Detección de Virus que Afectan al Cultivo de Chile (Capsicum annuum L.) en Chihuahua, México

Detection of Virus Affecting Chilli Pepper Crop (Capsicum annuum L.) in Chihuahua, Mexico

Ana Cecilia González Franco¹, Emma Monserrath Gill Langarica¹, Loreto Robles Hernández¹, Abelardo Núñez Barrios¹, Ramona Pérez Leal¹, Ofelia Adriana Hernández Rodríguez¹, Luis Pérez Moreno²

¹ Facultad de Ciencias Agrotecnológicas, Universidad Autónoma de Chihuahua, Ciudad Universitaria s/n Campus 1, Chihuahua, Chihuahua, CP 31310, México. Correspondencia: lrobles@uach.mx

Recibido: Julio 29, 2014
Aceptado: Septiembre 26, 2014

Resumen

El objetivo del presente trabajo fue determinar la incidencia de 12 virus presentes en las dos regiones productoras de chile en el estado de Chihuahua. Se colectaron 203 muestras foliares sintomáticas en 10 localidades de las regiones centro-sur y norte del Estado y se analizaron mediante la técnica DAS-ELISA, utilizando anticuerpos policlonales específicos. La incidencia y severidad de infecciones de tipo viral fueron superiores en la zona norte. CMV, TMV, AMV, TEV, TBSV, PMMoV, PVY y PepMV se detectaron en la región centro-sur, mientras que en la región norte se identificaron TRSV, TBSV, INSV, TEV, CMV, TMV PVY, TSWV y ToRSV. Cinco de los virus detectados fueron comunes en las dos regiones. CMV y TMV fueron predominantes en la región centro-sur, y TRSV y TBSV lo fueron en la región norte. El 44% de las muestras positivas para la región centro-sur fueron infecciones mixtas, mientras que para la norte fueron el 78%. Este es el primer estudio que reporta la presencia de 12 especies de virus e infecciones múltiples en el cultivo de chile del estado de Chihuahua y el primero en reportar al TBSV en el cultivo de chile en México.

Palabras clave adicionales: DAS-ELISA, CMV, TMV, AMV, TRSV, TBSV, INSV.

Abstract

Additional keywords: DAS-ELISA, CMV, TMV, AMV, TRSV, TBSV, INSV.

México ocupa el primer lugar en producción de chile verde (Capsicum annuum L.) a nivel mundial con una superficie sembrada de 138,188.21 ha y una producción de 2,379,735.80 t (SAGARPA, 2012). Este cultivo es uno de los más importantes en México por su rentabilidad y alta demanda de mano de obra (Pérez y Rico, 2004). A nivel nacional, Chihuahua ocupa el primer lugar en producción con 562,166.53 t y el tercer lugar en valor de la producción con una aportación de casi dos billones de pesos. En Chihuahua la producción de chile se centra en las regiones centro-sur y norte. En la zona norte se sembraron 13,098.36 ha en el 2012, con una producción de 195,988.7 t y un valor de producción por arriba de 817 millones de pesos, equivalente a un 41.7% del total de la aportación estatal. Los principales municipios que conforman esta zona son Ascensión, Buenaventura, Galeana, Janos, Constitución y Nuevo Casas Grandes. En la región centro-sur se sembraron 9,588.52 ha, con una producción de 371,521.41 t y un valor de producción superior a un billón de pesos, equivalente a un 57.5% del total de la aportación en el Estado, en el 2012. Esta zona está constituida principalmente por los municipios de Allende, Camargo, Delicias, Jiménez, Julimes, Meoqui y Rosales (SAGARPA, 2012). En el cultivo de chile, las enfermedades representan uno de los factores de riesgo para su rentabilidad por lo que resulta necesario protegerlo del ataque de los diferentes patógenos. En los últimos años las enfermedades causadas por virus han ocasionado pérdidas económicas importantes debido a la reducción en la producción de diferentes cultivos hortícolas en México (Astier et al., 2007). Estas pérdidas varían cada año, y han estado en función del manejo del cultivo y las condiciones climáticas, alcanzando en algunos casos pérdidas hasta de un 100% (Vidales y Alcantar, 1989). Las plantas infectadas por virus tienen un ciclo vegetativo más corto y los síntomas más comunes son ampollamiento, enanismo, mosaicos, moteados, necrosis, clorosis y deformaciones (Murphy y Warren, 2003; Agrios, 2005; Astier et al., 2007). Estas enfermedades se han incrementado en casi todas las regiones de México, convirtiéndose en uno de los problemas de mayor importancia en los cultivos hortícolas (Pérez y Rico, 2004). Para realizar un control eficiente de una enfermedad es importante identificar el agente causal, ya que una buena identificación de éste garantiza el éxito en las medidas de su control (González y Delgadillo, 1989). En el caso específico de las enfermedades de tipo viral, no es suficiente el reconocimiento de los síntomas, ya que los síntomas causados por los diferentes virus a veces son similares (Pérez-Moreno et al., 2004), o se confunden con daños por herbicidas o por desbalances nutricionales. Además, las plantas pueden estar infectadas simultáneamente por más de un virus, por lo que es importante utilizar técnicas de diagnóstico especializadas que permitan la identificación plena de los agentes virales (Harris, 1994). Entre estas técnicas, la prueba de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, por sus siglas en inglés) ha sido una de las más utilizadas en detección de virus en plantas (Cruz y Frías, 1997). A nivel nacional se han reportado hasta 13 especies de virus con genomas de ARN asociados con enfermedades en el cultivo de chile (Núñez et al., 1996; Pérez y Rico, 2004; Robles et al., 2010); sin embargo, ninguna de estas especies se ha descrito en el estado de Chihuahua. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar la incidencia de las especies virales presentes en el cultivo de chile de las dos principales regiones productoras de este cultivo en el estado de Chihuahua. En ambas regiones productoras de chile se determinaron las variables incidencia y severidad de la virosis en campo, detección de especies virales, proporción de virus detectados por localidad y análisis de infecciones múltiples.

