Identificación Morfológica y Molecular de Penicillium oxalicum Causante de Pudrición de Tallos y Frutos de Tomate

Morphological and Molecular Identification of Penicillium oxalicum Causing Stem and Fruit Rot in Tomato

Raúl Allende Molar, Paola Alejandra Picos Muñoz, Isidro Márquez Zequera, José Armando Carrillo Fasio, Raymundo Saúl García Estrada y Josefina León Félix

Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. km 5.5 Carretera a El Dorado, Culiacán, Sinaloa, CP 80110, México. Correspondencia: rallende@ciad.mx

Recibido: Noviembre 21, 2012
Aceptado: Enero 14, 2013

Resumen

Durante los ciclos hortícolas 2008, 2009 y 2010 se observó la presencia de una pudrición de tallos en plantas de tomate en áreas de cultivo en Culiacán, Sinaloa. En los tallos enfermos consistentemente se observó el crecimiento de un hongo de color gris-azul similar a Penicillium sp. Considerando que Penicillium no es un patógeno común en tomate, el objetivo fue determinar la especie de Penicillium que se encontraba infectando tallos y evaluar su potencial para producir pudrición en frutos en poscosecha. La patogenicidad de los aislamientos fue determinada mediante inoculaciones artificiales sobre tallos de plantas y en frutos sanos de tomate. La identificación morfológica del aislamiento fúngico incluyó la velocidad de crecimiento, la coloración de las colonias, los pigmentos producidos en los medios Agar Czapek Levadura y Agar Extracto de Malta y la forma y longitud de las esporas y el conidióforo. La identificación por técnicas moleculares se realizó mediante la amplificación y secuenciación de un fragmento del ADNr, con los iniciadores ITS1/ITS4. Penicillium oxalicum Currie & Thom fue identificado como patógeno en plantas y en frutos de tomate en poscosecha en México.

Palabras clave: Tomate, pudrición del tallo, pudrición poscosecha.

Abstract

During the agricultural cycles 2008, 2009, 2010, a tomato stem rot has been observed in tomato growing areas in Culiacan, Sinaloa. A Penicillium sp. was consistently isolated from infected stem; Since Penicillium sp is not a common pathogen on tomato, the objective was to identify the Penicillium sp. affecting tomato stems and to evaluate the potential of the fungus to cause postharvest rot in tomato fruits. Pathogenicity of the isolates was determined by artificial inoculations made in stems of healthy tomato plants. The morphological identification included the evaluation of colony growth rate and color, pigments of the colonies on Czapek Yeast Agar and Malt Extract Agar and the spore and conidiophore morphology. The identification by molecular techniques was performed by amplification and sequencing of a fragment of rDNA, with primers ITS1/ITS4. Penicillium oxalicum was identified as a pathogen on tomato plants and as a postharvest pathogen on tomato fruit.

El valle de Culiacán, en Sinaloa, es considerado una de las principales áreas productoras de tomate en México. En el ciclo agrícola 2010 se cultivaron 14,095 ha de tomate en Sinaloa (SIAP, 2012). En los ciclos agrícolas 2007-2008 y 2008-2009 se observó una pudrición en tallos de plantas de tomate establecidas bajo condiciones de malla sombra e invernadero. Los síntomas observados en plantas enfermas se presentan en las heridas que ocurren cuando los tallos son sujetos a la poda de formación. Las heridas se tornan de color café acompañadas de un moho de color gris-azul en un periodo de 24-48 h (Figura 1a). Las hojas de la parte superior de las plantas afectadas muestran un crecimiento irregular y un color que se torna amarillo. En etapas avanzadas de la enfermedad se puede observar que el tallo principal se seca completamente, causando la muerte de la planta. Además de estos síntomas, en el tomate se ha observado que cuando el hongo infecta los frutos, éstos desarrollan una coloración café en el sitio de la lesión, además de un moho gris azulado; finalmente, se observa una pudrición acuosa, la cual avanza formando un círculo a partir del sitio de la infección inicial. Debido a que existen escasos antecedentes de esta enfermedad y se desconoce el potencial de pérdidas que ésta podría causar en la región, es necesario identificar al agente causal de la pudrición en tallos de tomate y adicionalmente evaluar su potencial patogénico en poscosecha en frutos de tomate.

