El Género Aspergillus y sus Micotoxinas en Maíz en México: Problemática y Perspectivas

The Genus Aspergillus and their Mycotoxins in Maize in Mexico: Problems and Perspectives

Hadassa Yuef Martínez Padrón¹, Sanjuana Hernández Delgado¹, César Augusto Reyes Méndez² y Gricelda Vázquez Carrillo²

¹ Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional. Blvd. del Maestro s/n esq. Elias Piña, Col. Narciso Mendoza, Reynosa, Tamaulipas, CP 88710, México. Correspondencia: hadassayufo@gmail.com

Recibido: Junio 18, 2012
Aceptado: Diciembre 19, 2013

Resumen

El maíz es el cultivo más importante de México de acuerdo con la superficie cultivada anualmente y su consumo per cápita. Las pérdidas en la producción del grano se asocian con su manipulación durante la cosecha en el campo, almacenaje, transporte y procesamiento para el consumo humano o animal. El grano de maíz posee una microbiota particular de bacterias, insectos y hongos que pueden causarle daños. Entre ellos, el género fúngico Aspergillus y, de éste, las especies A. flavus y A. parasiticus son las más importantes porque producen aflatoxinas que provocan gran variedad de efectos tóxicos en seres vivos expuestos al grano contaminado. Actualmente, las regulaciones mexicanas establecen límites permisibles sólo para aflatoxinas en cereales y sus productos, excluyendo otras micotoxinas. Las condiciones de producción de maíz en climas tropicales y subtropicales, particularmente en el noreste de México, favorecen las infecciones por hongos toxígenos. Por ello, es necesario la identificación e implementación de estrategias que reduzcan la contaminación en el grano. Entre ellas, destacan el uso de híbridos de maíz con resistencia a sequía, plagas, enfermedades y altos rendimientos de grano (H-436, 437, 439, 443A); manejo integrado de insectos y hongos mediante tratamiento químico, cultural o biológico y la modificación del procesamiento del grano para consumo humano (nixtamalización). Dichas medidas, individualmente o en conjunto, reducirán paulatinamente los daños causados por hongos potencialmente toxígenos en la planta de maíz y el consumidor final en México. En este trabajo presentamos una perspectiva de la investigación actual en el tema de los hongos aflatoxigénicos en maíz con énfasis en México, sus implicaciones en salud humana y del ganado, las herramientas (fitopatológicas, genéticas del hospedante y el patógeno, bioquímicas, entre otras) de estudio del problema, así como las estrategias de manejo integrado utilizadas, para actualizar y ponderar la información generada a la fecha, y establecer puntos esenciales para futuras investigaciones.

Palabras clave: Aflatoxinas, Estrategias de Manejo Integrado, Hongos Aflatoxigénicos, Zea mays L.

Abstract

Keywords: Aflatoxins, Integrated Pest Management Strategies, Aflatoxigenic fungi, Zea mays L.

El maíz (Zea mays L.) es una planta nativa de México que actualmente se destina para la alimentación humana y del ganado, además de su aprovechamiento industrial. El consumo per cápita de maíz es de aproximadamente 160 g por día en forma de tortillas, principalmente (ASERCA, 2012). En el 2012 se produjeron en México más de 22 millones de toneladas de maíz (SIAP, 2014). Sin embargo, los volúmenes y la calidad de la producción de maíz en nuestro país son limitados debido principalmente a la incidencia de plagas y enfermedades, y por factores abióticos como altas y bajas temperaturas, la salinidad de los suelos, la deficiencia de nutrimentos en los suelos y la sequía (Moreno y González, 2011).

Los hongos que comúnmente atacan al maíz tanto en campo como en almacén pertenecen a los géneros Aspergillus, Fusarium y Penicillium; estos organismos son productores potenciales de micotoxinas (Hernández et al., 2007; Montes et al., 2009). El crecimiento de Aspergillus y la contaminación de los productos alimenticios con aflatoxinas son consecuencia de la interacción entre el hongo, el hospedero y el ambiente. La interacción de dichos factores determina la infestación y la colonización del sustrato, así como el tipo y la cantidad de las aflatoxinas producidas (García y Heredia, 2006).

La producción de aflatoxinas es favorecida tanto por factores que ocurren en campo como en almacén (Devreese et al., 2013). En campo, la producción de aflatoxinas se incrementa con el estrés hídrico, las altas temperaturas y los daños a la planta hospedante producidos por insectos de la mazorca pertenecientes a los géneros Heliothis y Spodoptera (Rodríguez et al., 2010; Kebede et al., 2012). Aunado a lo anterior, la incidencia de aflatoxinas se ve favorecida por el ataque de plagas insectiles que se desarrollan bajo condiciones específicas como la fecha de siembra, altas densidades de siembra y alta incidencia de malezas (Rodríguez, 1996). En almacén, las condiciones de alta temperatura y humedad, aireación e inóculo primario proveniente del campo también son determinantes en el incremento de la síntesis de aflatoxinas en el grano de maíz (Hernández et al., 2007).

En este trabajo se presenta una revisión respecto al estudio de la contaminación con aflatoxinas en el cultivo de maíz, sus implicaciones en salud humana y animal, estrategias de control y de manejo integrado, con el objetivo de actualizar y ponderar la información generada a la fecha, que marque la pauta en la búsqueda de soluciones para disminuir la incidencia y prevalencia de las aflatoxinas en dicho cultivo particularmente para el caso de México, donde el cultivo del maíz es de importancia capital desde los puntos de vista ecológico, económico, social y cultural.

Aspergillus sección Flavi. La mayoría de las especies del género Aspergillus son hongos filamentosos saprófitos que desempeñan un papel esencial en la degradación de la materia orgánica. Su hábitat natural es el suelo donde sobreviven y se desarrollan sobre materia en descomposición. Este género es uno de los más abundantes en la naturaleza y puede encontrarse en cualquier ambiente; se reproduce por conidios cuya germinación da origen a las hifas. Para su crecimiento, Aspergillus requiere de una humedad relativa entre el 70 y 90 %, contenido de agua en la semilla entre 15 y 20 % y un rango de temperatura amplio (0 a 45 °C) (Klich, 2002).

