primers ITS1 y ITS4 y intron 2 del gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa usando GDF y GDR del ADN del hongo resultó en amplicones de aproximadamente 520 pb y 260 pb, respectivamente. La búsqueda de similitud entre las secuencias de nucleótidos obtenidos de los fragmentos de 520 pb y 260 pb con el programa BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool) del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) mostró un grado de identidad del 99% con C. acutatum y del 100% con varias especies de Colletotrichum, respectivamente. Los aislamientos del hongo fueron confirmados como de C. acutatum por amplificación selectiva de un fragmento de PCR de unas 490 bp usando el primer especie específico CaInt2 en combinación con el primer ITS4. El árbol filogenético que fue construido usando los datos de la secuencia del nucleotido ITS separo los aislados de postbloom fruit drop (PFD) y los colocó en el grupo de aislados de key lime anthracnose (KLA). Los ensayos de patogenicidad por inoculación de muestras de hojas, flor, y fruto mostraron que tanto el limón mexicano sin espinas como el limón mexicano común mostraron síntomas típicos de key lime anthracnose (KLA), mientras que hojas inoculadas del toronjo Rio Red, el Naranjo dulce Valencia, el limón Bearss, el limón pink Eureka, el limequat Eustis, el limón Ponderosa, la lima kaffir, el limón sin semilla Lisbon, y el limón Meyer no desarrollaron ninguna lesión.Palabras clave adicionales: Lima, antracnosis, Colletotrichum acutatum, cítricos.
Abstract
Several distorted Mexican lime [Citrus aurantiifolia (Christm). Swingle] fruit, leaf, and twig samples with lime anthracnose symptoms were collected from three trees in residential areas of Brownsville, Texas. The causal fungal organism, Colletotrichum acutatum J. H. Simmonds was isolated from leaves and fruit. Amplification of nuclear ribosomal DNA repeat region using ITS1 and ITS4 primers and intron 2 of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene using GDF and GDR from fungal DNA resulted in approximately 520 bp and 260 bp amplicons, respectively. Similarity search for the nucleotide sequences obtained from 520 bp and 260 bp fragments at Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn) program showed 99% identity to C. acutatum and 100% identity to several Colletotrichum species, respectively. The fungal isolates were further confirmed as C. acutatum by selective amplification of about 490 bp PCR fragment using species specific primer CaInt2 in combination with primer ITS4. Phylogenetic tree constructed using ITS nucleotide sequence data separated the isolate from the postbloom fruit drop (PFD) isolates and placed it in the group of key lime anthracnose (KLA) isolates. Pathogenicity assays by inoculation of detached leaves, flowers, and fruit showed that thornless Mexican lime and common Mexican lime showed typical symptoms of KLA while inoculated detached leaves of Rio Red grapefruit, Valencia sweet orange, Bearss lime, pink Eureka lemon, Eustis limequat, Ponderosa lemon, kaffir lime, seedless Lisbon lemon, and Meyer lemon did not develop any lesions.
Additional keywords: Key lime, anthracnose, Colletotrichum acutatum, citrus.
El limón mexicano, de las Indias Occidentales o limón [Citrus aurantiifolia (Christm.) Swingle] es un cultivo importante que se utiliza principalmente por su sabor en bebidas y alimentos. Es nativo de la región Indomalaya (Morton, 1987) y las principales regiones productoras de este cultivo incluyen México, la India, las Indias Occidentales y los Cayos de Florida (2). En los EE.UU. el consumo de limones (persas, Tahití, Bearrs y mexicano) ha ido aumentando de manera constante y valor de las importaciones fue de alrededor de $183 millones en 2012, en gran parte proveniente de México (Boriss y Huntrods, 2013).
La antracnosis del limón (KLA) causada por el hongo patógeno Colletotrichum acutatum Simmonds JH (Gloeosporium limetticolum Clausen) (Teleomorfo: Glomerella acutata Guerber y JC Correll), es un problema devastador en el limón mexicano. Esta enfermedad se reportó por primera vez en California en 1912 (Clausen, 1912) y más tarde se encontró en Florida y las Indias occidentales (Antillas y Bahamas) (Fawcett, 1936; Knorr et al., 1957). Knorr et al. (1957) descubrieron que la enfermedad sólo afecta al limón mexicano y al dominicano sin espinas y no afecta a otras variedades de limones como la Tahití (= Bearrs y persas). Además, de que para la patogénesis del C. acutatum en cítricos, es necesario un gen que codifique al regulador de la transcripción del pH putativo (You et al., 2007).