MATERIALES Y MÉTODOS

Determinación de la incidencia y severidad. Se realizaron recorridos de campo en la etapa de desarrollo y fructificación del cultivo para determinar la incidencia y severidad en plantas de chile que presentaban síntomas característicos de una probable enfermedad de tipo viral en cuatro localidades de la región centro-sur y en seis localidades de la región norte del estado de Chihuahua (Figura 1). En cada localidad se seleccionaron tres predios para su evaluación. Para medir la incidencia se seleccionó el 10% del total de surcos distribuidos a lo largo y ancho de cada predio. Se hizo el conteo de plantas aparentemente sanas y plantas que presentaban síntomas característicos de enfermedades virales, tales como mosaicos, moteado, deformación de hojas, clorosis, ampollamiento y enanismo.

La incidencia se calculó con base en la proporción de las plantas sintomáticas con respecto al total de plantas en cada sitio muestreado. La severidad se determinó en cada predio mediante una escala arbitraria de 5 categorías, donde 0 = plantas sanas, 1 = 1-25% de daño, 2 = 25.1-50% de daño, 3 = 50.1-75% de daño y 4 = 75.1-100% de daño. El índice de severidad se estimó por medio de la siguiente fórmula:

IS= (2n.v/5N)*100

Colecta de muestras en campo. La colecta de muestras foliares con sintomatología característica de enfermedades virales en chile se realizó de acuerdo a la metodología de Hernández et al. (1998) durante los meses de junio, julio y agosto de 2008 en la región centro-sur y en julio y agosto de 2009 en la región norte. En la primera región se obtuvieron 129 muestras distribuidas por cada localidad (CS1, n=43; CS2, n=9; CS3, n=54; CS4, n=23) y en la región norte 74 muestras (N1, n=20; N2, n=9; N3, n=7; N4, n=18; N5, n=12; N6, n=8). Las muestras se colectaron en bolsas de plástico y se colocaron en una hielera acondicionada a 4°C para su transporte al laboratorio, en donde se almacenaron temporalmente a -20°C hasta su procesamiento.