Una de las particularidades de las especies de Aspergillus es su capacidad para producir micotoxinas, en este caso, aflatoxinas (AF). La estructura básica de las aflatoxinas consiste en un anillo dihidri-difurano o tetrahidro-difurano unido a una cumarina con un anillo de cinco o seis átomos de carbono. Las difuranocumarinas ciclopentanonas de AF de las series B, M, P y Q son las AFB₁, AFB₂, AFB_2a, AFM₁, AFM₂, AFM_2a, AFQ₁, AFP₁ y AFL. El segundo subgrupo corresponde a las lactonas difuranocumarinas de la serie G como son AFG₁, AFG₂, AFG_2a. Hay alrededor de 20 diferentes tipos de AF, las más importantes por su alto potencial cancerígeno, mutágeno y teratógeno son: B₁ (AFB₁), B₂ (AFB₂), G₁ (AFG₁), G₂ (AFG₂), M₁ (AFM₁), M₂ (AFM₂), P₁ (AFP₁), Q₁ (AFQ₁) y D (AFD), éste último derivado del tratamiento de la AFB₁ con amonio. Otro metabolito muy tóxico de la AFB₁ es el aflatoxicol (AFL). Sólo las AFB₁, AFB₂, AFG₁ y AFG₂ se sintetizan naturalmente de la AFB₁; las otras AF (M₁, M₂, P₁, Q₁, G_2a, B_2a y AFL) son hidroxilados producto del metabolismo animal o microbiano. La AFB₁ es la más peligrosa y tóxica de todas (Carvajal, 2013) y es producida por A. flavus y A. parasiticus. Las aflatoxinas G₁ y G₂ se producen por A. parasiticus y A. nomius, exclusivamente; aunque Novas y Cabral (2002) reportaron la producción de AFG₁ en algunas cepas Africanas y Argentinas de A. flavus var. parvisclerotigenus. Las especies A. flavus, A. pseudotamarii y algunas cepas de A. caelatus producen AFB₁ y AFB₂ (Peterson et al., 2000; Ito et al., 2001). AFB₂ y AFG₂ son inactivas biológicamente, pero se activan in vivo por oxidación a AFB₁ y AFG₁. Las aflatoxinas M₁ y M₂ son formas hidroxiladas de AFB₁ y AFB₂ respectivamente; mientras que AFB_2a y AFG_2a son productos 8- y 9-hidratados de B₁ y G₁₄ (Moudgil et al., 2013). La AFB₁ exhibe toxicidad aguda, seguida de AFB₂, AFG₁ y AFG₂ (Madrigal et al., 2011; Mejía et al., 2011). Algunos precursores de aflatoxinas son hidroxiantraquinonas tales como el ácido norsolorínico, averufina, versicolorina A y averantina (Moudgil et al., 2013).

Cabe notar que la capacidad de síntesis de aflatoxinas es característica de la cepa, no de la especie. Otra toxina producida por A. flavus es el ácido ciclopiazónico, que no ha aflatoxinas (Abbas et al., 2011a). Hongos del género Asperguillus también inhiben la germinación de la semilla y producen cambios de color, temperatura (calentamiento), enmohecimiento, 'apelmazamiento' y pudrición pudrición. En contraste, especies como A. niger y A. oryzae son de interés industrial y se utilizan en la fermentación de alimentos (Kozakiewicz, 1989; Klich, 2002).

En 2005 se liberó la secuencia del genoma de A. flavus por el Instituto de Investigación Genómica de Estados Unidos y en 2010 se actualizó dicha secuencia (Cleveland et al., 2009; Payne y Yu, 2010). Posteriormente, se generaron 7218 etiquetas de secuencia expresada (ESTs) únicas de A. flavus. El tamaño del genoma de A. flavus y de A. oryzae es de cerca de 37 Mb distribuidos en ocho cromosomas y que codifican para más de 12 mil genes funcionales (Chang y Ehrlich, 2010; Payne y Yu, 2010). El genoma de A. flavus es ligeramente mayor que el de A. fumigatus (aproximadamente 30 Mb), A. terreus (30 Mb), A. niger (34 Mb) y A. nidulans (31 Mb). A pesar de esta variación en los tamaños de los genomas, todas las especies de Aspergillus tienen ocho cromosomas. Un aspecto importante es que A. flavus y A. oryzae tienen copias extra de genes específicos al linaje. Esas extracopias se localizan por lo general en bloques no sinténicos. Aunque no se han secuenciado sus genomas, con base en estudios cariotípicos se ha sugerido similitud en el tamaño del genoma de A. parasiticus y A. sojae con respecto a A. flavus (Amaike y Keller, 2011).

Producción de aflatoxinas. A pesar de que México es el centro de origen y de diversidad del maíz (Ortega, 2003), dicha diversidad no se ha analizado exhaustiva o consistentemente para identificar genotipos más tolerantes a la contaminación por aflatoxinas. Dado que el maíz es un alimento de importancia mundial, es necesario el monitoreo de la calidad sanitaria, desde el uso de semillas libres de patógenos durante cada una de las etapas del cultivo, hasta la cosecha, e incluso, durante la pos-cosecha (Plasencia, 2004). Es importante señalar que en México la mayor proporción del maíz se cultiva en condiciones de temporal (60 %) (SIAP, 2014) que, en general, es deficiente y errático y que frecuentemente redunda en la coincidencia de estrés hídrico y altas temperaturas durante la fase fenológica reproductiva, lo que finalmente favorece la infección de Aspergillus en campo (Rodríguez, 1996; Cotty y Jaime-García, 2007).

El efecto toxígeno de las aflatoxinas producidas por Aspergillus varía desde los carcinogénicos, teratogénicos o mutagénicos hasta la producción de desórdenes hormonales o inmunosupresores; lo que a su vez depende de la aflatoxina, dosis, tiempo de exposición u organismo expuesto (Carvajal, 2013). El problema principal reside en que las aflatoxinas son acumulativas de modo que una vez que contaminan el grano o el producto agrícola en campo o almacén persisten a la digestión, al calor de la cocción o al congelamiento. Las aflatoxinas son ingeridas por los seres humanos no sólo a través de granos, semillas o frutos; también se presentan en la leche o la carne de animales criados con alimentos contaminados (Requena et al., 2005).

