Detección del Virus Tristeza de los Cítricos Mediante Anticuerpos Contra la Proteína Recombinante p25 de la Cápside Bajo un Sistema de Inmunoimpresión

Detection of Citrus tristeza virus with Antibodies Developed to the Recombinant p25 Capsid Protein by Direct Tissue Blot Immunoassay

María Magdalena Iracheta Cárdenas¹, Lourdes del Carmen Arrieta García¹ y Mario A. Rocha Peña²

¹ Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas, Instituto de Biotecnología. Ave. Universidad s/n. Cd. Universitaria. San Nicolás de los Garza, NL, CP 66450, México.

² UANL/FCB, Laboratorio de Virología Vegetal. Apdo. Postal 128 F. Cd. Universitaria. San Nicolás de los Garza, N.L., CP 66450, México. Correspondencia: mario.rochape@uanl.edu.mx.

Recibido: Marzo 26, 2012
Aceptado: Abril 24, 2012

Resumen

El virus tristeza de los cítricos Citrus tristeza virus (CTV) es de distribución mundial y ocasiona una de las enfermedades de mayor importancia económica en el cultivo de los cítricos. El análisis masivo de muestras de cítricos para la detección del CTV se lleva a cabo en forma rutinaria mediante la técnica serológica ELISA, o a través de su variante de inmunoimpresión directa en membranas de nitrocelulosa. En el presente trabajo se evaluó el empleo de anticuerpos desarrollados contra la proteína recombinante p25 del CTV para la detección del virus bajo un sistema inmunoimpresión en membranas de nitrocelulosa, empleando plantas de cítricos sanas y plantas con infección natural en el campo. Con la combinación de anticuerpos desarrollados en cabra (CB) anti-CTV y de conjugado comercial anti-IgG de cabra acoplada a fosfatasa alcalina, se obtuvo una reacción positiva con plantas infectadas por el CTV y negativa con plantas sanas. Asimismo, la combinación de anticuerpos CB anti-CTV conjugados con biotina y empleando avidina-AP como conjugado comercial, fue igualmente efectiva para discriminar plantas sanas e infectadas por el CTV. Adicionalmente, los anticuerpos CB anti-CTV desarrollados contra la proteína recombinante p25 de la cápside del CTV mostraron resultados comparables con los kits comerciales de inmunoimpresión de Plant Print y Agdia para la detección del CTV.

Palabras clave: Biotina, conjugados enzimáticos, estreptavidina.

Abstract

Citrus tristeza virus (CTV) is widespread and causes one of the most economical important viral diseases of citrus. The large scale analysis of citrus samples for CTV detection is conducted routinely by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or its variant named direct tissue blot immunoassay (= immunoprinting). In this study, we evaluated the use of polyclonal antibodies developed to recombinant p25 CTV coat protein for virus detection under an immunoprinting system by using healthy and field CTV infected citrus samples. The combination of goat (CB) anti-CTV/IgG anti-goat-AP conjugate provided a positive reaction with CTV infected plants, and negative with healthy citrus. In addition, the combination of goat CB anti-CTV coupled with biotin, plus avidin-AP as commercial conjugate was equally effective in discriminating CTV infected from healthy citrus. Furthermore, antibodies developed to the recombinant p25 CTV coat protein, either untagged or biotin conjugated showed comparable results with commercially available immunoprinting kits for CTV detection by Plant Print and Agdia.

Résumé

Le Citrus Tristeza Virus (CTV) est répandu dans le monde entier et provoque une maladie d'importance économique notable dans la culture des agrumes. L'analyse massive d'échantillons d'agrumes pour détecter le CTV est effectuée régulièrement par la technique sérologique ELISA, ou à travers sa variante d'immunoprinting directe en membranes de nitrocellulose. La présente étude a évalué l'utilisation d'anticorps développés contre la protéine recombinante p25 du CTV afin de détecter le virus dans un système d'immunotransfert sur des membranes de nitrocellulose, en utilisant des plants d'agrumes sains et infectés naturellement sur le terrain. Grace á la combinaison d'anticorps développés chez la chévre (CB) anti-CTV et le conjugué commercial anti-IgG de chévre couplé á la phosphatase alcaline, une réaction positive a été obtenue avec des plantes infectées par le CTV, et une réaction négative avec des plantes saines. Par ailleurs, la combinaison d'anticorps CB anti-CTV conjugués avec la biotine, en utilisant l'avidine-AP comme conjugué commercial, était également efficace pour discriminer les plantes saines et celles infectées par le CTV. De plus, les anticorps CB anti-CTV développés contre la protéine recombinante p25 de capside du CTV ont montré des résultats comparables avec des kits commerciaux d'immunoprinting de Plant Print et Agdia pour détecter le CTV.