Procesamiento de las muestras. Las muestras se procesaron en el laboratorio de Fitopatología de la División de Ciencias de la Vida (DICIVA-CIS-UG) y en el laboratorio de Microbiología Aplicada, Fitopatología y Fisiología Poscosecha de la Facultad de Ciencias Agrotecnológicas, UACH. Para la detección de los virus se utilizó la técnica de inmunoadsorción enzimática en fase sólida tipo sándwich (DAS-ELISA) según las recomendaciones del fabricante (Agdia Inc., 2008 y 2009), la cual se realiza en dos días (Clark y Adams, 1977; Cruz y Frías, 1997). En los ensayos se utilizaron los anticuerpos policlonales específicos para la detección de los virus TEV (Tobacco etch virus), CMV (Cucumber mosaic virus), PVY (Potato virus Y), TMV (Tobacco mosaic virus), PMMoV (Pepper mild mottle virus), PepMV (Pepper mottle virus), AMV (Alfalfa mosaic virus), TRSV (Tobacco ring spot virus), TBSV (Tomato bushy stunt virus), ToRSV (Tomato ring spot virus), INSV (Impatient necrotic spot virus) y TSWV (Tomato spotted wilt virus).

Origen de los antisueros. Los anticuerpos se obtuvieron de la compañía Agdia Inc., USA en 2008 y 2009, los cuales se preservaron de acuerdo a las recomendaciones del fabricante hasta el momento de realizar los bioensayos.

Obtención de lecturas. Las lecturas de absorbancia se obtuvieron utilizando un lector de microplacas marca BioRad, modelo 3550-UV a una longitud de onda de 405 nm, ya que en el sistema de detección de los virus estudiados se utilizó la enzima fosfatasa alcalina.

Determinación del límite de detección. El límite de detección se determinó considerando como positivas todas las muestras que tuvieron un valor de absorbancia dos veces mayor al promedio del valor de la absorbancia del control negativo; por lo que todo valor de absorbancia obtenido de las muestras que estuviera por arriba de este límite, se consideró positivo.

RESULTADOS

Incidencia y severidad de la virosis. La incidencia y severidad se determinó en plantas de chile que presentaban síntomas característicos de infecciones de tipo viral. En la región centro-sur, se observó una mayor incidencia e índice de severidad en la localidad CS4 con valores de 15.9% y 5.4%, respectivamente, siendo mayor la categoría 1 en la escala de severidad. Lo anterior muestra que aunque se tienen menor cantidad de plantas en la categoría 4, el avance de la enfermedad es muy importante, lo cual podría incrementar la diseminación de las enfermedades virales, causar la pérdida de plantas y reducir de manera importante la producción de chile. Por otro lado, las localidades CS1, CS2 y CS3 fueron similares en las variables de incidencia (3.9%, 3.7% y 4.3%, respectivamente) e índice de severidad (1.3%, 1.7% y 1.7%, respectivamente) (Figura 2). En la región norte, las localidades N1 y N3 presentaron la mayor incidencia de plantas con síntomas de tipo viral con valores de 23 y 25%, respectivamente, mientras que los valores más bajos de ésta variable se presentaron en la localidad N6; sin embargo, esta última localidad presentó el índice de severidad más alto con un 47.7%, predominando la categoría 4 en la escala de severidad (Figura 3).

Detección de virus. De las regiones evaluadas, se detectaron ocho virus en la centro-sur y nueve virus en la norte; obteniéndose cinco virus en común: TMV, CMV, TBSV, TEV y PVY. De 129 muestras foliares con sintomatología de tipo viral procedentes de la región centro-sur, 89 fueron positivas para al menos un tipo de virus. En esta región se detectaron los virus CMV, TMV, AMV, TBSV, PMMoV, TEV, PVY y PepMV; los dos primeros presentaron la mayor frecuencia con valores de 36% y 20% respectivamente. Los virus menos frecuentes fueron PVY (5%) y PepMV (1%). Por otro lado, 42 de 74 muestras foliares procedentes de la región norte resultaron positivas para al menos alguno de los siguientes virus: TRSV, TBSV, INSV, TEV, CMV, TMV, PVY, TSWV y ToRSV; los virus TRSV (53%) y TBSV (42%) fueron los más frecuentes mientras que TSWV (3%), PVY (3%) y ToRSV (1%) se presentaron con la menor frecuencia (Figura 4).