En México la mayoría de los estudios se han limitado a registrar la incidencia de Aspergillus y la cuantificación de las aflatoxinas, así como la identificación a nivel de género de los hongos presentes en el grano de maíz (Hernández et al., 2007; Montes et al., 2009). Particularmente en el norte del estado de Tamaulipas, una de las zonas maiceras más importantes de México, se llegaron a cultivar más de 230 mil ha al año y en la última década en promedio se siembran anualmente unas 100 mil ha con maíz (Reyes y Cantú, 2006). En esa región, la incidencia de Aspergillus es frecuente y en ocasiones de tal intensidad que ha llevado a replantear la tecnología del cultivo del maíz en la región basada en el desarrollo o la adecuación de estrategias para su manejo (Reyes y Cantú, 2006; Díaz-Franco y Montes-García, 2008). El género Aspergillus ocurre con mayor frecuencia en maíz almacenado para consumo, mientras que en campo la mayor incidencia la presenta Fusarium (Hernández et al., 2007). Por su parte, Montes et al. (2009) identificaron a A. flavus y A. niger en híbridos con grano blanco o amarillo, donde éstos últimos exhibieron mayores porcentajes de infección. Alvarado et al. (2010) detectaron alta concentración de aflatoxinas en siembras con una alta densidad de población de maíz (siembra en camas y concentraciones de 20.8 µ/kg); sin embargo, el riego por goteo redujo casi a la mitad las infecciones por A. flavus (concentraciones de aflatoxinas de 11.1 µg/kg). En la ciudad de Monterrey se analizaron muestras de maíz tomadas de diferentes puntos de distribución y se detectó a AFB₁ en un rango de 5.03 a 465.31 ng/g y AFG₁ en concentraciones de 1.59 a 57.1 ng/g. De las 41 muestras analizadas, 87.8 % estaban contaminadas con aflatoxinas y 58.5 % contenía niveles por encima de los límites legales permitidos en México (Torres et al., 1995). Por su parte, Bucio et al. (2001) analizaron maíz almacenado en Guanajuato y concluyeron que la contaminación por aflatoxinas no se asocia con las condiciones del cultivo sino con las condiciones inadecuadas de almacenamiento del grano. En el estado de Sonora, México, de 66 muestras de maíz almacenadas siete registraron concentraciones de AFB₁ menores a las permitidas la NOM 247-SSA1-2008 (Ochoa et al., 1989) y en 111 muestras de 'pozol' de mercados locales de Chiapas se detectaron 19 muestras con AFB₂ con niveles de 0.5 a 21µg/kg, así como trazas de AFB₁ (Méndez et al., 2004). A pesar de la consistencia en la detección de aflatoxinas en muestras vegetales o semi-procesadas de maíz, las concentraciones son variables dependiendo del origen de la muestra, condiciones de almacenamiento o ambientales, germoplasma, etc. (Jaime-García y Cotty, 2010). No obstante, no se puede soslayar que la acumulación de aflatoxinas y sus efectos nocivos en el consumidor final permanecen latentes (Carvajal, 2013).

Modos de acción de las aflatoxinas. Biológicamente, las aflatoxinas se comportan como inmunosupresores que inhiben la fagocitosis y la síntesis proteica e interrumpen la formación del DNA, RNA y las proteínas en el ribosoma (Carvajal, 2013). Por tal razón, la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer, IARC (2013) por sus siglas en inglés, en 1988 clasificó a las aflatoxinas en el grupo 1 de micotoxinas que incluye sustancias o mezclas de ellas con alto poder cancerígeno en humanos.

Cuando se ingiere un alimento contaminado con aflatoxina B₁, ésta primero se absorbe en el intestino delgado y luego es transportada en la sangre, donde los glóbulos rojos y proteínas plasmáticas la conducen hacia el hígado. En las células hepáticas la toxina se metaboliza en el retículo endoplasmático para transformarse en las aflatoxinas P₁, M₁, Q₁ debido a que la molécula se hidroxila. En dicha reacción se forma paralelamente la toxina B1-8,9-epóxido que puede detoxificarse por una transferasa formando un conjugado con el glutatión en su forma tiólica (GSH). Las aflatoxinas son mutagénicas debido a que su estructura es afín a los ácidos nucléicos y proteínas y se une a ellos mediante enlaces covalentes. Estos enlaces ocasionan disrupciones en la transcripción y traducción y generan la formación de un aducto de DNA llamado aflatoxina B₁-guanina y peroxidación de lípidos. Por tal razón las aflatoxinas, a nivel celular, ocasionan la inhibición del DNA, RNA, mitosis, alteraciones cromosómicas, que a su vez redundan en efectos carcinogénicos, teratogénicos y mutagénicos (Carvajal, 2013; Moudgil et al., 2013).

Las aflatoxinas se sintetizan por la ruta metabólica de los policétidos mediante reacciones de condensación, oxidación, reducción, alquilación y halogenación, que permiten formar una molécula que consiste en un anillo cumarín unido a una unidad bis-dihidrofurano y a una ciclopentanona (Guzmán-de Peña, 2007; Carvajal, 2013). Guzmán-de Peña (2007) señala que las aflatoxinas se forman por la condensación de la acetil-coenzima A y la malonil-coenzima A, produciendo la acetil-S coenzima A, molécula iniciadora de la AFB₁. Dentro de la ruta biosintética, la formación de la versicolorina A es particularmente relevante, ya que es la primera molécula en la vía de la AFB₁ y que contiene un doble enlace en la posición 8,9 de la molécula del bis-furano. Este doble enlace es el blanco para la activación de una molécula altamente reactiva. Durante la síntesis ocurren al menos 23 reacciones enzimáticas y 15 intermediarios. A nivel molecular se ven involucrados 25 genes en los pasos de inter conversión, los cuales han sido secuenciados, confirmados por disrupción génica y por estudios enzimáticos y están agrupados en una región del DNA de 70 kb.

A nivel molecular, más de 25 genes conglomerados en una región de 70 kb codifican las enzimas y proteínas reguladoras de la síntesis de aflatoxinas en A. flavus y A. parasiticus. Entre ellos, los genes hexA, hexB y pksA son mayores a 5 kb y codifican la subunidad alfa de la sintasa de ácidos grasos (de 5.8 kb); la subunidad beta de la misma sintasa (de 5.1kb) y la sintasa de poliquétidos (de 6.6 kb), respectivamente. Por su parte, los 22 genes involucrados tienen un tamaño promedio de 2 kb. Una región de aproximadamente 2 kb sin marco de lectura abierto identificable presumiblemente determina el inicio del conglomerado de genes (Ehrlich et al., 2005; Amare y Keller, 2014).