Mots clés: biotine, conjugués enzymatiques, streptavidine.

El virus tristeza de los cítricos (Citrus tristeza virus = CTV: familia Closteroviridae, género Closterovirus) es de distribución mundial y es el agente causal de una de las enfermedades de mayor importancia de cultivos de cítricos. El daño mas dramático se presenta en árboles de naranja, toronja y mandarina injertados en patrón de naranjo agrio (Citrus aurantium.), así como en árboles de limón mexicano (Citrus aurantifolia) independiente del portainjerto utilizado o de que sean plantadas directo de semilla (Rocha et al., 1995, 1998).

La detección en México del CTV es regulada a través de la Norma Oficial Mexicana No. 031 (SAGARPA, 2001) y es operada por los Comités Estatales de Sanidad Vegetal de cada estado citrícola. El análisis masivo de muestras de cítricos se lleva a cabo rutinariamente mediante la técnica serológica ELISA, o a través de su variante de inmunoimpresión directa en membranas de nitrocelulosa (DTBIA = direct tissue blot immunoassay). Desde el establecimiento de la Campaña de detección del CTV en 1995 (SAGAR, 1997) se han detectado plantas infectadas por el CTV en 20 entidades citrícolas del país (SAGARPA, 2006). No obstante la ausencia de síntomas de declinamiento en el campo, la presencia de plantas infectadas por el CTV representa una condición de peligro latente ya que la mayoría de las plantaciones con cítricos están injertadas en patrón de naranjo agrio, el cual es hipersensible a este virus. Asimismo, en la zona costera del Pacífico existen plantaciones extensivas de limón mexicano las cuales son vulnerables a infecciones por el CTV, lo cual también representa un factor de riesgo para esta agroindustria. Aunado a lo anterior la presencia en gran parte del territorio nacional del agente transmisor más eficiente del CTV, el pulgón café Toxoptera citricida (SAGARPA, 2006) agrava más la situación para la citricultura nacional en general con respecto a epifitias futuras por el CTV.

En nuestro laboratorio hemos desarrollado anticuerpos contra la proteína recombinante p25 de la cápside del CTV (Iracheta et al., 2008); tales anticuerpos son de reacción poliespecífica contra una gama de aislamientos del CTV con propiedades biológicas diversas y de orígenes geográficos distintos; asimismo, han mostrado ser eficientes mediante la técnica ELISA en el análisis masivo de muestras a nivel de campo y comparables con kits comerciales disponibles para la detección del CTV (Iracheta et al., 2009).

Partiendo que la Campaña Nacional de detección del CTV se basa en la técnica serológica ELISA en su modalidad de inmunoimpresión, se planteó el presente trabajo de investigación con los siguientes objetivos: 1) Evaluar la reactividad específica de los anticuerpos desarrollados contra la proteína recombinante de la cápside p25 bajo el sistema de inmunoimpresión para la detección del CTV, ya sea solos o conjugados con biotina y estreptavidina; y 2) demostrar la funcionalidad de los anticuerpos anti-p25 solos o marcados y compararlos contra los anticuerpos utilizados en kits comerciales de inmunoimpresión de Print Print de España y Agdia de Estados Unidos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Anticuerpos. Para los diferentes ensayos de evaluación y desarrollo de los métodos de conjugación se emplearon anticuerpos policlonales desarrollados en cabras (clave CB) contra la proteína recombinante de la cápside p25 del virus tristeza de los cítricos (Iracheta et al., 2008). Los anticuerpos CB anti-CTV presentes en el antisuero original se purificaron por precipitación con sulfato de amonio y se ajustaron a una concentración de 1 mg mL^-1 mediante espectrofotometría DO₂₈₀ (Clark et al., 1986).

