Etiología de la Marchitez de Plantas de Chayote (Sechium edule) en el Estado de Veracruz

Etiology of Chayote (Sechium edule) Wilting Plants in the State of Veracruz

Gildardo Olguín Hernández¹, Guadalupe Valdovinos Ponce¹, Jorge Cadena Íñiguez² y Ma. de Lourdes Arévalo Galarza³

¹ Postgrado en Fitosanidad-Fitopatología, Colegio de Postgraduados, Km 36.5 Carretera México-Texcoco, Montecillo, Texcoco Edo. de México. CP 56230, México. Correspondencia: gvapon@colpos.mx

³ Postgrado en Recursos Genéticos y Productividad- Fruticultura, Colegio de Postgraduados, Km 36.5 Carretera México-Texcoco, Montecillo, Texcoco Edo. de México. CP 56230, México.

Recibido: Junio 05, 2013
Aceptado: Enero 08, 2014

Resumen

México es el principal productor y exportador de chayote (Sechium edule) verde liso a nivel mundial. En Veracruz, en donde se produce más del 70 % del volumen nacional, la marchitez de plantas se presentó desde 1990 como uno de los problemas fitosanitarios principales del cultivo. El objetivo de este trabajo fue determinar la etiología de la marchitez de plantas de chayote en la región Centro del estado de Veracruz. En el ciclo de producción 2011-2012, se muestrearon 14 plantas con marchitez y se obtuvieron las raíces cercanas a la zona de origen de brotes nuevos. Se cortaron 30 segmentos de la zona de avance del tejido necrosado, se desinfestaron en hipoclorito de sodio al 3 %, se lavaron con agua estéril y se sembraron en los medios de cultivo PARPNH, PDA y V8-agar. En condiciones de invernadero, se inocularon las guías basales de 60 plantas mediante la colocación de esporangios. Los síntomas aparecieron 22 d después de la inoculación como marchitamiento y amarillamiento foliar. De las plantas inoculadas se re-aisló e identificó molecular y morfológicamente a Phytophthora capsici, reportándolo por primera vez en México como el agente causal de la marchitez de plantas de S. edule en Veracruz.

Palabras clave: Phytophthora capsici, marchitamiento, diagnóstico, identificación molecular.

Mexico is the main producer and exporter of smooth green chayote (Sechium edule) worldwide. In the state of Veracruz, where it is produced more than 70 % of the national volume, wilting of chayote plants has been there since 1990 as an important phytosanitary problem. The objective of this work was to determine the etiology of wilting plants of chayote in the Central region of state of Veracruz. During the 2011-2012 production cycle, 14 plants with wilting symptoms were sampled, and roots were harvested at the shoot emerging zone. Thirty segments were dissected at the advancing zone of necrotic tissue, disinfested with 3 % sodium hypochlorite, washed with sterile distilled water and cultured onto PARPNH, PDA and V8-agar media. The basal guides of 60 plants were inoculated by sporangium deposition and kept under greenhouse conditions. Symptoms appeared 22 d after inoculation as wilting and yellowing of leaves. Phytophthora capsici was reisolated from the inoculated plants, and identified molecular and morphologically for first time in Mexico as the causal agent of the S. edule wilting plants in Veracruz.

Keywords: Phytophthora capsici, wilting, diagnosis, molecular identification.

El fruto de chayote (Sechium edule (Jacq.) Sw.) se cosecha en madurez hortícola a los 18 ± 2 días después de antesis (Aung et al., 1996; Cadena et al., 2007) y se consume principalmente como verdura. El cultivo evolucionó comercialmente de hortaliza de traspatio a producto de exportación con amplia demanda en Estados Unidos y Canadá, ubicándose dentro de las hortalizas no tradicionales de mayor importancia en la exportación nacional (Cadena et al., 2001). Tiene importancia social por la mano de obra que demanda, ya que en una huerta comercial de 4 ha se emplean de 30 a 35 personas (80 % mujeres) por un periodo de 6 a 9 meses; además, debido a que el fruto se puede dañar fácilmente, su cosecha y empaque requieren mano de obra adicional (GISeM, 2008).

Como resultado del éxito comercial del chayote en los mercados de Norteamérica, la superficie de la producción nacional como monocultivo ha aumentado considerablemente, lo que generó la aparición de problemas fitosanitarios, principalmente la marchitez de plantas, que no solo limitan el volumen y la calidad de la producción, sino también ponen en riesgo las fuentes de empleo (GISeM, 2011).

En México, la zona de producción de chayote más importante se ubica en la región central de Veracruz, en los municipios de Coscomatepec, Huatusco, Ixhuatlán del Café, Chocamán, Tlilapan, Orizaba, Rafael Delgado, Amatlán de los Reyes, Cuichapa e Ixtaczoquitlan (Cadena et al., 2010).