El hongo es conocido por atacar a las hojas jóvenes, ramillas, frutos inmaduros y los botones (Burnett, 1972). Los botones florales infectados se tornan marrones y caen antes de abrir, los frutos jóvenes inmaduros infectados desarrollan lesiones que conducen a frutos deformes y caen antes de tiempo. Los frutos infectados en etapa tardía presentan lesiones grandes y hundidas además de reducción del tamaño del fruto (Knorr et al., 1957; Chen et al., 2005). Esta enfermedad es un problema serio para la producción de limón mexicano en México, Florida y el área del Caribe (Fawcett, 1936). En Texas, la enfermedad se reportó en el verano de 1976 en arboles de limón mexicano que crecían en el Citrus Center de la Universidad de Texas A & I [ahora conocido como el Kingsville Citrus Center de la Universidad de Texas A&M (TAMU-KCC)] en Weslaco, causando graves destrozos en los nuevos brotes así como la caída prematura de flores y frutos jóvenes (Timmer, 1978).
]]> La caída prematura de frutos post- floración (PFD) se reportó por primera vez en Belice en 1979 (Denham, 1979). Ahora se sabe que el C. accutatum JH Simmonds también causa la enfermedad PFD en naranjas dulces, limas y limones, con algunos brotes graves en Florida y Brasil. Sin embargo, es importante señalar que los aislamientos PFD de los cítricos afectados no causaron KLA, mientras que los aislamientos KLA causaron menos PFD en comparación con los aislamientos PFD de naranja dulce afectada (Agostini et al., 1992). Se planteó que las cepas de PFD y del KLA podrían haberse dispersado de forma independiente a lo largo de América en asociación con cada hospedero (Peres et al., 2008).La enfermedad es grave únicamente cuando los nuevos brotes coinciden con períodos prolongados de lluvias. La aplicación frecuente de fungicidas de cobre durante la etapa de brotación puede controlar eficazmente la enfermedad (Timmer, 1978). Además, el benomilo (Benlate 50WP) ha demostrado ser eficaz en el control tanto de KLA como de PFD (Peres et al., 2004) y el benomilo y captafol para controlar PFD (Denham, 1979).
El limón mexicano sólo se cultiva con fines ornamentales y de uso en el hogar, pero, al menos en la actualidad, no se cultiva comercialmente en el Valle Bajo del Río Grande (LRGV), así que el KLA no es una amenaza directa para los cítricos comerciales en LRGV. Sin embargo, es importante para estudiar la enfermedad, identificar y caracterizar el patógeno fúngico ya que los árboles infectados por KLA pueden convertirse en una fuente de propagación del patógeno hacia futuras nuevas áreas de producción de limón comercial.
Los principales objetivos de este estudio fueron identificar al C. acutatum causante del KLA en el limón mexicano de Texas, utilizando herramientas moleculares así como determinar la patogenicidad de los aislados C. acutatum en diferentes plantaciones de cítricos.
MÉTODOS Y MATERIALES
Material vegetal y Aislamiento fúngico. Las hojas sintomáticas de KLA, ramillas y frutos fueron recolectados durante la última semana de septiembre de 2012 por personal del USDAAPHIS y del TAMUKCC de tres arboles diferentes de limón mexicano en un área residencial de Brownsville- TX. Los tejidos afectados de hojas jóvenes y frutos inmaduros se limpiaron en agua corriente durante 10 min, se esterilizo la superficie con etanol al 70% durante 30 s, hipoclorito de sodio al 0.05% durante 1 min, y se lavaron 3 veces con agua destilada estéril (SDW). Pequeños trozos de tejido se colocaron en placas de agar de agua, y se incubaron a 26°C durante 48 h. Los bordes de crecimiento de hifas fúngicas emergentes a partir de piezas de tejido se transfirieron asépticamente a agar de papa dextrosa (PDA), se cultivaron a 26°C, y los cultivos de hongos fueron identificados por sus características y la morfología de sus conidios (Sutton, 1980).
