Cambios Morfológicos en Células de Chile CM334 Inoculado con Phytophthora capsici y con Fusarium oxysporum

Morphological Changes in Cells of Chilli CM334 Inoculated with Phytophthora capsici and Fusarium oxysporum

Diana Sanzón Gómez¹, Guadalupe Valdovinos Ponce¹, Reyna Isabel Rojas Martínez¹, Emma Zavaleta Mejía¹, María Alejandra Mora Avilés² y Lorenzo Guevara Olvera³

¹ Instituto de Fitosanidad, Colegio de Postgraduados (IFIT-CP), km 36.5 Carr. México-Texcoco, Montecillo, Edo. de México, CP 56230, México. Correspondencia: zavaleta@colpos.mx.

³ Instituto Tecnológico de Celaya, Departamento de Ingeniería Bioquímica, Av. Tecnológico y Antonio García-Cubas S/N Col. FOVISSSTE, Celaya, Gto., CP 38010, México.

Recibido: Octubre 17, 2011
Aceptado: Enero 12, 2012

Resumen

El chile (Capsicum annuum) CM334 es resistente al oomiceto Phytophthora capsici (Pc), tal resistencia se manifiesta por una reacción de hipersensibilidad (RH); sin embargo, este genotipo es susceptible a Fusarium oxysporum (Fo). En el presente trabajo se compararon los cambios celulares en la RH inducida por Pc, interacción incompatible (II), y la necrosis inducida por Fo, interacción compatible (IC). La necrosis y la colonización por el oomiceto en la II se confinó al sitio de la inoculación en el tallo; y en la IC, el patógeno colonizó todo el tallo y la necrosis se limitó a la zona de inoculación. La degradación de las paredes celulares en la IC fue evidente, en cambio en la II, solamente se observó el colapso de las células. En la II el 31% de los núcleos de las células corticales fueron rojos sugiriendo una RH y en la IC el 71% fueron globosos y de color gris claro sugiriendo muerte por necrosis.

Palabras clave: Interacción compatible, interacción incompatible, oomicetos, reacción de hipersensibilidad, muerte celular programada, necrosis.

The chilli (Capsicum annuum) CM334 is resistant to oomycete Phytophthora capsici (Pc), such resistance is manifested by a hypersensitive reaction (HR); however, this genotype is susceptible to Fusarium oxysporum (Fo). In this study we compared the cellular changes in the HR-induced by Pc, incompatible interaction (II), and Fo-induced necrosis, compatible interaction (CI). The necrosis and colonization by the oomycete in II was confined to the site of inoculation in the stem, and in CI, the pathogen colonized the whole stem and the necrosis was limited to the site of inoculation. Cell wall degradation was evident in the CI, whereas in the II, only the collapse of the cells was observed. In the II, 31% of the nuclei of cortical cells were red suggesting a HR and in the CI 71% of the nuclei were globose and light gray suggesting a death by necrosis.

Keywords: Compatible interaction, incompatible interaction, oomycetes, hypersensitive reaction, programmed cell death, necrosis.

Résumé

Le piment (Capsicum annum) CM334 est résistant à l'oomycète Phytophthora capsici (Pc), cette resistance se manifestant par une réaction d'hypersensibilité. Cependant, ce génotype présente une sensibilité à Fusarium oxysporum (Fo). Dans cette étude, nous avons comparé les changements cellulaires dans la réaction d'hypersensibilité induite par Pc (l'interaction incompatible), et la nécrose induite par Fo (l'interaction compatible). La nécrose et la colonisation occasionnées par l'oomycète dans l'interaction incompatible ont été limitées au site d'inoculation dans la tige. Dans l'interaction compatible, l'agent pathogéne a colonisé toute la tige et la nécrose a été limitée au site d'inoculation. La dégradation des parois cellulaires était évidente dans l'interaction compatible, alors que dans l'interaction incompatible a été observé l'effondrement des cellules. Dans l'interaction incompatible 31% des noyaux des cellules corticales étaient rouges, suggérant une réaction d'hypersensibilité. Dans l'interaction compatible 71% étaient globuleux et gris, suggérant la mort par nécrose.

Mots clés: Interaction compatible, interaction incompatible, oomycètes, réaction d'hypersensibilité, mort cellulaire programmée, nécrose.

