Detección por RT-PCR Punto Final y Tiempo Real de Tres Especies de Viroides en Cítricos de Nuevo León y Tamaulipas, México

Detection of Three Citrus Viroids Species From Nuevo Leon and Tamaulipas, Mexico by Conventional and Real Time RT-PCR

César Enrique Guerrero Gámez¹, Omar Guadalupe Alvarado Gómez¹*, Hazael Gutiérrez Mauleón¹, Ramiro González Garza², María Genoveva Álvarez Ojeda³ y Mauricio Luna Rodríguez⁴

¹ Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de Nuevo León, Av. Universidad s/n Ciudad Universitaria, San Nicolás de los Garza, N.L. CP 66451, México. * Correspondencia: omar-alvarado@prodigy.net.mx

³ INIFAP, Campo Experimental Río Bravo, Tamaulipas.

⁴ Dirección General de Investigaciones, Universidad Veracruzana.

Recibido: Enero 24, 2013
Aceptado: Marzo 13, 2013

Resumen

Se desarrollaron tres protocolos de RT-PCR tiempo real con el sistema SYBR Green y se compararon con el método convencional RT-PCR punto final para la detección del viroide de la exocortis de los cítricos (CEVd), el viroide del enanismo del lúpulo (HSVd) y el viroide del enanismo de los cítricos (CDVd) tras evaluar distintas combinaciones de iniciadores específicos; adicionalmente se realizó el análisis para los tres viroides referidos en 90 muestras de cítricos colectadas en huertas del noreste de México. Las muestras evaluadas comprendieron diferentes especies colectadas en los municipios de General Terán, Montemorelos y Marín, en Nuevo León, además de Río Bravo, Cd. Victoria e Hidalgo, en Tamaulipas. Se extrajo el ARN total de las muestras, y fueron analizadas mediante las técnicas de RT-PCR múltiple punto final y RT-PCR tiempo real con el sistema SYBR Green. Se detectó la presencia individual y conjunta de los viroides CEVd, HSVd y CDVd en las muestras analizadas. Usando la técnica de RT-PCR tiempo real con SYBR Green, se obtuvo un 41 % de muestras positivas a CEVd, 42 % a HSVd y 49 % al CDVd. Al comparar las técnicas de RT-PCR punto final y tiempo real, se obtuvieron resultados similares.

Palabras clave: RT-PCR, RT-PCR tiempo real, SYBR Green, CEVd, HSVd, CDVd.

Abstract

Three protocols were developed based on realtime RT-PCR with SYBR Green system and were compared with conventional RT-PCR for detection of the Citrus exocortis viroid (CEVd), Hop stunt viroid (HSVd) and Citrus dwarf viroid (CDVd) using specific primers combinations; additionally, we conducted the analysis of citrus viroids from 90 citrus threes samples collected in orchards in the northeast of Mexico. Evaluated citrus samples comprised different species from the municipalities of General Teran, Montemorelos and Marin, Nuevo Leon, besides Rio Bravo, Victoria city and Hidalgo, Tamaulipas. Total RNA was extracted from the samples and analyzed by the techniques of multiple RT-PCR and real time RT-PCR with the SYBR Green system. We detected CEVd, HSVd and CDVd viroids individually and jointly in the samples. Using real-time RT-PCR with SYBR Green, we found a 41 % of CEVd positive samples, 42 % for HSVd and 49 % to CDVd. Comparing endpoint multiplex RT-PCR with realtime RT-PCR techniques, minimal differences were obtained in the results.

Keywords: RT-PCR, real-time RT-PCR, SYBR Green, CEVd, HSVd, CDVd.

México se ha distinguido por su producción de limón persa, limón mexicano, naranja dulce, toronja, mandarina y otras especies de cítricos, y es de los principales países exportadores a nivel mundial (USDA, 2012).

En los años 1972 y 1977 se identificaron los agentes causales de las enfermedades exocortis (CEVd) y cachexia de los cítricos (HSVd), respectivamente (Diener, 1979). Posteriormente, en 1988 se identificó el viroide del enanismo de los cítricos, CDVd (Duran-Vila et al., 1988). Los viroides de cítricos se encuentran distribuidos en distintas partes del mundo, tales como: la región del Mediterráneo, Australia, Norte y Sur de África, Europa, Asia, además del Norte, Centro y Sur del Continente Americano (Timmer et al., 2000; Hadidi et al., 2003; Önelge, 2010).