Infecciones múltiples. De las muestras positivas analizadas por DAS-ELISA en la región centro-sur, el 55% de ellas fueron positivas para un solo virus, el 29% para dos tipos virus y 9% para muestras infectadas con tres tipos de virus; también se detectaron muestras infectadas con cuatro, cinco y seis virus en un menor porcentaje. Los virus TMV y CMV se presentaron en casi todas las combinaciones (Cuadro 3). En la región norte, el 21.4% de las muestras fueron positivas para un solo virus; también se detectaron combinaciones de dos, tres, cuatro y cinco virus, siendo las dos primeras las más comunes con valores de 40.5% y 19%, respectivamente (Cuadro 4). El virus TRSV se presentó en todas las combinaciones, mientras que TBSV estuvo presente en casi todas. Los virus INSV, TEV, TMV solo se presentaron en las combinaciones de tres a cinco virus (Cuadro 4).

DISCUSIÓN

En el presente estudio se evaluó la incidencia y severidad de plantas de chile con sintomatología característica de tipo viral en las regiones centro-sur y norte del estado de Chihuahua. Asimismo, se detectó la presencia de 12 especies de virus en muestras foliares y con ello se determinó su frecuencia y complejidad viral.

En la región norte se presentaron los valores mas altos de incidencia e índice de severidad. Esta diferencia podría estar relacionada con el manejo del cultivo, ya que los sistemas de producción en dicha región son menos tecnificados que en la centro-sur. Sepúlveda et al. (2005) mediante la instalación de acolchado y aplicaciones de hierro, obtuvieron un bajo porcentaje de infección y desarrollo de la virosis hasta en un 8.2% de incidencia, mientras que sin acolchado pero con la aplicaciones de hierro tuvieron una incidencia de un 24.4%. Por otra parte, Guigón-López y González-González (1999) encontraron que las combinaciones chile-sorgo y chile-maíz disminuyeron la incidencia de la virosis hasta en un 39% y retrasaron el desarrollo de sintomatología de tipo viral en un 60%. Asimismo, las condiciones climáticas podrían jugar un papel importante en el desarrollo de las enfermedades virales. Guigón-López y González-González (1999) reportaron que la siembra de abril era mejor que la de mayo, reflejándose en la reducción de la incidencia, la tasa de infección aparente y el desarrollo de la sintomatología de tipo viral.

Tun-Azul et al. (2004) reportaron una incidencia de la virosis en el cultivo de chile del 87% y un índice de severidad del 3%. En nuestro estudio, la incidencia fue menor pero el índice de severidad fue similar para algunas localidades de la región centro-sur; sin embargo, el índice de severidad promedio de la región norte fue superior al reportado por dichos autores.

De las dos regiones evaluadas, se detectaron ocho virus en la región centro-sur y nueve en la norte, de los cuales cinco fueron en común; sin embargo, los virus más abundantes fueron diferentes entre regiones. En la región centro-sur, los virus que se detectaron con mayor frecuencia fueron CMV, TMV y AMV, los cuales están distribuidos en todo el mundo (Alonso-Prados et al., 1998; Hull, 2002; Himmel, 2003). El CMV es uno de los virus de mayor importancia debido a su impacto económico (Alonso-Prados et al., 1998), a su extensivo rango de hospederos (Hull, 2002) y a su eficiente transmisión de manera no persistente por más de 75 especies de áfidos, así como por su transmisión mecánica y por semilla (Murphy, 2003; Astier et al., 2007); lo anterior, se puede considerar para tomar acciones preventivas en nuestra región mediante un manejo integrado de plagas, así como usar semilla certificada y evitar en lo posible la manipulación de plantas. El TMV se ha caracterizado por infectar cultivares del género Capsicum, en donde ocasiona pérdidas en la producción de hasta un 70% en cultivares susceptibles. La frecuencia de este virus se incrementa en el cultivo de chile por la manipulación de plántulas durante el trasplante o durante el desarrollo de las plantas, ya que este virus se transmite mayormente por contacto y mecánicamente (Himmel, 2003). Además, con frecuencia los trabajadores fuman durante los horarios de trabajo, lo cual es un riesgo de contaminación para iniciar las infecciones con este virus debido a que el TMV mantiene su estructura y actividad en la ceniza del cigarro cuando el tabaco proviene de un campo infectado con el virus (Hull, 2002). El AMV infecta una amplia gama de cultivos agrícolas de importancia económica; es causa de importantes pérdidas en los cultivos de chile en países como Bulgaria, Hungría, Yugoslavia, México y Estados Unidos de Norteamérica. La frecuencia de este virus se incrementa cuando el cultivo de chile se encuentra cerca de las plantaciones de alfalfa y puede causar pérdidas en el rendimiento del cultivo hasta en un 65% (Hull, 2002). Este virus podría ser un riesgo importante en esta región, ya que por lo general también se produce alfalfa y es frecuente encontrar plantaciones de este cultivo cercanas a los campos de chile, favoreciendo el flujo de insectos vectores entre los cultivos y con ello la diseminación del virus. El AMV es transmitido de manera no persistente por al menos 14 especies de áfidos, incluyendo el áfido verde del durazno, el áfido del chícharo y el áfido azul de la alfalfa (Hull, 2002; Creamer, 2003; Astier et al., 2007).