El chile (Capsicum annuum) es un cultivo de gran importancia económica en México, y la enfermedad conocida como marchitez del chile inducida por el oomiceto Phytophthora capsici (Pc) causa grandes pérdidas en las zonas productoras. El chile criollo tipo serrano CM334 ha destacado por su alto grado de resistencia al oomiceto que se manifiesta por una reacción de hipersensibilidad (RH) (Bonnet et al., 2007). Durante la RH, las células localizadas alrededor del sitio de penetración se "suicidan" lo que trae como resultado que la infección y el avance del patógeno se detenga. La RH ha sido considerada un tipo de muerte celular programada (MCP). En frutos de chile (Capsicum baccatum) resistente a Colletotrichum gloeosporioides (Glomerella cingulata), se observaron varias características citológicas típicas de la MCP, como lo son la separación de la membrana plasmática de la pared celular, la condensación del citoplasma, la dilatación del retículo endoplásmico, la presencia de numerosas vacuolas pequeñas, núcleos heterocromáticos y menos osmofílicos, y fragmentación del ADN. En contraste, en frutos susceptibles (C. annuum) hubo degradación de la pared celular, fragmentación de vacuolas, degradación del núcleo y citoplasma, y condensación del citoplasma (Kim et al., 2004). Recientemente se observó que algunas plantas de CM334 murieron después de haber sido inoculadas con Pc (datos no publicados). La muerte de estas plantas pudo haber sido el resultado de la pérdida de resistencia o bien producto de una RH tan violenta y extensiva a nivel del cuello de las plantas que éstas terminaron por sucumbir. Dada la importancia del genotipo CM334, calificado como el resistente universal a Pc y que constituye una fuente potencial de resistencia al oomiceto (Glosier et al., 2008), se consideró conveniente comparar los cambios morfológicos celulares de las plantas de chile CM334 en la interacción incompatible con P. capsici, con aquellos desarrollados en la interacción compatible con Fusarium oxysporum (Fo). Semillas germinadas de chile CM334 y Yolo Wonder (YW) (utilizado como control susceptible a Pc) se plantaron en vasos de plástico y se mantuvieron en una cámara de crecimiento a 25±2 °C con 14 h de luz y 10 h de oscuridad.

Los patógenos Pc (cepa 6143) y Fo se cultivaron a temperatura ambiente en medio V8 y PDA, respectivamente. Plantas en etapa de 4-6 hojas verdaderas, se inocularon realizando una punción en el nudo de las hojas cotiledonarias y sobre esta área se colocó un disco de medio de cultivo de 0.5 cm de diámetro con micelio. Para las plantas de CM334 se tuvieron tres tratamientos: 1) inoculación con Pc, 2) inoculación con Fo y 3) testigo (con punción y disco de medio de cultivo sin micelio), y para YW se tuvieron sólo dos: 1) inoculación con P. capsici, y 2) testigo. En las inoculaciones con Pc, se consideraron los tiempos 12, 24 y 48 h posteriores a la inoculación (hpi) y 48, 96 y 120 hpi en el caso de Fo. Cada tiempo contó con su respectivo testigo. Además a los nueve días posteriores a la inoculación (dpi), en cinco plantas de CM334 inoculadas con Pc se evaluó, por abajo del sitio de la punción e inoculación el avance de la necrosis y colonización sistémica, ya que toda la parte apical del tallo colapsó.

La fijación e inclusión con parafina de los tallos se hizo con el protocolo de López et al. (2005). Las muestras se cortaron transversal y longitudinalmente a 8 |j.m de grosor con un micrótomo HYRAx M 25 marca ZEISS y se montaron en portaobjetos. Posteriormente se realizó una tinción doble safranina (metilcelosolve) - verde rápido (metilcelosolve) (López et al., 2005) y los cortes se observaron en un microscopio de luz VE-B6 marca Velab. En cortes observados bajo el objetivo de 40x se contaron y caracterizaron los núcleos de las células corticales y medulares del tallo, también se registró el número de células del xilema que contenían polifenoles o hifas. Se observaron muestras de todos los tiempos y tratamientos, pero estas variables sólo se evaluaron en CM334-Pc 24 hdi, CM334-Fo 48 hdi, CM334-Testigo 24 hdi, YW-Pc 24 hdi y YW-Testigo 24 hdi. Fue en estos tiempos en los que se observaron diferencias evidentes entre tratamientos. Todos los cortes que se evaluaron fueron del área donde se hizo la punción e inoculación. En los tratamientos donde se inoculó Pc, sólo se evaluó el tiempo 24 hpi debido a que a las 12 hpi no se observaron cambios morfológicos evidentes entre tratamientos y para las 48 hpi la totalidad del tallo en el área de punción e inoculación estaba colapsada. En el caso de la inoculación con Fo, se eligió el tiempo de 48 hpi porque fue en ese tiempo en el que se observaron los cambios más evidentes entre tratamientos.