Tejido de cítricos. Para esta parte del trabajo, se tuvo acceso a una huerta con antecedentes de tener árboles con infección natural por el CTV en el municipio de General Terán, Nuevo León. El acceso a esta huerta fue a través del Comité Estatal de Sanidad Vegetal, con sede en Montemorelos. Se colectaron un total de tres plantas con antecedentes previos de infección por el CTV, así como las plantas circundantes a ellas en los cuatro puntos cardinales. Las muestras consistieron en brotes recién expandidos (Figura 1A), colectados alrededor de la copa de los árboles, a una altura aproximada de 1.50 m sobre el nivel del suelo. Las muestras se colocaron en bolsas de polietileno con cierre hermético y se trasladaron al laboratorio bajo refrigeración. En un segundo muestreo se realizaron las impresiones directamente en el campo (Figura 1B-C), con tres impresiones de cada árbol a manera de repeticiones de cada muestra; las membranas con las muestras impresas se conservaron en sobres de papel bajo refrigeración previo a su uso.

Las muestras se colectaron de árboles de toronja (Citrus paradisi), naranjo (C. sinensis) y naranjo agrio. Adicionalmente, se incluyeron como testigos negativos en el muestreo plantas de naranjo y los híbridos de mandarina Ortanique y Murcott, colectadas en el Banco de Variedades del Campo Experimental General Terán (Cuadro 1). Asimismo, las plantas se colectaron a finales del mes de febrero y principios de marzo en dos años consecutivos (2008 y 2009). Todas las muestras colectadas se sometieron a la prueba de ELISA con anticuerpos policlonales anti-CTV específicos para la proteína recombinante p25 de la cápside (Iracheta et al., 2009) para verificar su condición con respecto al CTV (Cuadro 1).

Métodos de conjugación. Los anticuerpos desarrollados en cabra CB contra la proteína recombinante de la cápside del CTV se acoplaron a biotina y estreptavidina con diferentes agentes entre-cruzantes (Cuadro 2) siguiendo las metodologías de conjugación descritas por Scopes (1985).

En términos generales, cada uno de los protocolos de conjugación se llevaron a cabo con 1 mg mL^-1 de anticuerpos CB anti-CTV diluidos en solución amortiguadora de acetatos, TBS, o agua bidestilada, según fuera el caso y se acoplaron a las moléculas de biotina o estreptavidina en concentraciones de 1-5 mg (Scopes, 1985). Al final de cada protocolo, los conjugados preparados se sometieron en forma individual a diálisis en 4 L de solución amortiguadora de TBS 1% como sigue: un paso de diálisis durante 3 h a temperatura ambiente y uno más con solución nueva de TBS durante 18 h a 5°C.

Protocolo de inmunoimpresión (DTBIA) (Garnsey et al., 1993). El protocolo de imunoimpresión fue como sigue: 1.-Impresión del tejido (pecíolos y/o tallos) de cítricos en membranas de nitrocelulosa; 2.- Incubación de las membranas en solución de saturación (BSA 0.2%, Tween 20, 0.2% y Triton 100, 0.2%, en Tris salino pH 10), durante 10 min; 3.- Incubar las membranas con el anticuerpo anti-CTV (cabra CB, 1 μg mL^-1) diluido en solución de saturación e incubar a temperatura ambiente durante 2 h; 4.- Lavado de las membranas con Tris salino/Tween 20 al 0.2% con tres cambios durante 30 min; 5.- Incubar las membranas con el conjugado comercial anti-IgG de cabra acoplado a fosfatasa alcalina (Sigma A4187) diluido 1:30,000 en solución de saturación durante 2 h; 6.- Repetir el proceso de lavado señalado en el punto anterior; 7.- Aplicación de solución de revelado BCIP/NBT (Sigma B3804). Para el caso de anticuerpos de cabra anti-CTV acoplados ya sea a biotina o estreptavidina, junto con sus respectivos conjugados enzimáticos, éstos sustituyeron a los anticuerpos anti-CTV de cabra CB y su respectivo conjugado IgG anti-cabra, en las pruebas de inmunoimpresión. una vez establecidas las condiciones óptimas de los ensayos de inmunoimpresión, éstos se llevaron a cabo acabo en forma simultánea con los kits de inmnoimpresión de las compañías Plant Print (Valencia, España) y Agdia (Elkhart, Indiana, uSA). Cada estuche comercial se empleó según las recomendaciones de sus fabricantes, con sus anticuerpos y soluciones amortiguadoras; la única variante fue que se emplearon membranas Schleicher & Shuell BA-S 85. Los resultados se evaluaron en forma visual y con acercamiento mediante lentes con un aumento de 20X.

