Actividad Antifúngica del Quitosano Contra Alternaria tenuissima in vitro y en Semilla de Cártamo

Antifungal Activity of Chitosan in vitro Against Alternaria tenuissima and Safflower Seeds

Eber Addí Quintana Obregón¹, Jaime López Cervantes¹, Luis Alberto Cira Chávez¹, Dalia Sánchez Machado¹, Maribel Plascencia Jatomea² y Mario Onofre Cortez Rocha²

¹ Departamento de Biotecnología y Ciencias Alimentarias, Instituto Tecnológico de Sonora, Calle Antonio Caso s/n, Col. Villa ITSON, Cd. Obregón, Son., CP 85130, México.

Recibido: Enero 03, 2011
Aceptado: Marzo 09, 2011

Resumen

Se evaluó el efecto de 3.4 g L^-1 de quitosano (46.31 kDa) sobre Alternaria tenuissima aislada de semillas de cártamo variedad S-518. El porcentaje de incidencia de semillas infectadas por Alternaria sembradas en PDA fue de 19.5%. El quitosano incorporado en PDA, inhibió la germinación de esporas en 90.2% a las 24 h con respecto al control ácido y el crecimiento radial de la colonia a las 216 h fue disminuido. La incidencia de A. tenuissima en semillas tratadas con quitosano por 30 min y cultivadas en PDA no mostró diferencia significativa (P<0.05) con respecto a los controles. El quitosano no disminuyó el porcentaje de germinación de semillas de cártamo con respecto al control.

Palabras clave: Carthamus tinctorius, Alternaria tenuissima, germinación de semilla.

Abstract

Key words: Carthamus tinctorius, Alternaria tenuissima, seed germination.

La presencia del género Alternaria en cártamo es de ocurrencia natural; algunas especies utilizan semillas infectadas como medio de propagación, como es A. carthami la especie patógena de mayor importancia (Mortensen et al., 1983). Este género se ha aislado en siembras comerciales de cártamo (Carthamus tinctorius) cultivado en el Valle del Yaqui, en Sonora; además, estudios recientes han demostrado la presencia de Ramularia acroptili y A. tenuissima (datos no publicados) en lesiones de hojas de cártamo infectadas con la falsa cenicilla. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antifúngica del quitosano sobre el crecimiento de Alternaria tenuissima in vitro y en semilla de cártamo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Todos los ensayos se realizaron a 25°C y fotoperiodos de 12 h. El pH se ajustó con NaOH 1 N. Se realizaron por triplicado, se obtuvieron promedios y desviación estándar. Se hicieron análisis de varianza (ANOVA) con el programa estadístico JMP versión 5.0 (SAS Institute Inc., USA) y nivel de significancia P<0.05.

Aislamiento. Se desinfectaron con NaOCl al 0.5% (v/v) por 2 min 200 semillas de cártamo (S-518) de cultivos del 2008 en el Valle del Yaqui, Sonora, México, se eliminó o decantó éste, se lavaron durante 3 min y secaron por 30 min en campana de flujo laminar. Las semillas se distribuyeron al azar en placas de Petri (10 semillas por placa) de 90 mm de diámetro con PDA y se incubaron a 25°C. Se identificaron las colonias desarrolladas sobre las semillas a las 96 h y se obtuvieron aislados de las colonias de mayor incidencia mediante resiembras en PDA hasta obtener colonias con características morfológicas idénticas; posteriormente se identificó el aislado con base a la descripción de Robert et al. (2005). La especie fue confirmada mediante alineamiento genómico de acuerdo a la base de datos del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) a partir de un cultivo de 72 h en caldo papa dextrosa. El alineamiento fue realizado en el Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional (Reynosa, Tam., México).