En la interacción compatible YW-Pc los primeros síntomas de necrosamiento se presentaron a las 24 hpi y a los 5 dpi todas las plantas murieron. La presencia de micelio y esporangios a lo largo del tallo de todas las plantas, evidenció que el avance del patógeno no se detuvo. En la interacción incompatible CM334-Pc se observó el necrosamiento a las 24 hpi y a los 9 dpi el necrosamiento avanzó en el tallo sólo 2.06 cm por debajo del sitio de punción e inoculación. No se detectó la presencia de micelio y esporangios en el segmento basal de tallo analizado, lo que indicó que el avance del oomiceto finalmente fue detenido. En la interacción CM334-Fo la longitud de la necrosis fue en promedio de 0.33 cm a los 3 dpi, de 0.52 cm a los 23 dpi y a los 30 dpi el hongo avanzó sistémicamente hasta el segmento del tallo evaluado más distante al punto de inoculación; en todos los fragmentos se registró la presencia de micelio, microconidos y macroconidios. Las plantas testigo a los 30 dpi no presentaron síntomas de necrosamiento o signos de algún patógeno. Con excepción del tratamiento YW-Pc, en todos los demás se distinguieron en las células de los cortes de tejido analizados, tres tipos principales de núcleos: 1) Normales, con formas variadas (esféricos, ovalados o alargados), de color gris claro y con presencia de gránulos generalmente pequeños y oscuros, con un nucléolo pequeño de color anaranjado (Figura 1A). 2) Rojos, generalmente esféricos u ovalados, condensados (contraídos), de apariencia granulosa y color rojo; los gránulos del núcleo fueron de color rosa oscuro a rojo y el nucléolo con frecuencia no fue distinguible (Figura1B). 3) Globosos, núcleos grandes y esféricos, de color gris claro, con pocos gránulos oscuros y con un nucléolo grande de color anaranjado brillante situado generalmente en el centro del núcleo (Figura1C). En todas las plantas testigo, solamente en las células dañadas por la punción se observó la acumulación de polifenoles (formando estructuras esféricas de color rojo y textura lisa) y a las 24 h posteriores a la punción (hpp), las células del tallo mostraron el 98.5% de núcleos con apariencia normal. En cambio en la interacción incompatible (CM334-Pc), el colapso de tejidos avanzó hasta la médula del tallo (pero sin degradación aparente de las paredes celulares) a las 24 hpi y el 30.9% de los núcleos de las células de la corteza, no colapsadas, fueron rojos (Figura 1B). Las hifas del oomiceto se encontraron entre las paredes celulares del tejido cortical y medular del tallo y en el 10.9% de los elementos del vaso del xilema. En la interacción compatible (CM334-Fo), a las 48 hpi las células localizadas en el sitio de la inoculación mostraron mayor acumulación de polifenoles, en comparación con la incompatible y las células en contacto con ellos se degradaron total o parcialmente. En esta interacción 70.8% de los núcleos visibles en la corteza fueron globosos (Figura 1C), y sólo el 0.3% presentó color rojo y se localizaron en sitios con acumulación de polifenoles o cercanos a las hifas. Estos últimos núcleos, a diferencia de los observados en la interacción incompatible, mantuvieron un nucléolo grande (Figura 1D). Las hifas de Fo invadieron inter e intracelularmente al parénquima y al 1.7% de los elementos de vaso del xilema. En la interacción compatible YW-Pc casi la tercera parte del diámetro del tallo fue colapsado presentando una evidente degradación de las paredes celulares a las 24 hpi y el 14.3% del total de núcleos observados en la corteza fueron de color rojo y granulosos. Las hifas crecieron intercelularmente en las células del parénquima y también se observaron dentro del 13.2% de los elementos de vaso del xilema.