Durante los meses de mayor precipitación (junio-noviembre), incrementa la incidencia de plantas de chayote con síntomas de marchitez por pudrición de raíces. Los productores asocian estos síntomas con Phytophthora sp. y aplican para su control fungicidas a base de metalaxyl, lo cual reduce la incidencia; sin embargo, no existen reportes que indiquen que Phytophthora sp. sea el agente causal. Olguín (2010), reportó la asociación de Fusarium oxysporum y F. sambucinum con los mismos síntomas, pero el estudio no comprobó que estos hongos fueran los agentes causales primarios de la enfermedad. La falta de conocimiento sobre la etiología de este problema fitosanitario ha mermado la productividad del cultivo y debido a la aplicación indiscriminada de fungicidas, se han incrementado los costos de producción y el riesgo de seleccionar organismos resistentes al metalaxyl y mefenoxam, sin que exista un control eficiente (FRAC, 2012; Jackson et al., 2010; Café y Ristiano, 2008; Lamour y Hausbeck, 2000). Con base en estos antecedentes, el objetivo de este estudio fue determinar la etiología de la marchitez de plantas de chayote en huertas comerciales de dos localidades de la región central de Veracruz.

MATERIALES Y MÉTODOS

Caracterización de síntomas y aislamiento de microorganismos. Se recorrieron parcelas comerciales de chayote verde liso en los meses de junio, agosto y octubre del 2011. Las plantas con síntomas de marchitez se localizaron de forma visual por la flacidez y coloración oscura de las hojas (Figura 1A) y por la consistencia blanda de apariencia acuosa de las guías basales. Se cortó la zona de transición entre el tallo y la raíz (zona de origen de brotes nuevos en donde la corteza y el tejido vascular presentaron lesiones de apariencia necrótica y exudados) (Figura 1 B) de 11 y 3 plantas recolectadas en Coscomatepec y Huatusco respectivamente, para hacer el aislamiento de microorganismos.

Pruebas de patogenicidad

Aislamiento de microorganismos. La zona de transición entre el tallo y las raíces de cada una de las 14 plantas se disectó en 30 fragmentos de 5 mm de longitud. Las 420 muestras obtenidas se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 3 % por 4 min, se lavaron por 3 min con agua destilada estéril y se secaron completamente con sanitas esterilizadas. Las muestras se cultivaron equitativamente en PARPNH (jugo V8 con pimaricina 0.01 g, ampicilina 0.25 g, rifampicina 0.01 g, pentacloronitrobenzeno 0.05 g e himexazol 0.05 g) (Erwin y Ribeiro, 1996), PDA y V8 (jugo V8 300 mL, CaCO₃ 4.5 g, agar 20 g) acidificado con ácido láctico al 25 % durante 48 h a 30 ± 2 °C en oscuridad continua.

Los hongos y oomicetes que crecieron se transfirieron y purificaron en PDA y V8-agar frescos mediante las técnicas de cultivos monoconidiales y monozoospóricos, respectivamente. Los oomicetes purificados se utilizaron para realizar las pruebas de patogenicidad e identificación (Erwin y Ribeiro, 1996; Gallegly y Hong, 2008; Barnett y Hunter, 2006; Leslie y Summerell, 2006).

Preparación del inóculo. El inóculo se preparó a partir del microorganismo que tuvo el valor más alto en la frecuencia de aislamientos, y se obtuvo de cultivos de 6 días de crecimiento en medio V8-agar. Cinco rodajas de medio de cultivo con crecimiento micelial de 1.0 cm de diámetro se transfirieron a 100 mL de medio V8-líquido con dos gotas de ácido láctico al 25 %. El oomicete se cultivó a 25 ± 2 °C sin agitación y después de 5 d se transfirió a cajas Petri de 90 mm de diámetro con 6 mL de agua destilada estéril. Los cultivos se mantuvieron bajo luz blanca a 25 ± 2 °C durante 24 h para inducir la formación de esporangios. La concentración del inóculo se ajustó a 11,500 esporangios mL^-1.

Inoculación y reaislamiento. Se inocularon 60 plantas a los 28 días después de la siembra. Se colocaron 10 mL de la suspensión de esporangios en la base del primer brote emitido por el fruto. Como tratamiento testigo se depositó agua destilada estéril en la base del primer brote de 20 plantas en la misma etapa de desarrollo que las inoculadas con los esporangios. Todas las plantas se mantuvieron bajo malla sombra (50/50) en invernadero a 28 ± 3 °C, humedad relativa del 70 % y riego a saturación por 30 días. Una vez que las plantas mostraron los síntomas de marchitamiento, se reaislaron los microorganismos en medio de cultivo V8-agar y PDA. Las colonias obtenidas se compararon morfológicamente con los aislamientos originales que se obtuvieron de las huertas comerciales.