Germinación de esporas y crecimiento radial. Se trabajó con esporas suspendidas en solución Tween 20 (0.1% v/v) de cultivos de siete días. Se tomaron alícuotas de 25 μL de suspensión con 10⁴ esporas para todos los ensayos. Se preparó solución de quitosano (Aldrich lote: 04924LH, 46.31 kDa) en ácido acético 0.05M, se esterilizó y dejó enfriar a 45°C. La solución se mezcló con PDA y se depositaron 10 mL de mezcla en placas de Petri de 60 mm de diámetro. La concentración final de quitosano fue de 3.4 g L^-1. Como controles se utilizó PDA (control H₂O) y PDA con ácido acético 0.05 M (control ácido). El pH final de los tratamientos fue de 5.6±0.2. Para germinación de esporas, se distribuyeron 10⁴ esporas sobre la superficie del medio de cultivo y se incubaron. Se tomaron muestras aleatorias cada 24 h hasta llegar al 90-100% de esporas germinadas en controles. Se determinó el porcentaje inhibición de germinación de esporas con respecto al control ácido con la técnica descrita por Plascencia-Jatomea et al. (2003). En la técnica de crecimiento radial se hizo un pozo de 6 mm de diámetro en el centro de la placa de Petri con medio de cultivo y se inoculó con 10⁴ esporas. Se incubó y midió manualmente el radio de la colonia a intervalos de tiempo (12 y 24 h) hasta que la colonia en los medios controles cubrió el 80-90% de la superficie de la placa.

Protección de semillas. Se preparó una solución con 3.4 g L^-1de quitosano-ácido acético (0.05M) y controles (agua destilada y solución de ácido acético 0.05M). Se ajustó el pH a 5.6±0.2, se agitaron por 30 min y se llevó a autoclave. Doscientas semillas seleccionadas al azar se sumergieron en la solución de quitosano por 3 min y se secaron a temperatura ambiente en campana de flujo laminar por 30 min. Las semillas fueron sembradas en placas de Petri con PDA (10 semillas por placa) y a las 96 h se determinó el porcentaje de incidencia de semillas infectadas por Alternaria. También se evaluó un tiempo de remojo de semillas de 30 min. Además, se calculó el porcentaje de germinación de semillas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El aislado de semillas fue identificado y confirmado por alineamiento genómico con la especie A. tenuissima (NCBI; gb|FJ755240.1|, gb|FJ755196.1| y gb|FJ755194.1|). El porcentaje de germinación de esporas a las 24 h fue de 99±1.32, 60±1.7 y 5.83±1.2% para control H₂O, control ácido y quitosano, respectivamente (Figura 1), mostrando diferencia significativa entre tratamientos (P<0.05). El porcentaje de inhibición de germinación de esporas en PDA-quitosano con respecto al control ácido fue de 90.2±2.1% a las 24 h. En crecimiento radial (Figura 2), se encontraron diferencias significativas (P<0.05) entre los tratamientos a las 216 h, siendo el radio de la colonia 34±0.21, 26±0.63 y 2.81±0.61 mm para control H₂O, control ácido y quitosano, respectivamente. El porcentaje de incidencia de semillas infectadas por Alternaria en control H₂0 fue de 19.5±3% y no se encontró diferencia (P<0.05) entre controles y quitosano. Tampoco hubo diferencia significativa entre los tiempos de remojo de semillas. Con respecto a la germinación de semillas, el tratamiento de remojo con quitosano no afectó significativamente (P<0.05), con porcentaje de germinación de semillas de 89.83±5.3 % en control H₂O.

CONCLUSIONES

El quitosano inhibió la germinación de esporas y el crecimiento radial in vitro de A. tenuissima y no afectó el porcentaje de germinación de semillas. Por otra parte, es posible utilizar el quitosano para el control del hongo en cultivos donde esta especie sea de importancia fitopatógena.

LITERATURA CITADA

Plascencia-Jatomea M, Viniegra G, Olayo R, Castillo-Ortega MM and Shirai K. 2003. Effect of chitosan and temperature on spore germination of Aspergillus niger. Macromolecules Bioscience 3:582-586.         [ Links ]

Mortensen K, Bergman JW and Burns EE.1983. Importance of Alternaria carthami and A. alternata in causing leaf spot diseases of safflower. Plant Disease 67:1187-1190        [ Links ]

Robert V, Stegehuis G and Stalpers J. 2005. The MycoBank engine and related databases. http://www.mycobank.org (consulta, enero 2011).         [ Links ]