Por otro lado, el virus PVY se encontró en las cuatro localidades de la región centro-sur, por lo que es importante conocer su biología y su distribución para tomar acciones preventivas de control. El PVY también se ha reportado en Puebla, Toluca, Coahuila y Nuevo León y es considerado uno de los virus más dañinos en plantas de chile, tomate y tabaco, ya que causa pérdidas económicas importantes en estos cultivos (Luis-Arteaga y Ponz, 2003). Pueden distinguirse muchos grupos de razas de PVY de acuerdo a la severidad de síntomas que causa en chile. Fanigliulo et al. (2005) reportaron una cepa recombinante de PVY (PVY^NNP) que induce necrosis venal en chile; asimismo, Llave et al. (1999) reportaron los patotipos de PVY 0, PVY 1 y PVY 1-2 en el cultivo de chile. Este virus se transmite por semilla y por áfidos en forma no persistente; el áfido Myzus persicae es la especie más eficiente en muchas regiones (Hull, 2002; Luis-Arteaga y Ponz, 2003), el cual debería de monitorearse en esta región para tomar acciones de control antes de que éste represente un riesgo para el cultivo de chile. Aunque los virus INSV, TRSV, ToRSV y TSWV se han reportado en México afectando el cultivo de chile, no fue posible su detección en ninguna de las localidades estudiadas en esta región. Lo anterior sugiere que la región centro-sur podría estar libre de estos virus y por lo tanto se deberían tomar acciones para prevenir su entrada, ya que estos virus en general son de fácil transmisión si no se tiene cuidado al momento de seleccionar la semilla o manipular las plántulas tanto en invernadero como en campo.

En la región norte, los virus con mayor frecuencia fueron TRSV, TBSV e INSV. Rodríguez et al. (2004) en un estudio de detección de enfermedades virales en Venezuela, reportaron que el virus TRSV presentó una incidencia del 59%, la cual fue similar a los resultados obtenidos para este virus en la región norte. Este virus se transmite mecánicamente, por semilla y por nematodos (Hull, 2002; Atier et al., 2007). La diseminación por nematodos sería poco eficiente debido a la baja movilidad de éstos a grandes distancias dentro de las plantaciones (Hull, 2002). Su importancia está en que podrían ser diseminadores de virus a partir de inóculo primario, básicamente a plantas vecinas o a corta distancia cuando se utiliza riego por surcos y eventualmente pueden ser movidos a grandes distancias con restos de suelo en implementos mecanizados (Rodríguez et al., 2004).

El virus INSV se encuentra distribuido a nivel mundial (Kuo et al., 2014; Elliott et al., 2009). Este virus es devastador de plantas ornamentales, detectado por primera vez en Nueva Zelanda, y donde se siguen realizando estudios de distribución del virus en diversos hospederos (Elliott et al., 2009); su dispersión mundial se le atribuye principalmente a su vector, el trips Frankliniella occidentalis. Aunque el INSV no es muy frecuente en cultivos a cielo abierto, Kuo et al. (2014) reportaron su presencia en cultivos de lechuga en California, EUA con resultados devastadores; González-Pacheco y SilvaRosales (2013) lo reportaron por primera vez en plantas de tomatillo y de chile en México a través de una evaluación en los estados de Guanajuato y Querétaro. En el presente estudio, se detectó el INSV por primera vez en la región norte del estado de Chihuahua, con una frecuencia alta.