Caracterización morfológica. Se describieron las características cualitativas y cuantitativas de 50 estructuras reproductivas sexuales (oogonio y anteridio) y 100 estructuras asexuales (esporangióforo y esporangios) crecidas en medio V8-agar. Se hicieron preparaciones semi-permantes teñidas con azul de algodón y se observaron en un microscopio compuesto (VE-B6, Velab). El registro fotográfico se hizo con un microscopio Nikon Eclipse E400 con cámara integrada.

Las estructuras reproductivas sexuales se indujeron a partir del apareamiento entre uno de los aislamientos obtenidos de la zona de transición entre el tallo y la raíz de las plantas recolectadas en Huatusco, y un aislamiento obtenido de frutos de la misma especie recolectada en Cuautlapan, Veracruz.

La identificación del género se hizo con las claves de Erwin y Ribeiro (1996), y para especie con las descritas por Gallegly y Hong (2008). La determinación de género y especie de los aislamientos fungosos se hicieron con las claves de Barnett y Hunter (2006), y con las descritas por Leslie y Summerell (2006), respectivamente.

Los productos de amplificación se verificaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1.2 % en amortiguador TAE 1X (Tris Acetate- EDTA) a 87 V durante 1 h. El gel se tiñó con bromuro de etidio (3 mg L^-1) y el ADN se visualizó en un transiluminador (Gel Doc 2000 UV; BIORAD^®, EE.UU.). Los amplicones se purificaron con el kit QIAquick PCR (Qiagen®, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante, y se secuenciaron en ambas direcciones con un sistema automatizado de secuenciación de ADN modelo 3730XL (Applied BioSystems®, EE.UU.) para asegurar que no hubiera lecturas de nucleótidos incorrectas. Las secuencias obtenidas se alinearon con las depositadas en el banco de genes del National Center for Biotechnology Information (NCBI, 2012).

RESULTADOS

Reaislamiento de microorganismos. De los tejidos obtenidos de plantas con síntomas de marchitez se aislaron oomicetes, hongos y bacterias. Phytophthora sp. se presentó con mayor frecuencia en 129 (92 %) de los140 fragmentos de tejido sembrados en PARPNH. En los 11 fragmentos restantes crecieron bacterias y hongos saprófitos que no se identificaron. En el medio V8-ácido láctico, Phytophthora sp. se aisló de 39 fragmentos de tejido (28 %), Fusarium sp. de cuatro y bacterias de 97. En PDA solamente se aisló a Fusarium sp. en 11 de los 140 fragmentos de los tejidos que se cultivaron. En seis y en dos de los 60 fragmentos de las guías basales de las plantas asintomáticas que se cultivaron en PDA crecieron bacterias y Alternaria sp., respectivamente. Solamente en tres de los 60 fragmentos mantenidos en V8-agar crecieron bacterias.

Reproducción de síntomas en invernadero. Veintidós días después de la inoculación (ddi), 54 de las 60 plantas inoculadas presentaron síntomas de flacidez de brotes tiernos y amarillamiento de las hojas (Figura 2A). La base de la guía se necrosó en el área inoculada (Figura 2B). Asimismo, a los 30 ddi, las guías basales se secaron provocando el marchitamiento prematuro de las hojas (Figura 2C).

Caracterización morfológica. El oomicete presentó crecimiento micelial cenocítico de tipo estrellado y color blanquecino en V8-agar. La formación de esporangios se observó a partir de los 13 d de crecimiento bajo condiciones de luz natural. En agua destilada los esporangios se desarrollaron a las 19 h de exposición en luz blanca.

Los esporangios se desarrollaron en cabezuelas y en simpodio simple (Figuras 3A y 3B), presentando forma elipsoidal a limoniforme de 58.71 x 29.28 um (promedio de 100 esporangios), papila conspicua y pedicelo largo (Figuras 3C y 3D). Germinaron directamente como hifas o con la formación de nuevos esporangios (Figuras 3E y 3F). El oomicete desarrolló oogonios con anteridios anfíginos y oosporas pleróticas a los 15 d después del apareamiento (Figuras 3G y 3H). Las características anteriores corresponden con las descritas en las claves de Erwin y Ribeiro (1996), Gallegly y Hong (2008) para Phytophthora capsici.

Identificación molecular. El producto de amplificación obtenido con los primers ITS4 e ITS6 fue de 650 pb, correspondiente al tamaño del amplicón esperado. El análisis de la secuencia mostró un 100 % de similitud con la secuencia JQ610200.1 de P. capsici depositada en la base de datos del NCBI (2012). La secuencia se registró en esta base con el número de acceso JX871893.