Los viroides de los cítricos pertenecen a la familia Pospiviroidae. Están constituidos por moléculas de ARN monocatenario cerradas covalentemente sin capacidad codificante, y capaces de replicarse de forma autónoma utilizando la maquinaria transcripcional de las células que parasitan. El tamaño de su genoma es de alrededor de 246402 nt; presentan forma de varilla o ramificada y ocasionan diferentes síntomas de acuerdo con las combinaciones entre especies de viroides y hospederos, pudiendo existir incluso sinergismo entre viroides, cuando ocurren de manera simultánea en más de una especie. Pueden provocar agrietamientos y escamas en la corteza, enanismo, epinastia, entre otros daños, en especies susceptibles (Flores, 2001; Vidalakis et al., 2004; Bernard y Duran-Vila, 2005; Verniere et al., 2006; Bagherian y Izadpanah, 2010).

Habitualmente los viroides de los cítricos se diagnostican mediante bioensayos en la planta indicadora cidra Etrog Arizona 861-S1 (Citrus medica L.) injertada sobre limón rugoso (C. jambhiri Lush) y Volkameriano (C. volkamer Ten y Pasq.) pudiendo observarse la expresión de los síntomas de 3 a 6 meses después de su inoculación (Palacio et al., 1999). Sin embargo, estos síntomas no permiten identificar la especie del viroide. El análisis de ácidos nucleicos mediante técnicas moleculares constituyen una alternativa a los bioensayos para la detección e identificación de las especies de los viroides de los cítricos (Malfitano et al., 2005; Verniere et al., 2006; Mohamed et al., 2009). Algunos trabajos han demostrado el potencial de la transcripción inversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa convencional (RT-PCR) para la detección individual de viroides, y la RT-PCR múltiple para la detección simultánea de varios viroides (Ito et al., 2002; Bernard y Duran-Vila, 2005; Wang et al., 2009). En México hay pocos trabajos sobre la detección de viroides de cítricos por RT-PCR (Alvarado et al., 2000; Almeyda et al., 2002 y 2005). En años recientes se han puesto a punto técnicas de detección de patógenos y moléculas mas sensibles y rápidas, -PCR en tiempo real utilizando el sistema de SYBR Green y sondas TaqMan, la cual intercala una molécula fluorescente en la doble cadena de ADN produciendo una señal que revela, con la ventaja de la amplificación exponencial en cada ciclo térmico. Gracias a su potencial la RT-PCR en tiempo real se ha utilizado para la detección del viroide del tubérculo fusiforme de la papa, además de viroides de cítricos como el CEVd, HSVd y CDVd (Tessitori et al., 2005; Rizza et al., 2009).

Debido a los problemas que causan los viroides en los cítricos, además de la escasa información que existe sobre su incidencia en México, es necesario realizar estudios en plantaciones citrícolas en la región noreste para tener una percepción más precisa de la situación fitosanitaria actual. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue implementar el método de RT-PCR en tiempo real con el sistema SYBR Green y compararlo con el método de RT-PCR punto final al determinar la incidencia de tres viroides de los cítricos en plantaciones comerciales de los estados de Nuevo León y Tamaulipas, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estandarización de RT-PCR tiempo real. Se estandarizó la técnica de RT-PCR tiempo real en un solo paso con el sistema iScript^TM One-Step RT-PCR con SYBR Green® (Bio-Rad), utilizando controles positivos de ARN total conteniendo a los viroides CEVd, HSVd y CDVd; los cuales fueron proporcionados por la empresa Biociencia S.A. Como controles negativos se utilizó ARN de plantas libres de viroides. Se evaluaron varias combinaciones de iniciadores específicos a cada uno de los viroides anteriores (Cuadro 1). Para cada uno de los ensayos se utilizó un programa térmico de acuerdo con las especificaciones del fabricante cambiando solamente la temperatura de anillamiento siendo de 56 °C para CEVd, y 58 °C para HSVd y CDVd. Además para comprobar que los iniciadores no formaran dímeros, a cada ensayo fue integrada una curva de disociación de 80 ciclos a una temperatura de 55-95 °C durante 1 min. con incrementos de 0.5 °C por cada ciclo.