La biosíntesis de las aflatoxinas es afectada por factores genéticos y ambientales. El gen aflR es positivamente regulado y codifica una proteína acoplada a DNA con secuencia específica de 'dedos de zinc'; dicho gen es requerido para la transcripción de la mayoría de los genes estructurales de aflatoxinas (Bhatnagar et al., 2006). Luego, el gen regulador aflJ (o aflS), adyacente a aflR, se asocia con la expresión de pksA, nor1, ver1 y omtA (Chang, 2003; Cleveland et al., 2009; Georgianna y Payne, 2009; Yu et al., 2009; Amare y Keller, 2014). Adicionalmente, la ubicación en el cromosoma y algunos factores de transcripción global mediados por nitrógeno, carbono o regulados por pH también afectan la expresión de los genes estructurales de aflatoxinas. Las fuentes de nitrógeno y carbono, el pH, la temperatura, la disponibilidad y actividad del agua y metabolitos de las plantas afectan la síntesis de aflatoxinas (Bhatnagar et al., 2006) y están directamente asociadas en las rutas metabólicas correspondientes, pues cuando el hongo se sujeta a condiciones de estrés por calor o humedad, las aflatoxinas se sintetizan pero en cantidades mínimas; bajo combinaciones favorables de ambos factores ambientales se incrementa la síntesis y los perfiles de expresión de los genes directamente asociados a dicha síntesis, dado que la relación de expresión entre aflR/aflJ se correlaciona con el incremento en la biosíntesis de las aflatoxinas (Schmidt-Heydt et al., 2009).

Por otra parte, la pérdida de toxicidad se basa en la presencia de mutaciones puntuales o deleciones en el conglomerado de genes descrito (Chang et al., 2005). Por ejemplo, la cepa atoxigénica AF36 muestra un reemplazo de G por A en el sitio nt591 del gen de sintasa de poliquétido, introduciendo un codón de terminación en la posición 176 del gen, deteniendo la síntesis enzimática y acumulación de aflatoxinas (Ehrlich y Cotty, 2004). A su vez, la cepa NRRL21882 presenta una deleción en el conglomerado de genes completo desde la región codificadora de hexA en el grupo de genes de utilización de azúcares a la región telomérica (Chang et al., 2005). Finalmente, Criseo et al. (2008) observaron cepas de A. flavus no toxigénicas con todo el grupo de genes que presentan las cepas toxigénicas. En este caso, la atoxigenicidad se explicó debido a defectos a nivel molecular como modificaciones post-transcripcionales o proteínicas, aunque aún no se tienen los elementos completos al respecto.

Las aflatoxinas exhiben baja solubilidad en agua, pero son solubles en cloroformo, soluciones acuosas de metano, acetonitrilo o acetona, debido a que los cristales de aflatoxinas no tienen las mismas propiedades de la aflatoxinas naturales. Además, son relativamente inestables a la luz y al aire en estado puro y susceptibles a la hidrólisis alcalina; son afectadas por amoníaco o hipoclorito de sodio (pH>10.5); termo-resistentes y estables en un rango de pH entre 3 y 10; inodoras, incoloras e insípidas; así como químicamente, estables en los alimentos y resistentes a la degradación bajo procedimientos de cocción normales y de difícil eliminación una vez que se producen (Guzmán-De Peña, 2007; Carvajal, 2013).

Implicaciones en salud humana y animal. Las aflatoxinas se encuentran principalmente en productos agrícolas como las materias primas para la preparación de alimentos balanceados para ganado en forma de contaminantes o bien, como residuos tóxicos de los productos de dicha explotación zootécnica como la leche, huevo o carne (Requena et al., 2005).

La incidencia de las aflatoxinas en alimentos para humanos y para ganado se ha estudiado en diversos países (Robledo et al., 2001; Reyes-Velázquez et al., 2008; Hong y Yusof, 2010; Nazari et al., 2013; Stojanovska-Dimzoska et al., 2013) y, en general, se asocian con el desarrollo de cáncer de hígado y de pulmón en humanos (Liu y Wu, 2010; Wild y Gong, 2010; Carvajal, 2013; Aliabadi et al., 2013; Magnussen y Parsi, 2013; Moudgil et al., 2013). Liu y Wu (2010) analizaron entre 550 y 600 mil casos a nivel mundial de pacientes con cáncer de hígado principalmente reportados en África sub-Sahariana, Sureste Asiático y China, determinaron que entre 4.6 y 28.2 %o de dichos casos se asocian directamente con la sobre-exposición a las aflatoxinas (25-155 mil casos). En México, la investigación de las implicaciones y efectos de las aflatoxinas cobró mayor importancia a partir de la década de 1990 debido a que el consumo de alimentos contaminados con AFM₁ por animales productores de leche representa un riesgo potencial a la salud pública, particularmente en la población infantil. En 40 hatos lecheros del estado de Jalisco se detectaron 92 % de raciones alimenticias contaminadas con aflatoxinas totales (entre 4.82 y 24.89 µg/kg) y el 80 % de leche cruda producida por los mismos estaban contaminados con aflatoxina M₁ (de 0.006 a 0.065 µg/L de leche) (Reyes et al., 2009). En 35 muestras de alimento para perros y gatos de 12 marcas diferentes en México se detectaron siete aflatoxinas (B₁, B₂, G₁, G₂, M₁, M₂ y P₁) con concentraciones altas en dos muestras (72.4 y 597µg/kg de alimento). La aflatoxina B₁se encontró en 100 % de las muestras de alimento para gatos y 79 % para perros. Las muestras con mayor cantidad de AFB₁ y AFM₁ utilizaban maíz como principal ingrediente en la formulación (Sharma y Márquez, 2001).