Los resultados obtenidos en la presente investigación, indican que la marchitez de las plantas de chayote no es inducida por Pythium sp., Fusarium oxysporum ni F. sambucinum, como lo reportaron Rivera et al. (1992) y Olguín (2010) en Costa Rica y México, respectivamente. Los síntomas descritos por estos investigadores fueron pudrición de raíz, hojas cloróticas y senescencia prematura en plantas aisladas o distribuidas en manchones, lo cual coincide con los síntomas observados en las huertas comerciales evaluadas en esta investigación; en donde además de estos síntomas, las plantas presentaron hojas sin turgencia y deshidratación en la zona de la corona (área de distribución plagiotrópica de las guías).

Rivera et al. (1992) y Olguín (2010), no realizaron las pruebas de patogenicidad para determinar si Pythium sp. y las dos especies de Fusarium fueron los agentes primarios de la marchitez de las plantas. Es importante resaltar que el aislamiento de Phytophthora sp. a partir de tejido sintomático es más difícil que el de algunos hongos, incluyendo Fusarium spp., ya que los síntomas en los órganos aéreos se presentan una vez que la infección de las raíces ha avanzado. Bajo tales condiciones, patógenos secundarios, o parásitos y saprófitos facultativos (hongos y bacterias) invaden el tejido radical enmascarando el crecimiento de Phytophthora sp. (Mircetich y Browne, 1987).

De acuerdo con las claves taxonómicas de Erwin y Ribeiro (1996), se aisló a Phytophthora en el 92 y 28 % de los fragmentos de tejido con síntomas de marchitez que se cultivaron en PARPNH y V8-agar, respectivamente, Fusarium spp. (Barnett y Hunter, 2006) creció en el 3 % del tejido sembrado en V8-agar. La identificación morfológica a nivel de especie (Gallegly y Hong, 2008) y el análisis molecular indicaron que la especie corresponde a P. capsici. Estos resultados, complementados con las pruebas de patogenicidad, indicaron que P. capsici es el agente causal primario del marchitamiento de las plantas de chayote.

Los síntomas que se observaron en plantas de chayote infectadas natural y artificialmente fueron reducción en el crecimiento de raíces absorbentes y el desarrollo de lesiones pardas de apariencia acuosa en las raíces primarias y guías basales. Es posible que las lesiones pardas se deban a la acción de enzimas pectolíticas (PG y PME) que produce P. capsici durante el proceso de infección y que degradan la pared celular y lamela media del tejido parenquimatoso del sistema vascular (Li, et al., 2011; Wang et al., 2011). Tal degradación resulta en la maceración y muerte celular debido a cambios osmóticos, lo cual se asocia con el marchitamiento de la planta al no contar con un sistema eficiente en el movimiento de agua, sales minerales, nutrientes, hormonas y otros solutos.

Otro factor que pudiera estar involucrado con el marchitamiento de las plantas es la obstrucción física de los elementos traqueales del xilema debido al crecimiento de hifas y a la posible invasión de otros hongos (Fusarium spp.), ya que incrementa la formación de geles y gomas que se inducen por la acumulación y oxidación de los productos de degradación celular (Agrios, 2005; Arévalo et al., 2012).

Algunas condiciones del cultivo tales como producción en áreas con pendiente y labores culturales (fertilización nitrogenada, control de malezas y remoción del suelo en la zona de goteo con azadón) facilitan la dispersión y el riesgo de infección por P. capsici en raíces con heridas recientes (Jung y Blaschke, 2004; Erwin y Ribeiro, 1996; Elliott, 1989). De acuerdo con Duniway (1983), la alta humedad relativa representa una de las condiciones ambientales de mayor importancia que induce el desarrollo de las enfermedades causadas por Phytophthora spp. La incidencia de plantas de chayote con síntomas de marchitez en el área geográfica de muestreo es aproximadamente del 13 al 15 % en la temporada de mayor precipitación pluvial y temperatura de 15 y 17 °C con humedad relativa del 100 %.

El decaimiento repentino de las plantas ocurre durante el patrón diurno de transpiración, y aun cuando algunas plantas se recuperan por la tarde, el marchitamiento vuelve a presentarse al día siguiente y las plantas mueren. La severidad del marchitamiento de las plantas varía de una huerta a otra, pero se considera proporcional al grado y velocidad de la infección de las raíces (Zitter et al., 2004); sin embargo, debe considerarse que tanto la severidad como la incidencia de la enfermedad están en función de las condiciones ambientales y de la naturaleza genética del patógeno y la planta hospedante.

CONCLUSIÓN

AGRADECIMIENTOS. Agradecemos al Grupo Interdisciplinario de Investigación en Sechium edule en México A.C. (GISeM); a la Línea Prioritaria de Investigación 13: Comunidades Rurales Agrarias, Ejidos y Conocimiento Local, del Colegio de Postgraduados; y al CONACYT por el apoyo económico para la realización de este trabajo.

LITERATURA CITADA

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