Aislamiento del ADN y PCR. Se aisló el ADN total utilizando el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) de cualquier tejido lesionado de las hojas o el fruto o directamente del micelio del hongo crecido durante tres días en DifcoTM Papa Dextrosa Agar (PDA) a 26°C. El tejido fue colocado en un tubo de 2 ml con el lisado de la matriz A (MP Biomedicals, Santa Ana, CA) con tampón de extracción y se pulverizó durante 3 min usando un Mini-BeadBeater-96 (Biospec Products Inc, Bartlesville, OK). El extracto de ADN total se eluyó en 100 μL de agua libre de nucleasa. Un total de 6 extractos de ADN, incluyendo 3 de tejido infectado y 3 de aislados fúngicos, se analizaron por PCR y se obtuvo la información de la secuencia de nucleótidos. La región de repetición del ADN ribosomal nuclear y los genes que codificaban porciones de la subunidad pequeña y grande del rRNA se amplificaron utilizando los primers ITS1 e ITS4 (White et al., 1990). El intrón 2 del gen de la deshidrogenasa de gliceraldehído 3-fosfato (G3PD) se amplificó usando GDF y los primers GDR (Guerber et al., 2003). La identificación de especies de C. acutatum se realizó mediante amplificación selectiva de una parte de la región del rDNA ITS-5.8S utilizando el primer específico CaInt2 en combinación con el primer ITS4 (Sreenivasaprasad et al., 1996). Los productos de amplificación de PCR se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1%, teñidos con bromuro de etidio, se visualizaron bajo luz UV y se fotografiaron usando el sistema de imágenes BioSpectrum (UVP, Upland, CA). Se cortaron rebanadas finas de gel de agarosa que contenían el amplicon de ADN; el ADN se purificó usando el Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen), y se secuenció en MCLAB (MCLAB, San Francisco, CA). Se analizaron las secuencias de nucleótidos para encontrar similitudes en la base de datos del Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCBI), utilizando el software Blastn y se depositaron en el GenBank. La secuencia de nucleótidos ITS junto con las secuencias publicadas en el GenBank fueron alineados con ClustalW utilizando MEGA6 (Tamura et al., 2013). La historia evolutiva se infirió utilizando el método de "Neighbor-Joining" (Saitou y Nei, 1987). Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de 2-parámetros de Kimura (Kimura, 1980) y el árbol filogenético se construyó usando el MEGA6. El árbol filogenético se evaluó con 1000 repeticiones de arranque para poner a prueba la estabilidad del clado.
Ensayos de patogenicidad. Se obtuvieron un total de 14 hojas inmaduras jóvenes por cada plantío de limón mexicano [C. aurantiifolia (Christm). Swingle], toronja Río Red (C. paradisi Macfad.), naranja dulce Valencia (C. sinensis L. Osbeck), limón Bearss (C. latifolia Tanaka), limón rosa Eureka (C. limon L. Burm.f.), limequat Eustis [C. floridana (J. Ingram & H. Moore) Mabb.], limón Ponderosa (C. limon L. Burm.f.), lima kaffir (C. hystrix), limón Lisboa sin semillas (C. limon L. Burm.f.) y limón Meyer (C. limon L. Burm.f.). Se tuvo cuidado de reducir al mínimo los posibles daños físicos a las hojas mientras se realizaba la recolección. Los conidios de cultivos de hongos de 7-10 d de edad en placas de PDA se lavaron en 2 mL de SDW, se pasaron a través de tela de malla de queso, se diluyeron en SDW y la suspensión de esporas se ajustó a 106 conidios por mL. Se inocularon las hojas en papel filtro húmedo en cajas Petri mediante la colocación de 6 gotas de 20 μL de suspensión de esporas con 3 gotas en cada lado de la nervadura de la hoja, y se incubaron a 26°C. Adicionalmente, se inocularon flores desprendidas de limonero mexicano sin espinas así como flores y fruto desprendidas de limonero mexicano común, usando 20 μL de suspensión de esporas y se incubaron a 26°C. Las hojas, flores y frutos se observaron para buscar cualquier lesión necrótica 6 d después de las inoculaciones.
]]> RESULTADOS
Síntomas típicos del KLA en limón mexicano. Los tres arboles de limón mexicano que fueron afectados por KLA, mostraron los síntomas foliares típicos como son las manchas marrones de circulares a ovaladas, apariencia de un agujero de disparo en las hojas maduras y ramillas con plaga severa, marchitamiento, y muerte (Figura 1 A-C). Los botones de las flores eran marrones y a menudo cayeron antes de abrir dejando cálices persistentes (Figura 1 D-E) y los frutos mostraron lesiones necróticas superficiales hasta grandes fisuras marrones (Figura 1 F-G). Varios frutos inmaduros infectados desarrollaron lesiones marrones, deformes, y cayeron prematuramente.