La asociación de las mutaciones en el codón 249 del gen p53 (Moudgil et al., 2013) se evaluó en células de carcinomas hepáticos humanos de pacientes en Monterrey, México, detectándose los antígenos de hepatitis B y/o C y la mutación, en 3 de 16 casos, del gen p53 y concentraciones de 0.54 a 4.64 pmol de AFB₁-lisina/mg de albúmina. Los antígenos para el virus de la hepatitis B y/o C fueron positivos en 12 de 20 casos. En estas condiciones aún las concentraciones relativamente bajas de AFB₁ pueden resultar en una situación de alto riesgo dada la exposición diaria (Soini et al., 1996). Resultados semejantes a nivel molecular se reportan en pacientes de Senegal (Coursaget et al., 1993), Estados Unidos, Tailandia y China (Aguilar et al., 1994) y China (Jackson et al., 2003). Carvajal et al. (2012) comprobaron la asociación de las aflatoxinas con el VPH (virus del papiloma humano) de los tipos 16 y 18 en cáncer cérvico-uterino; además verificaron la presencia de tumores cancerígenos (hígado, colon, pulmón y páncreas) y la orina de enfermos con cirrosis viral, hepatitis B y C y concluyeron que las aflatoxinas actúan como cofactores que potencian la incidencia de enfermedades en los organismos.

Regulaciones sanitarias. En México se han desarrollado normatividades para regular la incidencia de aflatoxinas en cereales. En 2008 se emitió la Norma Oficial Mexicana NOM-247-SSA1-2008 que indica que el límite máximo permisible de aflatoxinas en cereales es de 20 µg/kg tanto para el consumo humano como de animales; además, aporta información relativa a las especificaciones sanitarias de transporte y almacenamiento de cereales e indica que el límite máximo de aflatoxinas en harina de maíz nixtamalizado y masa para tortillas es de 12 µg/kg (NOM-247-SSA1-2008). Sin embargo, es notable observar que no existe una regulación similar a la de las aflatoxinas para otras micotoxinas comúnmente presentes en productos agrícolas tales como las fumonisinas y las ocratoxinas (Li et al., 2011); así como para aflatoxinas específicas como la B₁, la más tóxica, o la M₁ en productos lácteos. Esto indica que es indispensable la implementación de estudios para generar conocimiento relativo a estas micotoxinas para así desarrollar y validar nuevas medidas para el manejo de las mismas, además de la legislación reguladora pertinente. A la fecha se han establecido los límites de aflatoxinas permisibles en los países importadores y exportadores de productos agropecuarios en el mundo. Por ejemplo, en Estados Unidos de América se permiten 20 µg/kg en alimentos, 0.5 µg/kg de aflatoxina M₁ en leche (FDA-USA, 2012); en la Unión Europea, sólo se permiten máximo 20 µg/kg de aflatoxina B1 (UE-EFSA, 2002). El Reglamento Sanitario de los Alimentos de Chile (2012) indica que sólo deben permitirse hasta 5 µg/kg de las aflatoxinas B₁, B₂, G₁ y/o G₂ en alimentos y hasta 0.05 µg/kg de M₁ en leche.

Estrategias de manejo integrado. En la actualidad son escasos, particularmente en México, los programas que incluyan un manejo integral para la disminución de las aflatoxinas y de los hongos productores de las mismas. En el estado de Tamaulipas se tomaron medidas para el control de la contaminación por aflatoxinas a partir de las fuertes contaminaciones en el grano (alrededor del 90 %) y los altos niveles de aflatoxinas (concentraciones entre 63 y 167 µg/kg) (Moreno y Gil, 1991; Carvajal y Arroyo, 1997) ocurridas en el maíz cultivado en la región durante 1989 y 1990; lo que se asoció con la presencia de temperaturas altas y el ataque severo de plagas en la etapa reproductiva del cultivo, así como factores favorecedores del drástico incremento de la contaminación del grano en los almacenes regionales (alta humedad y temperatura).

En el caso del campo, el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) desarrolló un paquete tecnológico para el cultivo del maíz en la región norte de Tamaulipas. Estas medidas incluyen la fecha de siembra temprana, la densidad adecuada de siembra, una adecuada irrigación (tres riegos de auxilio) y el monitoreo estricto de insectos plaga favorecedores de la infección por hongos aflatoxigénicos en la mazorca (Rodríguez et al., 1995; Reyes y Cantú, 2006; Cantú-Almaguer et al., 2010). Para 1991 el grano contaminado se redujo al 20 % como resultado del desarrollo y aplicación del paquete tecnológico. Adicionalmente, el INIFAP liberó en 1992 el híbrido HV-1, un maíz con grano blanco semi-dentado tolerante a condiciones de siembra en suelos de segunda clase (Reyes y Cantú, 2003; 2004). Por su parte, Martínez et al. (2003) reportaron que las concentraciones de aflatoxinas en más del 70 % de los maíces cultivados o almacenados en los municipios Tamaulipecos de Camargo, Gustavo Díaz Ordaz, Matamoros, Reynosa, Río Bravo, San Fernando y Valle Hermoso en 1998 exhibieron valores mayores a los máximos aceptados por las normas nacionales y de otros países para la comercialización del grano, desde 20 hasta 233 µg/kg.

Posteriormente, y en respuesta al problema de la poca disponibilidad de agua para riego, el programa de mejoramiento genético del INIFAP orientó la investigación a la formulación de maíces tolerantes a las altas temperaturas y sequía. En 2003 se liberaron los híbridos trilineales H-437 y H-439, mismos que produjeron en promedio 3.7 toneladas por hectárea (Reyes y Cantú, 2003, 2004). Los híbridos H-436 y H-437 tuvieron los menores porcentajes de contaminación por hongos de los géneros Aspergillus spp., Fusarium spp. y Penicillium spp. (Hernández et al., 2007); por su parte, en el híbrido de grano amarillo H-443A se detectó 14 µg/kg de aflatoxinas mientras que siete híbridos de grano amarillo ampliamente sembrados en el norte de Tamaulipas presentaron de 36 a 218 µg/kg en la semilla (Reyes et al., 2009).

