Detección Molecular de Fitoplasmas en Nopal Tunero (Opuntia ficus-indica) con Síntomas de Engrosamiento del Cladodio

Molecular Detection of Phytoplasmas in Prickly Pear (Opuntia ficus-indica) with Thickening of the Cladodio

Alba Suaste Dzul¹, Reyna Isabel Rojas Martínez¹, Emma Zavaleta Mejía¹, y Daisy Pérez Brito²

¹ Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Fitosanidad-Fitopatología, Montecillo, Edo. de México, CP 56230, México. Correspondencia: rojas@colpos.mx.

Recibido: Diciembre 01, 2011
Aceptado: Febrero 23, 2012

Resumen

Durante 2010 se detectaron en la zona tunera de Nopaltepec, Estado de México, plantas de nopal con síntomas de deformación y engrosamiento del cladodio, mosaico, amarillamiento, proliferación y deformación de frutos en toda la planta o en parte de ella. Dado que el síndrome se ha relacionado con la infección por fitoplasmas, el objetivo de esta investigación fue detectar mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la presencia de fitoplasmas en diferentes estratos del cladodio y raíz de plantas de nopal. El ADN extraído de las muestras de plantas con síntomas y asintomáticas, se amplificó primero con los iniciadores universales P1/P7 y P1/Tint, y posteriormente mediante PCR anidada utilizando los iniciadores R16F2/R16R2, se obtuvo un fragmento de 1 200 pb en todas las muestras con los síntomas antes mencionados. El análisis de los patrones de restricción generados con las endonucleasas HaeIII, KpnI y MseI (TrU91), reveló que el fitoplasma pertenece al grupo 16SrXIII-Mexican periwinkle virescence.

Palabras clave: Mollicutes, PCR anidada, RFLP-PCR, gen 16S rRNA.

Abstract

Keywords: Mollicutes, Nested PCR, RFLP-PCR, 16S rRNA gene.

Résumé

En 2010, dans la région de Nopaltepec, État de Mexico, ont été détectés des plants de figue de barbarie présentant des symptômes de déformation et grossissement du cladode, mosaïque, jaunissement et déformation des fruits sur tout ou partie de la plante. Le syndrome a été associé à une infection occasionnée par phytoplasmes. Le but de cette recherche a été d'identifier par réaction en chaîne par polymérase (PCR) la présence de phytoplasmes dans différentes strates du cladode et dans la racine des plants de figue de barbarie. L'ADN extrait d'échantillons de plantes présentant des symptômes et de plantes asymptomatiques, a d'abord été amplifié avec des amorces universelles P1/P7 et amorces P1/Tint, puis par PCR nichée en utilisant des amorces R16F2/R16R2. Un fragment de 1200 pb a été obtenu dans tous les échantillons avec les symptômes ci-dessus. L'analyse des profils de restriction générés par les endonucléases HaeIII, KpnI et MseI (TrU91) a révélé que le phytoplasme appartient au groupe 16SRXIII-virescence de la pervenche mexicaine (mexicaine periwinkle virescence).

Mots clés: Mollicutes, PCR nichée, RFLP-PCR, gène ARNr 16S.