PCR y secuenciación del ADN. Los estudios realizados por PCR usando los primers GDF/GDR y ITS1/ITS4 en extractos de ADN de cualquier tejido lesionado de hojas y frutos afectados por el KLA, o de los micelios fúngicos dieron como resultado la amplificación de fragmentos de aproximadamente 260 pb y 520 pb, respectivamente (Figura 2). Las secuencias de nucleótidos se obtuvieron para los fragmentos de PCR producidos a partir de la amplificación de extractos de ADN del cultivo de hongos. Las búsquedas de similitudes para los amplicones con el software Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn) mostro un 100% de identidad (valor de E= 2e-132) con varias especies de Colletotrichum [Colletotrichum sp. NBL-2013 colección de cultivos CMM: 4093 (Acceso: KC517164), CMM: 4094 (KC517155), CMM: 4096 (KC517190), CMM: 4097 (KC517189)] y el 99% de identidad (valor de E= 0.0) a C. acutatum, respectivamente.
Por ejemplo, la búsqueda de homología para la secuencia de nucleótidos ITS de 520 pb mostró un 99% de homología con la G. acutata cepa UCA1109 (Acceso: EF622187), y G. acutata (Acceso: FN566877, EU008878). La alineación de esta secuencia con la secuencia de nucleótidos disponibles para C. acutatum (Tipo de cepa IMI117617, Acceso: AF411700) (Hyde et al., 2009) utilizando secuencias BLASTn Align mostraron un 99% de identidad. Las secuencias de nucleótidos fueron depositados en la base de datos del GenBank NCBI (números de acceso: KJ872586 y KJ872587). La amplificación por PCR utilizando especies de C. acutatum con el primer específico CaInt2 y el primer ITS4 dio como resultado un producto de amplificación de 490 pb (Figura 3). Los aislamientos del PFD y del KLA formaron clados distintos en el árbol filogenético (Figura 4) y el aislamiento del KLA de Texas apareció en el mismo clado con otros aislados de KLA que fueron utilizados en el análisis. El KLA, PFD, y el aislado de arándano (EU168904) se agruparon en tres clados diferentes mientras que el aislado de Rhododendron spp. (AF411700) se formó en un clado separado del grupo de aislamientos del PFD.
Aislados fúngicos y Estudios de patogenicidad. Se obtuvieron un total de 18 aislados fúngicos incluyendo 9 de cada uno de los tejidos de muestras afectadas por KLA tanto de hojas como de frutos. Las colonias de hongos fueron de lento crecimiento y los conidios fueron elipsoidales y fusiforme en un extremo. Todos los aislamientos fueron altamente patógenos únicamente en las hojas, frutos inmaduros y flores del limonero mexicano sin espinas y del limonero mexicano común. Las lesiones necróticas graves se presentaron 6 días después de la inoculación (Figura 5 A-E). La inoculación de hojas desprendidas de toronja Río Red, naranja dulce Valencia, limón Bearss, limón rosa Eureka, limequat Eustis, limón Ponderosa, lima kaffir, sin semillas Lisboa limón y limón Meyer no mostró lesiones necróticas (Figura 5 F-N).