La identificación tradicional de especies de hongos se basa principalmente en el aislamiento del microorganismo en medio de cultivo y la posterior observación de las características morfológicas. Esta metodología es laboriosa y requiere de conocimiento amplio para diferenciar entre especies estrechamente relacionadas. Actualmente, en la identificación de microorganismos se están utilizando técnicas moleculares en las que se extraen ácidos nucleicos y después se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estas técnicas basan su utilidad al explotar secuencias polimórficas dentro de los espacios internos transcritos (ITS1 e ITS2) del ADN ribosomal o secuencias únicas en el ADN (Larena y Melgarejo, 2009).

Aunque ya hay un resumen previo publicado (Picos et al., 2011), en este escrito se describen mayores detalles metodológicos, características de crecimiento en medios de cultivo del patógeno responsable de la pudrición de tallos en tomate, técnicas moleculares utilizadas para su identificación y evidencia de patogenicidad en frutos de tomate.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento del microorganismo fitopatógeno. Muestras de tallos de tomate híbrido imperial se colectaron de dos invernaderos del valle de Culiacán (Figura 1a). Pequeños trozos tomados del margen de las lesiones necróticas desarrolladas en los tallos, se sembraron en el medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA). Se realizaron cultivos monospóricos en colonias desarrolladas en PDA y posteriormente, se tomaron discos de crecimiento activo del hongo y se preservaron en tubos con PDA inclinado con aceite mineral.

Caracterización morfológica. El aislamiento e identificación del género Penicillium, se realizó mediante la metodología y claves propuestas por Pitt (1979), que consistió en sembrar el hongo en dos medios de cultivo específico para el género: Agar Czapek Levadura (CYA) (NaNO₃ 3 g; extracto de levadura 5 g; sacarosa 3 g; K₂HPO₄·3 H₂O 1.3 g; MgSO₄·7H₂O 0.5 g; KCl 0.5 g; FeSO₄·7 H₂O 0.01 g; CUSO₄·5H₂O 0.005 g; ZnSO₄·7 H₂O 0.01 g; agar 15 g; agua 1000 mL; pH 6.3) y Agar Extracto de Malta (MEA) (Extracto de malta 30 g; bactopeptona 1 g; glucosa 20 g; CUSO₄·5H₂O; ZnSO₄·7H₂O; agar 20 g; agua 1000 mL; pH 5.3). Posteriormente, en un periodo de siete días, se midieron las siguientes características macromorfológicas: el diámetro, coloración de la colonia y coloración al reverso de la colonia; y micromorfológicos como la presencia de conidios, fiálides, ramificación, conidióforos, cleistotecios y esclerocios. Los resultados obtenidos se compararon con la base de datos del Centro de Biodiversidad Fúngica (CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures) de la Real Academia de Ciencias y Artes de Los Países Bajos.

Extracción de ADN. Para la extracción del ADN, se utilizó el micelio de una colonia crecida durante tres días en medio MEA. El ADN se extrajo siguiendo la técnica de Ahrens y Seemuller (1992), la cual consiste en tomar micelio en crecimiento en el medio de cultivo. El micelio se depositó en un mortero y se homogenizó con 1 mL de buffer de extracción CTAB (Tris 1 M, pH = 8; NaCl 5 M; EDTA 5 M, pH 8; CTAB 2 %, PVP 1 %); posteriormente, se incubó a 65 °C durante 30 min. La cantidad y calidad del ADN extraído se determinó midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm de longitud de onda en un biofotómetro 6131 Eppendorf; la integridad, se verificó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 %, teñidos con bromuro de etidio. Las muestras de ADN se almacenaron a -20 ° C para su posterior uso.