Dado que Pc no avanzó sistémicamente en CM334, se infiere que la planta mostró resistencia al patógeno y que la necrosis observada fue producto de una rápida e intensa RH. En las plantas susceptibles del cv Yolo Wonder todo el tallo mostró necrosis y fue colonizado; así mismo, en la interacción compatible CM334-Fo, el patógeno creció sistémicamente a lo largo del tallo como lo indicó el hecho de que en todos los segmentos analizados hubo desarrollo del patógeno, confirmandose la susceptibilidad de CM334 a este hongo. Aunque en las tres interacciones evaluadas se presentaron síntomas de necrosamiento, hubo claras diferencias estructurales a nivel de tejidos, lo que indica que los mecanismos responsables de la necrosis fueron diferentes. En las interacciones compatibles YW-Pc y CM334-Fo fue evidente la degradación de las paredes celulares desde las 12 hpi, debido posiblemente a la actividad de enzimas líticas producidas por estos patógenos (Roncero et al., 2000; Feng et al., 2010), y a que los mecanismos de defensa de las plantas no se dispararon tan rápido ni con la magnitud necesaria para defenderse del ataque por el patógeno. En contraste, en las células de los tallos de CM334 inoculados con Pc, las paredes celulares no mostraron mayor degradación aunque si sufrieron colapso. En la interacción CM334-Pc la acumulación de compuestos fenólicos pudo haber contribuido a evitar la colonización del tejido por parte el oomiceto, ya que se ha reportado que los ácidos fenólicos solubles contenidos en tallos de variedades resistentes de chile están asociados con su resistencia a Pc (Fernández y Liddell, 1997). Por el contrario, la gran acumulación de compuestos fenólicos en la interacción CM334-Fo no pudo evitar la colonización, debido quizás a que estos compuestos no fueron nocivos para este hongo o a que hubo diferencias en el tipo de fenoles acumulados en uno y otro caso. Se sabe que los núcleos de células bajo diferentes tipos de MCP sufren una condensación o contracción y se tornan de coloración oscura (Guimaráes y Linden, 2004). Esto coincide con lo observado en células de la interacción CM334-Pc donde se presentó el mayor porcentaje de núcleos rojos (30.9%) en comparación con las interacciones compatibles CM334-Fo (0.3%) y YW-Pc (14.3%). Es posible que en la interacción YW-Pc algunas células en las que se observaron núcleos rojos y granulosos también hayan sucumbido por un proceso de MCP, sólo que al presentarse con menor frecuencia (14.3%) en comparación con el genotipo resistente CM334 (30.9%), no se evitó la colonización por el oomiceto. Sin embargo, la posibilidad de que se trate de dos tipos de núcleos rojos con características ultraestructurales diferentes no puede descartarse; de ahí que es necesario verificar bajo microscopía electrónica de transmisión si la ultraestructura de los núcleos rojos de la interacción compatible YW-Pc es similar o no a la de la incompatible CM334-Pc. Por otro lado, algunas de las características de los núcleos de tipo globoso presentes en la interacción compatible CM334-Fo coinciden con las reportadas en interacciones planta-patógeno compatibles, donde los núcleos presentaban un nucléolo grande y prominente o los núcleos no fueron deformados y contenían cromatina menos densa que núcleos de células con MCP (Jones et al., 1974; Kosslak et al., 1997). Estos autores comentan que el núcleo parece ser el primer organelo que reacciona a los estímulos y que los cambios sufridos presumiblemente indican una actividad metabólica nuclear alta. En la presente investigación se encontraron claras diferencias estructurales entre la interacción incompatible CM-334- Pc y las interacciones compatibles CM334-Fo y YW-Pc. A nivel de microscopía de luz, las diferencias en la estructura celular observadas entre las interacciones evaluadas, sugieren que en las interacciones compatibles (YW-Pc y CM334-Fo) la muerte celular fue producto de la actividad de los metabolitos secretados por el patógeno (a nivel de pared celular), mientras que la muerte celular en la interacción incompatible (CM334-Pc) se debió probablemente a una MCP que inhibió el avance del oomiceto a lo largo del tallo de la planta.

LITERATURA CITADA

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