Análisis de muestras de campo. Se procesaron 90 muestras colectadas en ocho huertas comerciales de cítricos, ubicadas en los municipios de Gral. Terán (Las Anacuas y Jorge Martínez), Montemorelos (Hacienda "El Mexiquito") y Marín (Campo Experimental de la Facultad Agronomía de la UANL) del estado de Nuevo León; además se obtuvieron muestras del Campo Experimental del INIFAP y del huerto comercial "Real de Catorce" ubicados en los municipios de Río Bravo y Cd. Victoria, respectivamente; y de los predios "El Desengaño" y "Puente Azul", en Hidalgo, Tamaulipas. Las especies de cítricos muestreadas fueron: naranjo dulce (Citrus sinensis L.), toronja (C. paradisi ón (C. limon L.) y mandarina (C. reticulata B.). Se colectaron de manera aleatoria ramas y hojas de árboles adultos. Se realizó una extracción del ácido ribonucleico total (ARN) de las muestras mediante el método comercial Trizol® (Molecular Research Center), y se analizaron las muestras por RT-PCR múltiple punto final y RT-PCR tiempo real en un solo paso. Los iniciadores utilizados en las reacciones de RT-PCR punto final se describen en el Cuadro 2.

Las reacciones de RT-PCR múltiple punto final fueron llevadas a cabo en un volumen 25 µL de acuerdo con Wang et al. (2009) con ligeras modificaciones. Se utilizó el kit Super Script One step RT-PCR system Taq DNA Polimerasa Platinum^® (Invitrogen). En las mezclas de reacción se incorporaron los iniciadores a una concentración de 0.2 µM para CDVd, 0.5 µM para CEVd y 0.1 µM para HSVd (Cuadro 2). El protocolo consistió en mezclar 12.5 µL de amortiguador 2X, 6.75 µL de una mezcla de 6 iniciadores, 0.5 µL de enzima RT-Taq y de 150 a 200 ng de ARN (2 µL). Se completó el volumen total con agua estéril libre de nucleasas. Los parámetros térmicos de las reacciones, comienzan con una incubación a 50 °C durante 30 min para la síntesis de ADNc, seguido por una desnaturalización inicial a 94 °C por 2 min y 35 ciclos con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, un anillamiento a 58 °C por 30 s, y una extensión a 68 °C por 45 s, además de una extensión final a 68 °C durante 7 min. Los productos de la RT-PCR múltiple fueron analizados en geles de agarosa al 1.5 %, teñidos con bromuro de etidio (0.5 µg/mL^-1) y visualizados en un transiluminador de luz ultravioleta.