Los fitoplasmas son organismos procariontes sin pared celular, Gram positivos, que se encuentran agrupados en la clase Mollicutes (Bertaccini et al., 1999; Hogenhout y Segura, 2010). Hasta el momento no se ha logrado su cultivo in vitro por lo que su detección, identificación y clasificación se ha realizado mediante el uso de técnicas moleculares como PCR y RFLP y análisis filogenéticos comparando la secuencia del gen ribosomal 16S (Hodgetts et al., 2007). Los fitoplasmas se han asociado con más de 700 enfermedades de importancia económica en plantas hortícolas, forrajeras, ornamentales y silvestres (Weintraub y Beanland, 2006). En diferentes partes del mundo como Estados Unidos, Italia, China y Líbano se ha reportado la presencia de fitoplasmas en cactáceas (Bertaccini et al., 2007; Cai et al., 2008; Choueiri et al., 2005; Tessitori et al., 2005). En México, algunas ornamentales de Opuntia sp. en las que se han detectado fitoplasmas presentan características anatómicas inusuales como son proliferación de brotes, tallos amarillos, mosaicos y coloraciones púrpuras, alteraciones que les confieren un valor económico adicional pues son ofrecidas en altos precios a coleccionistas de cactus en diversos viveros comerciales (Aviña et al., 2009). En la zona de San Martín de la Pirámides, Edo. de México, en el cultivo de nopal tunero (Opuntia ficus-indica) se ha reportado una enfermedad conocida como "planta macho" atribuida a la presencia de fitoplasmas (Hernández et al., 2009), en los últimos años se le ha considerado como el principal factor limitante de la producción de tunas en el país, ya que las plantas afectadas presentan deformación, proliferación de brotes, engrosamiento y desarrollo de cordiforme del cladodio y detención del crecimiento. En el municipio de Nopaltepec, Estado de México, se observaron en plantas de nopal tunero síntomas como: engrosamiento, mosaico y amarillamiento, manchas anulares en cladodios, además de proliferación y deformación de frutos que pudieran estar asociados a la presencia de fitoplasmas. Con base en lo anterior, el objetivo de este estudio fue detectar e identificar mediante PCR-RFLP la presencia de fitoplasmas en nopal tunero con el síndrome descrito.

MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción del ADN. Para la extracción de ADN se tomó tejido de la parte superior, media y basal de cada uno de los 35 cladodios colectados con síntomas de engrosamiento, proliferación, deformación de frutos y manchas anulares y de plantas asintomáticas. De las plantas mantenidas en invernadero se tomó tejido radical para llevar a cabo la extracción de ADN.

El ADN se extrajo con el producto DNeasy Mini Kit (QIAGEN©) de la siguiente manera: se pesaron 30-40 mg de tejido y se maceraron con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino sin dejar que la muestra se descongelara. Al tejido macerado se le añadieron 400 μL de buffer de extracción AP1 y se incubó a 65°C en baño de agua (Wheaton Rotary Vacuum Evaporator NE-1) por 10 min con homogenización ocasional. Después se agregaron 130 μL de buffer AP2 y se incubó durante 5 min en hielo, se centrifugó por 5 min a 14 000 rpm en una centrifuga Silent SPIN (Continental Lab Products), el sobrenadante se transfirió a una columna QIA shredder Mini Spin, y se volvió a centrifugar a 14 000 rpm durante 2 min. El nuevo sobrenadante se colocó en un tubo eppendorf estéril. Posteriormente se agregaron 1.5 μl del buffer AP3 y se transfirió a la columna DNeasy Mini Spin, centrifugándose por 1 min a 8 000 rpm. Una vez capturado el ADN, la columna se lavó dos veces en 500 μL del buffer AW y se centrifugó por 2 min a 14 000 rpm. La columna se transfirió a un tubo eppendorf estéril de 1.5 mL, se adicionaron 50 μL de buffer AE (previamente calentado a 65°C), se incubó durante 5 min a temperatura ambiente y se centrifugó por 1 min a 8 000 rpm.

La determinación de la calidad e integridad del ADN se hizo en un gel de agarosa al 1% (p /v) en buffer TAE 1X (Tris acetato-EDTA) mediante electroforesis a 90 V por 40 min y la cuantificación del ADN se realizó en un espectrofotómetro (NanoDrop® ND-1 000 V 3.2.1) según el método descrito por Sambrook et al. (1989).

Detección de fitoplasmas por PCR. Debido a la baja concentración de estos patógenos dentro de la planta, para detectar su presencia es necesario realizar una doble amplificación por PCR. En la primera reacción (PCR directa) se utilizó el par de iniciadores universales P1 (Deng y Hiruki, 1991) y P7 (Schneider et al., 1995) que amplifican un fragmento de 1 800 pb, y la combinación de iniciadores P1/Tint (Smart et al., 1996) que amplifican un fragmento de 1 600 pb, en un volumen de reacción final de 25 μL, que contenía 1X de amortiguador para PCR (10x, 100 mM tris-HCl, 500 mM KCl, pH 8.3) (Biogénica), 0.2 mM de cada iniciador (Invitrogen®), 1U de ADN polimerasa Amplificasa® (Biogénica) y 200 ng de ADN objetivo. La amplificación se llevo a cabo en un termociclador Techne® TC-300, con un primer paso de desnaturalización a 94 °C por 5 min, seguido por 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1.5 min a 54 °C y 2 min a 72 °C, y un paso final de extensión de 10 min a 72 °C.