Lo anterior ofrece una perspectiva de la recurrente gravedad de la incidencia de hongos aflatoxigénicos en la región norte de Tamaulipas y fronteriza con EUA desde fines del siglo XX. También, hace notar el hecho que los relativos éxitos en el control del hongo y de sus aflatoxinas no se han obtenido directamente sino que, indirectamente y a través de la liberación de germoplasma con resistencias individuales o combinadas a factores favorecedores de la infección (plagas, sequía) se logran reducciones significativas. Este punto es de importancia: debe proponerse la estandarización de técnicas de evaluación y selección de germoplasma promisorio que conlleve el desarrollo de programas de mejoramiento genético enfocados en la evaluación, selección, cruzamiento y liberación de germoplasma resistente al patógeno y sus metabolitos. De igual forma, debe ponerse atención, a la par del mejoramiento como tal, en el mapeo de genes de resistencia y generación de mapas de ligamiento que faciliten la selección de progenitores y los programas de hibridación (Cary et al., 2011). De igual forma, las condiciones climáticas en campo y almacén también motivan cambios en las estrategias, así como la aparición de nuevas cepas toxigénicas en las regiones maiceras y que afectan la estructura genética de las comunidades de Aspergillus (Cotty y Jaime-García, 2007; Jaime-García y Cotty, 2010). Ello motiva a la constante modificación del patrón de cultivos en la región como medida urgente y radical para reducir la incidencia de dichos hongos así como la constante búsqueda y definición de nuevas estrategias de manejo integrado del problema (Jaime-García y Cotty, 2010).

Medidas de control en campo y almacén. El control de Aspergillus o sus toxinas en la planta de maíz ha consistido en la utilización de productos químicos para su erradicación. Sin embargo esta estrategia es relativamente costosa. Los insectos que podrían actuar como vectores al facilitar la entrada de conidios dentro de la mazorca han generado resistencia a los insecticidas. Aunado a lo anterior existen restricciones en el uso de plaguicidas dadas las regulaciones ambientales. En México se han identificado algunos coleópteros presentes en maíz como Carpophilus fremani, Carthartus quadricollis y Sitophilus zaemais; de ellos, Sitophilus se asocia con 90 % de las infecciones por A. flavus en campo (García et al., 2003). En cuanto al control biológico se ha comprobado la reducción del crecimiento o de la producción de aflatoxinas o incluso la modificación de las estructuras de las aflatoxinas debido a la acción de bacterias y hongos tales como A. niger, Rhodococcus corynebacterioides (Niocardia corynebacteroides), Candida parapsilosis, Myxococcus fulvus, Mucor ambiguus y Trichoderma viride. No obstante, la mayoría de esos estudios se ha realizado en condiciones de laboratorio (Suárez et al., 2007; Tejada-Castañeda et al., 2008; Yin et al., 2008; Wu et al., 2009; Nogueira et al., 2010; Zhao et al., 2010; Aliabadi et al., 2013; Devreese et al., 2013). Las bacterias del género Bacillus muestran actividad anti-fúngica contra A. flavus (Moyne et al., 2001; Taylor y Draughon, 2001). Palumbo et al. (2006) informaron que Bacillus ofrece un efectivo antagonista al crecimiento de A. flavus en almendras. Por su parte, Gao et al. (2011) observaron que una cepa de B. subtilis obtenida de intestinos de peces fue capaz de detoxificar las toxinas y de degradar las aflatoxinas B₁, M₁ y G₁ en un 80, 60 y 80 %, respectivamente. Entre los mecanismos utilizados por los microorganismos antes señalados para reducir el crecimiento de Aspergillus o la producción de las aflatoxinas están la competencia por espacio y/o nutrimentos, antibiosis vía la síntesis de enzimas degradadoras, parasitismo, o bien, la unión de las moléculas de la aflatoxina a las paredes celulares del microorganismo biocontrolador en virtud de su marcada hidrofobicidad (Niknejad et al., 2012). Ello lleva a considerar esta estrategia como una alternativa promisoria en el manejo de aflatoxinas.

Los compuestos Butil-hidroxianisol (BHA), Butil-Hidroxi-tolueno (BHT) y Propil-parabeno (PP) controlan el crecimiento y la síntesis de aflatoxinas de A. flavus y A. parasiticus (Thompson, 1992) en granos almacenados. Moreno y Vázquez (2000) evaluaron la efectividad de los propionatos de amonio, de calcio y de sodio en la reducción de la incidencia de A. flavus y sus aflatoxinas en maíz de Tamaulipas. Los tres propionatos redujeron la incidencia de aflatoxinas por debajo de los 20 µg/kg; sin embargo, se observó fitototoxicidad de los fungistatos en la germinación del grano de maíz pues la germinación del grano tratado con las cuatro dosis del propionato de amonio fue cercana a cero. Otros compuestos reducen el crecimiento del hongo y la consiguiente contaminación del hospedante (Lira, 2003). Tequida et al. (2002) reportaron que extractos alcohólicos metanólicos y/o etanólicos de 'gobernadora' (L. tridentata) inhibieron el crecimiento de A. flavus y A. niger en un rango de 40 hasta 100 %. Rocha-Vilela et al. (2009) determinaron que el compuesto 1,8-cineolo aislado de Eucalyptus globulus inhibió el crecimiento y la producción de aflatoxina B₁ de A. flavus y A. parasiticus. Por su parte, Moreno y González (2011) indicaron que los extractos alcohólicos de 'gobernadora' (3 a 7 mg/mL de concentración) inhibieron hasta 100 % el crecimiento de A. flavus. El-Nagerabi et al. (2013) evaluaron extractos de hoja, resinas y aceites esenciales de Boswellia sacra para el control de A. flavus y A. parasiticus; la resina y el aceite esencial inhibieron, entre 40 y 90 %, el crecimiento y la secreción de aflatoxinas de ambos géneros fúngicos. Los extractos de plantas u otros agentes biocontroladores usualmente contienen sustancias que muestran un efecto directo en la reducción o total inhibición del crecimiento de Aspergillus, vía degradación de componentes estructurales de pared y membrana y organelos (Nogueira et al., 2010). Por ejemplo, se reportan ácido guaiarético, ácido linoléico, quinonas, terpenos, cumarinas, precocenos, glicósidos, ácido carnósico, etc. (Tequida et al., 2002; Nogueira et al., 2010; Moreno y González et al., 2011). Los resultados de estos trabajos con extractos de plantas son promisorios en virtud de que debe ponerse énfasis en la caracterización y detección de compuestos con utilidad para el manejo de hongos toxígenos del grano de maíz.