Amplificación de un fragmento de las regiones ITS 1 / ITS 2. Se amplificó un fragmento de las regiones internas ITS1 e ITS4 (Internal Transcribed Spacer) entre los genes ribosomales (ADNr) 18S - 5.8S y 5.8S - 28S al utilizar los iniciadores ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') / ITS2 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al., 1990). Se utilizó el sistema Promega Go Taq Flexi DNA Polymerase y la mezcla de reacción se llevó a las siguientes concentraciones de cada uno de los componentes: 1 X de Go Taq Flexi Buffer, 2 µm de MgCl₂ 200 µm de dinucleótidos trifosfatados (dNTP's), 1 U de Go Taq Polymerase, 0.2 µM de cada iniciador, 200 ng de ADN de Penicillium sp. y el resto de agua nanopura estéril, para un volumen total de 50 µL . La amplificaciones se realizaron con un ciclo inicial de 2 min para la activación de la enzima; 35 ciclos que comprendieron: desnaturalización a 95 °C por 1 min, alineamiento a 57 °C por 1 min, y extensión a 72 °C por 2 min; finalmente, un ciclo de extensión final a 72 °C por 10 min.

Todas las Reacciones en Cadena de la Polimerasa (PCR) se llevaron a cabo en un Peltier Thermal Cycler PTC-200 (BIORAD, México), las amplificaciones se verificaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % preparado con amortiguador Tris - Acetato - EDTA 1X y corrido en el mismo amortiguador a 87 V cm^-3 aproximadamente 1 h. El gel se tiñó con 1 µL de bromuro de etidio (10 mg mL^-1) y las bandas se visualizaron en un transiluminador UV.

Secuenciación del fragmento amplificado. El producto de PCR obtenido con los iniciadores ITS 1/ITS 4 se verificó por electroforesis en gel de agarosa al 1 %, observándose una banda de 590 pb. Posteriormente, el fragmento amplificado con los iniciadores se purificó con el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Cat. A9281 Madison, WI, USA). La secuenciación se realizó por electroforesis capilar con un secuenciador automático ABI PRISM 310 (Genetic Analizer PE Applied Biosystems), en la unidad de Biología Molecular del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM. La secuencia de nucleótidos obtenida se comparó con una búsqueda de secuencias homólogas usando el algoritmo BLASTX (Altschul et al., 1990), en la base de datos del banco de genes del NCBI (National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov).

RESULTADOS

Aislamiento del microorganismo fitopatógeno. De las muestras de tallos de tomate con síntomas de pudrición, consistentemente se aisló un microorganismo de tipo fúngico. Las colonias del hongo en medio PDA mostraron un color verde azulado y un diámetro de crecimiento de 40 mm a los siete días. Se asignó la clave poxal220108 a un aislamiento fúngico representativo como referencia para las posteriores pruebas de patogenicidad y caracterización morfológica y molecular.

Pruebas de patogenicidad. Los tallos de plantas de tomate que se inocularon artificialmente con la cepa del hongo poxal220108 y que se mantuvieron en condiciones de alta humedad relativa mostraron síntomas de pudrición similares a los observados en campo (Figura 1b). De los reaislamientos, de los tallos enfermos se obtuvieron colonias y estructuras fúngicas similares a las del hongo inoculado (Figura 2a), lo que confirmó la patogenicidad del aislamiento fúngico inoculado. El reaislamiento de Penicillium sp. ocurrió sólo en plantas en las que se observaron los síntomas característicos de esta pudrición, las plantas inoculadas con el disco de medio de cultivo permanecieron sanas. La inoculación en frutos mostró que el hongo potencialmente puede infectar a frutos en los que haya ocurrido una herida ya que en todos los frutos inoculados, a los tres días después de la inoculación, se observó una pudrición y posteriormente se observó el micelio y esporulación del hongo. Los frutos en los que se depositó en la herida agua destilada esterilizada permanecieron sanos.