La mayor diversidad e incidencia de virus se registró en las localidades CS2 con siete virus, donde destacan por su incidencia AMV, TMV y PMMoV y N4 con ocho virus, destacando por su incidencia TBSV, TRSV e INSV (Cuadros 1 y 2). Lo anterior convierte a estas localidades en una fuente de dispersión de los virus detectados.

Infecciones múltiples. De las dos regiones productoras de chile en el estado de Chihuahua, el 44% de las muestras positivas de la región centro-sur mostraron infecciones virales mixtas en combinaciones de dos a seis virus (Cuadro 3); en la región norte, del total de muestras positivas, el 78% se relaciona con infecciones mixtas con combinaciones de dos a cinco virus (Cuadro 4). Garzón-Tiznado et al. (2005) encontraron un 49% de infecciones mixtas en chile en la región centro-norte del pacífico mexicano, coincidiendo a lo reportado en este estudio para la región centro sur; pero con un valor inferior al de la región norte. Asimismo, estos autores reportaron la combinación TEV-CMV como la más frecuente, similar a lo detectado en la región centro-sur de este estudio. Afouda et al. (2013) obtuvieron infecciones mixtas de dos y tres virus, coincidiendo solamente con la mezcla de CMV-TMV de la región centro-sur, que fue una de las más abundantes. Las combinaciones CMV-TMV y CMV-TRSV fueron detectadas en un trabajo previo en el cultivo de chile en Venezuela (Rodríguez et al., 2004), las cuales coinciden con las combinaciones más abundantes para la región centro-sur y norte, respectivamente de este estudio. Green (2003) reportó infecciones virales múltiples de PMMoV-TMV y PMMoV-ToMV en cultivos de chile a campo abierto, coincidiendo la primera combinación con este estudio para la región centro-sur, pero no fue de las más frecuentes. Otros autores reportan que la mezcla PMMoV-PVY-TEV ocurre frecuentemente en campos cultivados con chile (Hull, 2002; Murphy y Zitter, 2003), pero ésta no se presentó en ninguna combinación de tres virus en las dos regiones evaluadas en Chihuahua. El INSV se ha encontrado en infecciones mixtas con el TSWV (Elliott et al., 2009; Kuo et al., 2014); pero en este estudio, se detectó en infecciones triples asociado siempre a TRSV y TBSV y sólo en infecciones de cinco virus, el INSV se detectó con el TSWV.

CONCLUSIONES

La incidencia y el índice de severidad de plantas con síntomas de tipo viral en el cultivo de chile fueron mayores en la región norte. En la región centro-sur se detectaron los virus CMV, TMV, AMV, TEV, TBSV, PMMoV, PVY y PepMV, y en la región norte fueron TRSV, TBSV, INSV, TEV, CMV, TMV PVY, TSWV y ToRSV. Los virus CMV, TMV y AMV predominaron en la región centro-sur y TRSV, TBSV e INSV en la región norte. Cerca de la mitad de las muestras positivas en la región centro-sur y la mayoría de las de la norte fueron infecciones virales mixtas. En la región centro-sur se presentaron infecciones de hasta de seis virus, mientras que en la norte hasta de cinco; las infecciones mixtas de dos virus fueron las más abundantes en ambas regiones. El TMV se presentó en casi todas las infecciones mixtas en la región centro-sur, mientras que en la norte, la asociación TRSV-TBSV estuvo en casi todas las combinaciones. Este es el primer estudio que reporta la presencia de 12 especies de virus y el primero en mostrar las infecciones mixtas en el estado de Chihuahua. Asimismo, el TBSV se reporta por primera vez en el cultivo de chile en México. Con lo anterior, es necesario concientizar a los productores de chile para que lleven a cabo un buen manejo del cultivo en todas las etapas del sistema de producción para prevenir infecciones virales. Con este estudio se podrían iniciar nuevos trabajos de investigación relacionados con la caracterización de las especies virales detectadas.

Agradecimientos. Los autores agradecen a la Fundación Produce-Chihuahua y al Consejo Estatal de Productores de Chile del estado de Chihuahua por financiar esta investigación, Clave: 08-2007-004.

LITERATURA CITADA

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