Para aumentar la sensibilidad de detección, se realizó una segunda amplificación (PCR anidada) con los iniciadores R16F2/R16R2 (Gundersen y Lee, 1996) que amplifican la región 16S rDNA de los fitoplasmas, como molde se utilizó el ADN el producto de amplificación de la primera reacción de PCR, diluido en agua destilada estéril [1:20 (v/v)] empleándose las mismas concentraciones y reactivos que en la PCR directa. La amplificación se desarrolló en un termociclador Techne® TC-300, iniciando con una desnaturalización de 95°C por 5 min, seguida de 35 ciclos de 94 °C por 30 s, 1.5 min a 53 °C y 72 °C durante 1.5 min, y un paso final de 10 min a 72 °C. Los productos de amplificación obtenidos (1 200 pb) se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % (p/v) en amortiguador TAE 1X a 100 V por 50 min, previamente teñido con bromuro de etidio. El marcador de peso molecular empleado como referencia fue de 100 pb (Roche©). Las imágenes del gel se visualizaron y analizaron con luz ultravioleta en un fotodocumentador UV (Bio Rad©, Gel Doc 2000) con el programa QuantityOne 4.1.1. En todos los casos se utilizó como control positivo ADN de coco infectado con el fitoplasma del Amarillamiento Letal del Cocotero (ALC). Como control negativo se utilizó agua bidestilada estéril libre de DNAsas y RNAsas.

RFLP-PCR. Para determinar el grupo al cual pertenece el fitoplasma detectado, el fragmento amplificado se sometió a un análisis de RFLP. El fragmento se digirió con las endonucleasas de restricción AluI, HaeII, HaeIII, KpnI, TrU91 y Tsp5091 (Promega® Madison WI, EU) y los productos de restricción se separaron en geles de agarosa 1.5 % teñidos con bromuro de etidio. Los patrones de RFLP obtenidos se compararon con los reportados en la literatura (Lee et al., 1998).

Secuenciación y análisis del gen 16 S rDNA. El producto de la PCR anidada se purificó (Wizard Promega®) y se secuenció (Automatic Sequencer 3700xl DNA Analyzer, Applied Biosystem®). Las secuencias del 16S rADN obtenidas se compararon con las de referencia en el GenBank, usando la herramienta BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

RESULTADOS

En la primera reacción de PCR con los iniciadores P1/P7, se observó el producto de amplificación de 1 800 pb en el control positivo y sólo en cinco de las muestras analizadas.

Con el par de iniciadores P1/Tint, el producto de amplificación esperado de 1 600 pb siempre se obtuvo tanto en las muestras de tejido radical de plantas enfermas como en el control positivo del Amarillamiento Letal del Cocotero (datos no mostrados). En la Figura 2, se observan fragmentos de 1 200 pb obtenidos con PCR anidada que se reportan para establecer la presencia de fitoplasmas sp. (Líneas 1-8, y 10-13), en esta última se ubicó el control positivo para ALC (línea 13). De las 35 muestras de nopal analizadas por PCR anidada en este estudio, 34 resultaron positivas a fitoplasmas sp. (Cuadro 1). La comparación de la secuencia de nucleótidos, utilizando el programa BLAST, del fragmento amplificado con las reportadas en la base de datos del GenBank indicó que el genoma amplificado corresponde a la secuencia nucleotídica de un fitoplasma. El análisis de RFLP obtenidos con las endonucleasas de restricción HaeIII, KpnI y MseI (TrU91), indicó que el fitoplasma pertenece al grupo 16SrXIII (Mexican periwinkle virescence) (Lee et al., 1998) (Figura 3).