RESULTADOS

Implementación del sistema de inmunoimpresión con anticuerpos desarrollados contra la proteína recombinante del CTV. La efectividad de los anticuerpos de cabra CB anti-CTV se evaluó en un sistema de inmunoimpresión para la detección del CTV en muestras infectadas en forma natural en el campo.

En un primer ensayo, el tejido de las plantas colectadas en febrero del 2008 no tenía tejido lo suficiente tierno para efectuar las inmunoimpresiones sobre las membranas de nitrocelulosa, por lo que se tomó la determinación de someterlo a un proceso de congelación/descongelación previo a la impresión sobre las membranas (Figura 2A). Bajo este sistema, las muestras con antecedentes de ser positivas al CTV mostraron una reacción positiva al CTV mediante el empleo del anticuerpo CB de cabra sin marca (Figura 2B). Asimismo, muestras de tejido de plantas vecinas a las CTV positivas, así como el tejido de hídridos de mandarinas colectados del Banco de Variedades del Campo Experimental General Terán mostraron una reacción negativa al CTV (Figura 2B). En este mismo ensayo se evaluaron tres soluciones de saturación para determinar la mejor reacción al anticuerpo anti-CTV y resolución de color en las membranas de nitrocelulosa. La reacción de discriminación de muestras CTV positivas y negativas se obtuvo en forma consistente con la solución compuesta por Tween 20, 0.2% + Triton X-100, 0.2% + BSA 0.2 % diluidos en Tris salino (Figura 2B). Las soluciones de saturación compuestas por Tween 20 0.3% + BSA 0.2 % (Figura 2C) y Tween 1 % (Figura 2D), mostraron resultados inconsistentes de detección.

En la Figura 3 se muestra la reacción positiva en las muestras 1, 5 y 10 en las tres membranas a diferentes concentraciones de anticuerpo CB anti-CTV; 1:300, 1:1,000 y 1:3,000 (Figura 3B-D [C]) y anti-IgG de cabra-AP a una dilución de 1:30,000 como anticuerpo secundario. Se incubaron siguiendo el protocolo establecido, se pudo observar que a la tres diferentes diluciones se logró una discriminación eficiente de plantas sanas e infectadas por el CTV; sin embargo, con la dilución 1:1000 se obtuvieron los resultados mas consistentes en cuanto a la intensidad de la coloración azul-morada, seleccionando esta dilución para los ensayos posteriores.

Determinación del título de los anticuerpos CB anti-CTV conjugados con biotina y estreptavidina. La titulación de los anticuerpos anti-CTV, conjugados con biotina y estreptavidina, con cada uno de los agentes entrecruzantes (Cuadro 2), se efectuó en diluciones de 1:300, 1:1,000 y 1:3,000 para cada uno de ellos y se evaluaron mediante ensayos de inmunoimpresión con tejido sano e infectado por el CTV (Cuadro 1). Asimismo, los diferentes conjugados enzimáticos comerciales respectivos para cada uno de ellos (Cuadro 2) se emplearon a las diluciones recomendadas por los fabricantes.

Se obtuvieron resultados diversos en cuanto a consistencia y grados de intensidad en la señal de detección para muestras infectadas por el CTV, los cuales variaron desde escasa o nula señal, hasta señal intensiva distintiva de plantas infectadas por el CTV con respecto a las plantas sanas (datos no mostrados). De todos los conjugados preparados con los anticuerpos CB anti-CTV, la combinación de anticuerpos CB anti-CTV marcados con biotina vía hidrazida (1:3,000) + avidina-AP (1:1,000), mostró resultados similares de 100% de discriminación de muestras positivas y negativas (Figura 4). El resto de los conjugados preparados a base de biotina y estreptavidina (Cuadro 2) mostraron resultados inconsistentes de detección (datos no mostrados).