Otro método consiste en el uso de bolsas de silo fabricadas con poliestireno y filtro de rayos ultravioleta. El tamaño más utilizado es de 60-75 m de largo y 2.7 m de ancho. Cada bolsa puede almacenar unas 200 ton de grano. Dicho método es económicamente costeable ya que proporciona una forma eficiente de preservar el grano (Fornieles, 2001).

La estrategia de manejo que ha mostrado ser efectiva en la reducción de la contaminación de aflatoxinas en pre y post cosecha del maíz consiste en el uso de razas atoxigénicas (que no producen toxinas) de A. flavus, mismas que por competencia por los mismos sustratos para el crecimiento y desarrollo desplazan a las poblaciones de hongos toxigénicos (Yin et al., 2008; Degola et al., 2011). Esta medida de control biológico se utiliza en el sur de Estados Unidos (Arizona, California, Texas) en cultivos como maíz, algodonero, cacahuate y pistache, donde la incidencia de aflatoxinas se reduce del 70 hasta 90 % (Pitt y Hocking, 2006; Dorner, 2008; Abbas et al., 2011a). Para que la exclusión competitiva sea eficaz, las cepas no toxigénicas factibles para aplicarse a manera de biocontrol deben ser predominantes en los entornos agrícolas cuando los cultivos son susceptibles de ser infectados por las cepas toxigénicas. Algunas características de dichas cepas son su capacidad de crecimiento y esporulación, su estabilidad genética, capacidad para adaptarse a ambientes desfavorables y control de la síntesis de aflatoxinas, ácido ciclopiazónico y fumonisinas (Abbas et al., 2011b). Las cepas que mejores resultados han mostrado en campo y almacén son AF36, NRRL21882 (Alfa Guard®), CT3 y K49 de A. flavus y NRRL21369 de A. parasiticus, entre otras mismas que han promovido reducciones variables en la síntesis de aflatoxinas, ácido ciclopiazónico y fumonisinas en maíz y otros cultivos, que van desde un 20 a un 90 % en comparación con plantas no tratadas (Abbas et al., 2006; 2011a; 2011b). Nuevas estrategias de biocontrol, aún en evaluación en campo, consisten en aplicar la cepa atoxigénica de A. flavus mezclada con sustratos bioplásticos. Por ejemplo, se está probando la mezcla de los conidios de la cepa atoxigénica con un bioplástico basado en almidón (Mater-Bi®) (Accinelli et al., 2009; 2012); así como la aplicación de la cepa a la mazorca (más eficaz que al aplicarse en el suelo) mezclada en gránulos dispersables en agua basados en arcilla, igualmente con resultados de control promisorios (Abbas et al., 2011b).

Medidas para descontaminar el grano. El proceso de descontaminación ideal debe ser barato, sencillo y que no produzca compuestos secundarios tóxicos o que altere las características nutrimentales y de palatabilidad durante o después de su utilización (Elias et al., 2002). En México se han utilizado principalmente métodos físicos como la nixtamalización, extrusión y eliminación por adsorbentes. De acuerdo con Guzmán et al. (1995) y Anguiano et al. (2005), el proceso de nixtamalización destruye del 95 al 100 % de las aflatoxinas del maíz. En este sentido, también Pérez-Flores et al. (2011) reportaron que un método modificado para fabricar tortillas basado en el uso de microondas redujo entre 68 y 84 % la incidencia de aflatoxinas B₁ y B₂; Torres et al. (2001) encontraron reducciones de 52, 85 y 79 % de aflatoxinas en tortillas, totopos y frituras, respectivamente. Mientras que la nixtamalización redujo los niveles de AFB₁, AFM₁ y AFB₁ 8-9 dihidrodiol en 94, 90 y 93 % respectivamente en muestras con altos niveles de contaminación, la extrusión del grano de maíz con agua conteniendo 0.3 % de cal y 1.5 % de peróxido de hidrógeno redujo al 100 %; además, la cal y el peróxido de hidrógeno no afectaron el aroma y el sabor de las tortillas. Diversas modificaciones de la nixtamalización, la extrusión y la combinación de ambas se han evaluado con base en sus efectos en la eliminación de contaminantes y la calidad de la tortilla, aunque algunos resultan costosos o requieren más energía. La mayoría de estos procesos no se han utilizado comercialmente para descontaminar maíz, aunque su estudio podría tener aplicaciones y resultados promisorios en el corto plazo (Comunicación Personal. Dr. Juan De Dios Figueroa-Cárdenas. CINVESTAV-IPN Unidad Querétaro. Querétaro, México. 2012). Así mismo, el uso de sustancias descontaminantes naturales o sintéticas denominadas 'secuestrantes' (arcillas, zeolitas, bentonitas, carbón activado, aluminosilicatos, polímeros y productos de la pared celular de levaduras) pueden contrarrestar la toxicidad de las aflatoxinas (Ramos y Hernández, 1997; Boudergue et al., 2009; Tapia-Salazar et al., 2010); a diferencia de México, éstas estrategias se han evaluado experimentalmente en ganado en Europa (Devreese et al., 2013).

DISCUSIÓN Y PERSPECTIVAS

El maíz es el alimento más importante en la República Mexicana, por lo que es necesario optimizar su producción y conservación de manera inocua. El ataque de diversos patógenos en el campo y el almacén causan daños a la producción; no obstante, no se utilizan de manera generalizada medidas de control directas y efectivas para reducir o anular la infección por hongos toxígenos de la mazorca, salvo medidas preventivas que desfavorecen la infección o la producción de dichas toxinas. Una de estas medidas consiste en la modificación de las fechas de siembra de modo que la fase sensible del ciclo biológico del maíz, la reproductiva, no coincida con las condiciones ambientales favorables o al estrés ambiental o a la alta incidencia e infección de hongos aflatoxigénicos. Esta medida se aplica en conjunto con el uso de híbridos con tolerancia a factores de estrés, como las altas temperaturas y el déficit hídrico (Reyes y Cantú, 2006). La alta incidencia de hongos toxígenos en maíz y la ocurrencia de sus micotoxinas contaminantes son particularmente preocupantes en el maíz producido en regiones como el noreste de México, así como a nivel mundial en Europa, América y África. Esto es de vital importancia si la producción se destina mayormente al consumo humano como ocurre en África y América Latina.