Identificación morfológica. De acuerdo con la base de datos del centro de biodiversidad de hongos (CBS), el agente causal de la pudrición de tallos y muerte de plantas de tomate es el hongo Penicillium oxalicum. Las características de crecimiento de P. oxalicum en medio MEA son: diámetro de la colonia de 30 mm con coloración blanco en las orillas y verde azulado hacia el centro (Figura 2b); en contraste, el crecimiento en medio CYA el diámetro de la colonia fue de 40 mm con una coloración blanco cremoso en las orillas y café pálido hacia el centro. El patrón de ramificación observado fue biverticilado. La estipe mostró una longitud de 220 µm x 5 µm de ancho, con 2 verticilios. Las fiálides fueron ampuliformes. Los conidios midieron 4.24 µm x 3.02 µm, de forma elipsoidal, lisos y en columnas. El aislamiento poxal220108 fue depositado en la Colección Nacional Microbiana y de Cultivos Celulares del CINVESTAV-IPN.

Cuadro 1

Identificación molecular. El análisis comparativo de la secuencia de ADN amplificado fue de 545 pb, contuvo parte del ITS1, la secuencia completa del 5.8 s ARNr y parte del ITS2 y mostró maxima identidad con secuencias del ITS de varios aislamientos de Penicillium oxalicum (Gen Bank no. acceso AB378505, AB485602, DQ123663). La secuencia del fragmento amplificado se depositó en la base de datos del NCBI con el número de acceso HM 452308.

DISCUSIÓN

La pudrición de tallos de tomate de invernadero ocasiona pérdidas en la producción que aun no han sido cuantificadas. La especie Penicillium oxalicum no se había reportado como patógeno de frutos de tomate en México, aunque existe un reporte de pudrición causada por esta especie en tallos de tomate en Japón (Umemoto et al., 2009) y en frutos de tomate en Korea (Kwon et al., 2008). Penicillium oxalicum Currie & Thom también se ha asociado con pudriciones de tallos en pepino de invernadero en Canadá (Jarvis et al., 1990) y en Inglaterra, Holanda, Dinamarca, Suecia y Noruega (O'Neill et al., 1991). Los síntomas ocasionados incluyen lesiones color café en la parte basal de la planta con una esporulación del hongo en color azul-verdoso y posteriormente la muerte de la planta (Jarvis y Ferguson, 1992).

En la caracterización mediante técnicas moleculares, el fragmento amplificado por PCR con los iniciadores ITS1/ITS4 resultó de 545 pb, lo cual coincide con lo reportado por Chen et al. (2001) quienes utilizaron los ITS de estas regiones del ADNr para identificar levaduras de importancia médica y Umemoto et al. (2009), quienes obtuvieron una homología del 100 % en la identificación de especies de Penicillium, al utilizar la secuenciación de regiones intergénicas. En cuanto al análisis comparativo de las secuencias con la base de datos del NCBI, la limitante de analizar las secuencias de nucleótidos obtenidas del ADNr, en particular de Penicillium spp. es la presencia de polimorfismos. Por ejemplo, Dupont et al. (2006) solamente identificaron la especie en 35 aislamientos, de un grupo de 60, cuando utilizaron la amplificación por PCR de la región del ITS y la utilización de un grupo de enzimas de restricción. Esto sugiere que los estudios de biología molecular están ayudando a comprender la filogenia de las especies del género Penicillium, pero llegar a establecer una clasificación monofilética de los hongos mitospóricos, sería complicado ya que ésta no correspondería en muchas ocasiones, con la clasificación morfológica existente (Peterson, 2000). En nuestro estudio la utilización de características morfológicas y moleculares se complementan y confirman la identificación de la especie de Penicillium involucrada en la enfermedad en tallos y frutos de tomate.

CONCLUSIONES

La identificación morfológica y por técnicas moleculares coincidieron en asignar a Penicillium oxalicum como el agente causal de la pudrición de tallos y muerte de plantas de tomate. Este es el primer reporte en México que demuestra el potencial de Penicillium oxalicum para causar infecciones en frutos de tomate en poscosecha.

LITERATURA CITADA

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