Evaluación de conjugados en ensayos de inmunoimpresión. Una vez determinada las diluciones óptimas del ensayo en cuanto a solución de saturación y dilución de cada uno de los anticuerpos anti-CTV sin marca y conjugados, se procedió a evaluar cada uno de ellos en ensayos de inmunoimpresión con las mismas muestras de cítricos con infección positiva al CTV enlistadas en el Cuadro 1 (Figura 1B-C), con tres impresiones de cada árbol a manera de repeticiones de cada muestra y su comparación en forma simultánea con los kits de inmnoimpresión de las compañías Plant Print y Agdia.

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se evaluaron anticuerpos desarrollados en nuestro laboratorio para la proteína recombinante p25 de la cápside del CTV (Iracheta et al., 2008) para la detección del virus en plantas de cítricos. El estudio consistió en evaluar los anticuerpos anti-CTV solos o marcados con biotina o estreptavidina en ensayos de inmunoimpresión en membranas de nitrocelulosa, teniendo como referencia muestras de plantas de cítricos sanas y con infección natural en el campo por el CTV.

Se determinó que los anticuerpos anti-CTV sin marca en dilución 1:1,000 y 1:3,000 fueron eficientes para discriminar en un 100% plantas infectadas por el CTV de plantas sanas (Figura 3C-D). Lo anterior empleando anti-IgG de cabra acoplada fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario en dilución 1:30,000. Asimismo, se encontró una eficiencia del 100% en la discriminación de muestras sanas de infectadas por el CTV fue el conjugado con biotina empleando hidrazida como vehículo de conjugación en dilución 1:3,000, en combinación con el conjugado comercial a base de avidina-AP en dilución 1:1,000 (Figura 4). Asimismo, estos resultados fueron consistentes y comparables con los obtenidos con los kits comerciales disponibles de inmunoimpresión para el CTV de las compañías Plant Print (Figura 5E) de España y Agdia (Figura 5F) de los Estados Unidos.

La técnica de inmunoimpresión desde su implementación (Garnsery et al., 1993), ha sido sujeta a ensayos subsecuentes para incrementar su simpleza y su eficiencia en la detección del CTV. Lo anterior ha incluido el desarrollo de anticuerpos anti-CTV fusionados con la enzima fosfatasa alcalina mediante el sistema de expresión en Escherichia coli (Terrada et al., 2000), así como la pre-incubación de anticuerpos anti-CTV y anticuerpos secundarios conjugados antes de su aplicación a las membranas (Agdia, 2008; Lin et al., 2006). En el presente trabajo se intentó utilizar el sistema de amplificación biotina/estreptavidina para potenciar la efectividad de los anticuerpos y así incrementar la sensibilidad de la técnica. Sin embargo, la conjugación de los anticuerpos anti-CTV con estreptavidina no arrojó los resultados de reacción ni amplificación esperados.

Una posible explicación de la falla de reactividad y/o amplificación en los conjugados a base de estreptavidina pudo haberse debido a la naturaleza propia de los reactivos entre-cruzantes empleados y/o el acoplamiento de éstos a los aminoácidos presentes en las regiones Fab de las inmunoglobulinas, limitando así la unión antígeno/anticuerpo respectiva y por consecuencia disminuyendo la capacidad de detección. Por otra parte, a diferencia de la biotina que posee un peso de 224.31 daltons, la estreptavidina tiene un peso aproximado de 67,000 daltons, lo cual puede también reducir de manera significativa la actividad biológica de las inmunoglobulinas cunado están acopladas a estreptavidina (Scopes, 1985).