DISCUSIÓN

Los síntomas de engrosamiento, proliferación y de formación de frutos han sido asociados a la presencia de fitoplasmas (Bertaccini et al., 2007; Hernández et al., 2009); sin embargo, en las plantas colectadas en la zona tunera de San Felipe Teotitlán, Edo. de México, también se detectó la presencia de virus en muestras de nopal con mosaico y amarillamiento (datos no publicados). Lo anterior indica que la sintomatología observada puede ser producto de la coinfección de las plantas de nopal por virus y fitoplasmas, de ahí que el diagnóstico basado solamente en síntomas puede ser impreciso.

Es bien conocido que los fitoplasmas se encuentran en tejido del floema de la planta y con frecuencia en bajos títulos (Harrison et al., 2002; Lee et al., 1995; Wei et al., 2000) por lo que en muchas ocasiones no se pueden detectar en la primera PCR, en nuestro caso con el uso del par de iniciadores P1/Tint se logró amplificar siempre el gen ribosomal 16S del fitoplasma en la PCR directa, aunque en algunas casos, el producto de amplificación se observó tenue. La irregularidad en la detección en la primera reacción de amplificación, posiblemente se debió a que el fitoplasma se encontraba en baja concentración (Hodgetts et al., 2007). En el caso de la muestra Np07 no se detectó la presencia del fitoplasma ni en la PCR directa ni en la PCR anidada a pesar de presentar el síntoma de engrosamiento, lo cual pudiera deberse a la baja titularidad del patógeno en la planta. La dificultad para detectar al fitoplasma en los cladodios del nopal se puede explicar porque la distribución de los mismos en la planta varía según la época del año. En el caso del declinamiento del peral (Pear Decline Phytoplasma) ocasionado por fitoplasmas se ha observado que éstos ya no se detectan en las partes aéreas de los árboles durante los meses de invierno debido a las bajas temperaturas y que sobreviven en las raíces nuevas para recolonizar el tallo y las ramas en la primavera siguiente. Este comportamiento se explica por la nula producción de nuevos elementos cribosos y la disminución considerable de la actividad de los elementos maduros durante el invierno (Errea et al., 2002). El Mulberry Dwarf Phytoplasma tampoco se detecta durante el invierno en los órganos reproductores y las yemas de árboles de mora pero sí en las raíces (Jian et al., 2004).

Es importante destacar que en las cuatro muestras de nopal asintomáticas también se encontraron fitoplasmas, por lo que es necesario emplear técnicas moleculares para la detección precisa y confiable de este tipo de patógenos, sobre todo durante el proceso de obtención de material propagativo para el establecimiento de nuevas plantaciones. En campo, la presencia de plantas asintomáticas puede tener implicaciones importantes en el progreso temporal y espacial de la enfermedad. El síntoma de engrosamiento del cladodio se reportó por vez primera en México y posteriormente se encontró en Sudáfrica e Italia, sin que se conociera al agente causal (Pimienta, 1990); otros síntomas mostrados por las plantas afectadas incluían proliferación de flores, deformación y amarillamiento de cladodios jóvenes. Hernández et al. (2009) reportaron que el fitoplasma asociado con el síndrome de engrosamiento y proliferación del nopal tunero en San Martín de las Pirámides, Estado de México, pertenece al grupo 16SrII, mientras que en la presente investigación la secuencia obtenida correspondió al grupo 16SrXIII; esto sugiere que más de un grupo de fitoplasmas puede estar asociado con esta enfermedad.

CONCLUSIONES

En cladodios de nopal con síntomas de engrosamiento, proliferación, mosaico y amarillamiento provenientes del municipio de Nopaltepec, Edo. de México, se detectó mediante PCR de manera consistente la amplificación del genoma de fitoplasmas, la comparación de secuencias y el análisis de RFLP indico que se trata de un fitoplama del grupo 16SrXIII.

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por otorgar beca al primer autor del artículo durante los estudios de maestría.

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