Las mismas muestras fueron procesadas mediante RT-PCR en tiempo real utilizando el sistema de SYBR Green con el uso de iniciadores específicos a los viroides CEVd, HSVd, y CDVd, seleccionados en la etapa anterior. Las reacciones fueron realizadas en una mezcla de 25 µL con el kit iScript^TM One Step RT-PCR SYBR Green® (Bio-Rad). La reacción fue formada con una concentración de iniciadores de 0.3 µM. El protocolo utilizado de SYBR Green consistió en 12.5 µL de amortiguador 2 X, 0.75 µL de cada uno de los iniciadores, 0.5 µL de enzima iScript RT, 2 µL de ARN y se completó el volumen total a 25 µL con agua estéril libre de nucleasas. Los parámetros de temperatura para HSVd y CDVd fueron los siguientes: 50 °C durante 10 min, 95 °C por 5 min, 35 ciclos con un paso de desnaturalización de 95 °C por 10 s, anillamiento de 58 °C durante 30 s. Los parámetros de temperatura para CEVd fueron iguales que el anterior con la diferencia que la temperatura de anillamiento fue de 56 °C durante 30 s.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Estandarización de RT-PCR tiempo real. Los resultados obtenidos con los iniciadores específicos a los viroides CEVd, HSVd y CDVd utilizando los controles positivos fueron satisfactorios. En el caso de CEVd, el umbral de amplificación (Ct) fue rebasado a los 21, 22, 31 y 33 ciclos para las combinaciones de iniciadores (tratamientos) 1, 2, 3 y 4 respectivamente; para HSVd el umbral se rebasó a los 22, 24, 27 y 28 ciclos correspondiendo a los tratamientos 5, 7, 6 y 8; y para CDVd, los valores de Ct fueron 31 y 35 ciclos para los tratamientos 9 y 10 respectivamente (Figura 1). De las cuatro combinaciones de iniciadores utilizadas para CEVd y cuatro para HSVd, dos combinaciones para CEVd y dos para HSVd formaron dímeros de iniciadores de acuerdo con las curvas de disociación (datos no mostrados) lo cual en algunos casos ocasionó una amplificación inespecífica. En el caso de los 3 viroides los controles negativos no rebasaron los umbrales de fluorescencia. Para el análisis de las 90 muestras, se seleccionaron los pares de iniciadores que tuvieron el menor umbral de amplificación (Ct) para cada viroide sin formación de dímeros, en el caso de exocortis se seleccionó la combinación CEVd-5/CEVd-F (tratamiento 1) con un Ct de 21, para cachexia se escogió HSVd-b/CVdII-H1 (tratamiento 5) con un Ct de 22 y para CVd-III la combinación CVd-IIIC/CVd-IIIF (tratamiento 9) con un Ct de 31. La temperatura de anillamiento adecuada para CEVd fue de 56 °C, y para HSVd y CDVd fue de 58 °C; dichas temperaturas funcionaron de manera adecuada para cada uno de los ensayos con los iniciadores seleccionados para cada viroide. Los resultados anteriores coinciden con los trabajos hechos por Tessitori et al. (2005) y Rizza et al. (2009), en la utilización del RT-PCR en tiempo real con SYBR Green como método de detección de viroides de los cítricos. Sin embargo una de las diferencias del presente estudio fue la utilización de un kit de RT-PCR en tiempo real en un solo paso a diferencia de los utilizados por los autores antes mencionados los cuales utilizaron kit en dos pasos. Por lo tanto, el protocolo aquí utilizado es más rápido y tienen menos probabilidad de contaminarse las muestras, además de que los iniciadores aquí utilizados fueron diferentes a los referidos por Tessitori et al. (2005) y Rizza et al. (2009). En este trabajo también se logró obtener un mismo programa térmico para los viroides HSVd y CDVd el cual pude ser utilizado en análisis simultáneos de ambos viroides reduciendo el tiempo de detección.

Análisis de muestras de campo. Con respecto a las reacciones de RT-PCR múltiple punto final, de las 90 muestras de diferentes especies de cítricos colectadas en los estados de Nuevo León y Tamaulipas, fue clara la detección de CEVd, pero no de HSVd ni de CDVd, ya que los productos obtenidos de las reacciones con los iniciadores utilizados, se empalmaron en el gel debido a que tienen una talla similar aunque si fue posible diferenciarlos. De las 90 muestras colectadas y analizadas, 37 resultaron positivas a CEVd, 38 a HSVd y 44 a CDVd utilizando la RT-PCR múltiple convencional (Cuadro 3), sin embargo al ser corroboradas mediante el sistema de RT-PCR con SYBR Green se observó una diferencia de una muestra para CEVd y una para CDVd, resultando 36 y 43 muestras positivas respectivamente (Figura 2). En el caso de HSVd, los resultados obtenidos fueron los mismos con ambos protocolos.

CONCLUSIONES

Se desarrolló un protocolo de RT-PCR en tiempo real con el sistema SYBR Green, rápido, específico y sensible para la detección de los viroides de cítricos CEVd, HSVd y CDVd. Las combinaciones de iniciadores CEVd-5/CEVd-F; HSVd-b/CVdII-H1 y CVdIII-C/CVdIII-F, dieron los mejores resultados para la detección de los viroides CEVd, HSVd y CDVd respectivamente, mediante RT-PCR tiempo real con el sistema SYBR Green. El análisis de 90 muestras de cítricos por RT-PCR múltiple punto final y RT-PCR tiempo real con SYBR Green, tuvieron diferencias mínimas en la detección de los viroides variando sólo en dos muestras. En las localidades de estudio, los ensayos mostraron una mayor incidencia del CDVd con un 49 % del total de muestras analizadas, seguido de 42 % para HSVd y 41 % para CEVd.

AGRADECIMIENTOS. A la Fundación Produce Tamaulipas proyecto clave: PRECI 3557449^a y al proyecto de Fortalecimiento de Cuerpos Académicos de la SEP por el financiamiento. Al laboratorio Biociencia S. A. de C. V. por facilitar las instalaciones para la realización del proyecto de investigación.

LITERATURA CITADA

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