La ventaja que ofrece la técnica de inmunoimpresión para la detección del CTV, radica particularmente en su simpleza y tiempo relativamente corto para su ejecución, por no requerir el proceso de preparación o extracción de la muestra (Garnsey et al., 1993). En términos generales, una vez que las muestras han sido impresas en las membranas de nitrocelulosa, la prueba completa puede ser terminada en un par de horas (Garnsey et al., 1993; Cambra et al., 2000b). La técnica de inmunoimpresión ha llegado a ser una herramienta indispensable para el análisis masivo de muestras de cítricos en la detección del CTV en plantaciones comerciales, así como en viveros en apoyo a los programas de saneamiento y certificación de diversos países, como Argentina (Stein et al., 2009), Chile (Besoain et al., 2003), Colombia (Caicedo y Muñoz, 2006), Cuba (Batista et al., 2005) y España (Cambra, et al., 2000a, 2000b), entre otros (Anfoka et al., 2005; Djelouah y D'Onghia, 2009; Korkmaz, 2002). En la República Mexicana se ha utilizado para la detección del CTV a nivel nacional en todos los estados citrícolas del país (SAGARPA, 2006). Asimismo, se ha empleado en diversos estudios de distribución y epifitiología del CTV a nivel de hueras comerciales en varios estados de la República, particularmente en Puebla, Veracruz (Loredo y Peña del Río, 2002), Tamaulipas y Yucatán (Rivas et al., 2010; Ruiz et al., 2005, 2009).

No obstante la versatilidad de la técnica de inmunoimpresión para la detección del CTV y su uso generalizado en México (Loredo y Peña del Río, 2002; Rivas et al., 2010; Ruiz et al., 2005, 2009; SAGARPA, 2006) , para su aplicación se requiere de la adquisición de los kits comerciales, ya sea de España (Plant Print) o Estados Unidos (Agdia), lo cual implica los altos costos inherentes de importación, así como la dependencia de la campaña del CTV a nivel nacional de kits procedentes del extranjero. En adición a lo anterior, la disponibilidad de los kits comerciales para la detección del CTV en México no siempre es inmediata (Iracheta et al., 2005).

La aportación del presente trabajo radica primordialmente en demostrar que los anticuerpos anti-CTV desarrollados en nuestro laboratorio a través del sistema de proteína recombinante (Iracheta et al., 2008), ofrecen una opción viable de inmunoimpresión para la discriminación de plantas sanas e infectadas por el CTV y con resultados comparables con los obtenidos con los kits comerciales de inmunoimpresión disponibles en México. No obstante el número reducido de muestras a que se tuvo acceso con infección natural al CTV en el campo, los anticuerpos anti-CTV ya sea sin marca o conjugado con biotina vía hidrazida, mostraron en forma consistente una eficiencia del 100% en la discriminación entre plantas sanas y plantas infectadas por el CTV, mostrando así niveles de sensibilidad y especificidad del 100%, respectivamente. La efectividad de los anticuerpos anti-CTV desarrollados contra la proteína recombinante p25 para el análisis masivo de muestras de cítricos ya ha sido documentada con anterioridad empleando la técnica DASI-ELISA (Iracheta et al., 2009).

CONCLUSIONES

Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, se llegó a las siguientes conclusiones:

Los anticuerpos anti-CTV desarrollados contra la proteína recombinante p25 de la cápside del CTV fueron eficientes para la discriminación de muestras sanas de infectadas por el CTV en ensayos de inmunoimpresión.

Los anticuerpos anti-CTV marcados con biotina vía hidrazida fueron eficientes para la discriminación de muestras sanas de infectadas por el CTV, comparables con los anticuerpos anti-CTV sin marcar en ensayos de inmunoimpresión.

Los anticuerpos anti-CTV desarrollados contra la proteína recombinante p25 de la cápside del CTV sin marcar y marcados con biotina vía hidrazida fueron igualmente eficientes en la discriminación de muestras sanas de infectadas por el CTV en ensayos de inmunoimpresión y comparables con los kits comerciales de Agdia y Plant Print.

El marcaje de anticuerpos anti-CTV con estreptavidina, no fue una alternativa eficiente para la detección de CTV en ensayos de inmunopimpresión.

AGRADECIMIENTOS

La presente investigación tuvo financiamiento del CONACYT-México, Clave 067702 y PAICYT-UANL CN-158-07. Los autores agradecen al Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Nuevo León, con sede en Montemorelos, N.L., por permitir el acceso y toma de muestras en plantas infectadas por el CTV en proceso de erradicación en huertas de General Terán.

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