Lo anterior propone algunas líneas de investigación que deberían seguirse en el mediano y largo plazos al menos con marcado énfasis en las regiones maiceras de México donde Aspergillus y sus aflatoxinas son importantes. Debe continuarse el diagnóstico y la evaluación oportuna de los daños por hongos y plagas, identificar asociaciones, medir respuestas y generar paquetes tecnológicos que permitan paulatinamente reducir o inhibir por completo a los hongos aflatoxigénicos, la contaminación por aflatoxinas y una producción de maíz con alta calidad sanitaria, nutrimental y rentable en aquellas regiones productoras que presentan daños recurrentes por hongos aflatoxigénicos. Un nicho de oportunidad, consiste en la evaluación consistente y sistemática de cepas no toxígenas en el germoplasma de maíz con grano blanco o amarillo, adaptado a cada región agroecológica, de modo que se valide su pertinencia en el control de los hongos y sus aflatoxinas en México, particularmente en el mediano y largo plazo en el contexto del cambio climático global y con la integración de grupos de investigación multidisciplinarios (agrónomos, biólogos moleculares, mejoradores, fitopatólogos, meteorólogos, etc.) (Paterson y Lima, 2010; 2011). Otro nicho de oportunidad se basa en el desarrollo de investigación básica y aplicada de Aspergillus y sus aflatoxinas en México, pues es escaso el estudio a nivel genético-molecular en cepas Mexicanas del hongo y de sus aflatoxinas, así como del estudio integrativo del patosistema maíz-Aspergillus-aflatoxinas. Poco se sabe del análisis a nivel genético, de estructura genética de poblaciones, distribución de morfotipos, interacciones morfotipos-genotipos de maíz, etc. Tampoco se conducen estudios consistentes relativos a la genómica funcional de los componentes del patosistema ni de su interacción, bajo condiciones ambientales particulares como estrés por sequía y/o altas temperaturas, lo que se agrupa en el mecanismo denominado 'quorum-sensing' y el 'complejo Velvet' identificados en A. flavus y sus implicaciones en las rutas del metabolismo secundario (Cleveland et al., 2009; Georgianna y Payne, 2009; Amaike y Keller, 2011; Amare y Keller, 2014).

Es necesario, además, mantener los cuidados previos a la cosecha para evitar la contaminación por hongos. En campo, proveer buenos niveles de humedad y evitar el estrés hídrico, así como suelos con buena fertilidad o suplementado con los niveles de nutrimentos recomendados para el cultivo. Una vez verificada la cosecha, debe procurarse que las condiciones de humedad en el almacén sean bajas, proporcionar aireación para evitar la formación de 'puntos calientes' en los almacenes o silos (Bucio et al., 2001; Magan y Aldred, 2007). Otra opción es el uso de sustancias como los ácidos orgánicos que inhiben el crecimiento de los hongos o bien, enzimas que degradan selectivamente las aflatoxinas (Magan y Aldred, 2007).

Una nueva alternativa se basa en la liberación experimental y en siembra piloto de germoplasma de maíz transgénico o genéticamente modificado con resistencias individuales o 'apiladas' a herbicidas (glifosato, glufosinato de amonio), plagas de lepidópteros, plagas de raíces y tallos que, al menos en el norte de Tamaulipas, muestran resistencia a plagas de lepidópteros de la mazorca y menores niveles de infección por hongos potencialmente toxígenos en la mazorca (SENASICA, 2014). Sin embargo, la investigación está en proceso y aún no se tienen resultados concluyentes y, adicionalmente, están los resultados previos de Reddy et al. (2007) quienes concluyeron que el uso de germoplasma de maíz con resistencia a glifosato y que permite el control de malezas con dicho herbicida, mostró incrementos en la incidencia de A. flavus en el suelo tratado con el herbicida, aunque no incrementos en la presencia de aflatoxinas y fumonisinas en el grano. Aparentemente, el glifosato se une a la matriz coloidal del suelo dejando menor proporción de material biodisponible para interferir con el crecimiento del hongo aflatoxigénico o, incluso, con cepas no aflatoxigénicas usadas como biocontrol (Accinelli et al., 2005; Yin et al., 2008).

CONCLUSIONES

El estado actual del estudio de Aspergillus y sus micotoxinas en maíz ha mostrado avances importantes en fechas recientes en México, de modo que las altas incidencias y daños observados en décadas pasadas se han reducido significativamente. Sin embargo, el problema persiste debido a que se pueden presentar los factores que propician la incidencia de hongos toxigénicos en campo y almacén, generando pérdidas millonarias en el sector agrícola. Por ello, es imperativo continuar con el diagnóstico y análisis de la incidencia y daños por aflatoxinas en el cultivo del maíz en México. Por ello se considera necesario establecer programas de prevención que incluyan los siguientes puntos: 1) divulgación de los problemas económicos y de salud causados por la contaminación con aflatoxinas, 2) utilización de programas de Análisis de Peligros y de Puntos Críticos de los Sistemas de Control ('Hazard Analysis Critical Control Point Systems', HACCPS), 3) desarrollar y consolidar la evaluación de las nuevas estrategias de tipo químico, cultural y/o biológico de la incidencia de hongos aflatoxigénicos y sus aflatoxinas; 4) mantener el mejoramiento genético del maíz por resistencia a plagas de insectos, factores de estrés ambiental como sequía y altas temperaturas y sentar las bases para el mejoramiento genético consistente enfocado a la caracterización genética e identificación de progenitores, su cruza y selección y mapeo de genes de resistencia a la infección por hongos aflatoxigénicos o inhibitorios de la síntesis de aflatoxinas y 5) establecer y mantener programas de salud epidemiológica y de diagnóstico tanto en humanos como en animales, conjuntamente con la creación de normas oficiales y métodos de diagnóstico y cuantificación específicos baratos, reproducibles, rápidos, sensibles y confiables para las aflatoxinas en el maíz producido en México.

AGRADECIMIENTOS. La primera autora agradece el financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (beca número 421712) y del programa PIFI beca número B110668 del Instituto Politécnico Nacional por el financiamiento de sus estudios de posgrado en el CBG-IPN. Los costos de publicación de este trabajo son financiados por la Fundación PRODUCE Tamaulipas (proyectos 2009-1750 y 2012-2112) y el Instituto Politécnico Nacional.

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