]]> DISCUSIÓN
La enfermedad KLA en Texas causada por Gloeosporium limetticolum Clausen (Clausen, 1912) en limón mexicano fue reportada por Timmer (1978). El nombre del patógeno fue modificado a C. gleosporioides y más tarde como C. acutatum basados en la caracterización molecular de la región ITS (Brown et al., 1996). Nuestro estudio confirma que el C. acutatum es el agente causal del KLA en arboles de limón mexicano. Esta conclusión fue basada en la repetición de la región del rDNA (incluyendo espaciadores internos transcritos (ITS) 1 y 2 y el gen que codifica 5.8S rRNA) y de la secuencia de nucleótidos del gen G3PD, el producto de amplificación específica de especies de 490 pb utilizando primers CaInt2 e ITS4, y los ensayos de patogenicidad en diferentes cítricos incluyendo el limón mexicano. Utilizando la región ITS de la secuencia del ADNr, se determinaron las especies de Colletotrichum aislados de fresa y cítricos (Sreenivasaprasad et al., 1994; Brown et al., 1996). Esta región de secuencias y los datos de la secuencia G3PD también se utilizaron para diferenciar los aislados de KLA y PFD y para confirmar que las enfermedades KLA y PFD son causados por C. acutatum, así como las cepas de KLA y PFD que tienen linaje filogenético distinto (Peres et al., 2008). Aunque es difícil de diferenciar los aislados de PFD y KLA basándose únicamente en caracteres morfológicos, ellos son genéticamente muy distintos (Brown et al., 1996). La identificación de especies de C. acutatum se puede realizar por amplificación selectiva de una parte de la región ITS-5.8S del ADNr utilizando CaTnt2 como primer específico en combinación con el primer ITS4 (Sreenivasaprasad et al., 1996; Freeman et al., 2000). Sin embargo, es importante recalcar que en los últimos años, la taxonomía del C. acutatum ha sido extensamente revisada debido a estudios de secuenciación de diferentes genes que han permitido la descripción de nuevas especies en la colección de aislados que anteriormente fueron identificados como C. acutatum (Shiva and Tan, 2009).
Las pruebas de patogenicidad en hojas, frutas y flores revelaron que los hongos aislados obtenidos en este estudio fueron sólo patógenos para el limón mexicano con espinas y el limón mexicano común, mientras que ninguno de los inoculados de C. acutatum tiro las hojas de otras variedades pero desarrollaron lesiones necróticas. Esto confirmo los resultados de los reportes anteriores de que únicamente los aislamientos de KLA causan la enfermedad KLA en el follaje de los limoneros mexicanos (Brown et al., 1996). Se encuentra reportado también que los aislados de KLA causaron necrosis a aproximadamente 30 al 60% del área foliar de las hojas inoculadas de lima mientras que los aislamientos de PFD no formaron lesiones necróticas en las hojas inoculadas de lima (Peres et al., 2008). Por otra parte, las flores de naranjo dulce inoculadas con aislamientos de KLA, presentaron síntomas de PFD (Agostini et al., 1992; Timmer et al., 1994). Un estudio reciente utilizando aislamientos de C. acutatum de antracnosa reporta haber afectado a la fresa, al helecho y al limón mexicano; mientras que "ripe-rot" afecto al arándano y el PFD afecto a la naranja dulce demostrando que es poco probable que una cepa patógena de un host se traslade a otro host y provoque una epidemia (MacKenzie et al., 2009).
Las pruebas de patogenicidad confirmaron los reportes anteriores de Knorr et al. (1957), quienes mencionan que el limón Bearss es resistente a KLA. Estos resultados son muy importantes para los productores de limón mexicano, ya que ellos son los que exportan en gran parte el limón Bearss, limón mexicano y aceite de limón para el mercado estadounidense. La reciente caída en la producción de limón en México debido a condiciones meteorológicas adversas y enfermedades devastadoras como el Huanglongbing, dieron como resultado una fuerte crisis de limón y un drástico aumento del precio en los EE.UU. Este es el primer estudio que reporta datos de la secuencia de nucleótidos de C. acutatum causante del KLA en limón mexicano en Texas así como pruebas de patogenicidad para aislados de C. acutatum en diferentes cultivos de cítricos para confirmar la identidad del patotipo.
CONCLUSIONES
El agente causal de la enfermedad de KLA en Texas se confirmó ser el C. acutatum de acuerdo a la morfología de los hongos, datos de la secuencia de nucleótidos y pruebas de patogenicidad. Este hongo se había reportado anteriormente como Gloeosporium limetticolum Clausen (Timmer, 1978). Las pruebas de patogenicidad en diferentes cultivos de cítricos mostraron que el C. acutatum únicamente es patogénico para el limón mexicano sin espinas y el limonero mexicano común, mientras que otros cultivos de cítricos son resistentes a este patógeno. Diferentes partes de la planta del limón mexicano sin espinas y del limón mexicano común, incluidas las flores, frutos y las hojas fueron muy susceptibles a la infección por C. acutatum.
Agradecimientos. Los autores agradecen sinceramente al Dr. Juan C. Melgar, Sra. Beatriz Contreras y a la Sra. Hilda S. del Río por la traducción del resumen del Inglés al Español.
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