Actividad Inhibitoria del Extracto de Heliopsis longipes Sobre Fusarium oxysporum f. sp lycopersici

Inhibitory Activity of Heliopsis longipes Extract on Fusarium oxysporum f. sp lycopersici

Susana González Morales¹, María Liliana Flores López², Adalberto Benavides Mendoza³ y Alberto Flores Olivas⁴

¹ Departamento de Parasitología Agrícola (DPA), Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), Buenavista, Saltillo, Coah., CP 25315, México.

³ Departamento de Horticultura, UAAAN.

⁴ DPA, UAAAN. Correspondencia: aflooli@uaaan.mx

Recibido: Abril 20, 2011
Aceptado: Julio 04, 2011

Resumen

Se obtuvieron 17 aislados de Fusarium sp. de raíces de tomate con síntomas de marchitez. Nueve aislados fueron identificados como Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Se determinó la patogenicidad de los aislados, uno de ellos nombrado como FOL 10 ocasionó los síntomas más severos. Dicho aislado se seleccionó para evaluar in vitro la dosis mínima inhibitoria del extracto etanólico de Heliopsis longipes. Se determinó la concentración de afinina como componente principal del extracto. La dosis letal media estimada fue de 164.2 μg mL^-1 de afinina, y la dosis letal 90 fue de 348.6 μg mL^-1 de afinina.

Palabras clave: Afinina, dosis letal media, tomate.

Abstract

A total of 17 Fusarium sp. isolates were obtained from tomato roots with wilt symptoms. Nine isolates were identified as Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici; isolates pathogenicity was determined. More severe symptoms were caused by one of the isolates named FOL 10. Such isolate was selected to have the Heliopsis longipes ethanol extract minimum inhibitory dose evaluated in vitro. The affinin concentration was determined as the extract main component. The estimated median lethal dose was 164.2 μg mL^-1 of affinin, and the lethal dose 90 was 348.6 μg mL^-1 of affinin.

Key words: Affinin, median lethal dose, tomato.

Fusarium oxysporum f. sp lycopersici (FOL) es el hongo fitopatógeno distribuido en todo el mundo que causa grandes pérdidas en el cultivo de tomate. El hongo sobrevive en restos de cultivo de un ciclo a otro y posee estructuras de resistencia que le permiten perdurar en el suelo por espacio de seis años. Afecta al sistema vascular ocasionando marchitez en plantas de tomate (Ward, 1986). Existen tres razas del hongo numeradas del uno al tres, esto obedece al orden cronológico en que fueron descubiertas y en su propiedad de infectar diferentes hospederos. El manejo de la enfermedad que causa FOL es difícil, y actualmente la alternativa que se ofrece es la siembra de variedades resistentes (Janssen, 2002).

Una alternativa amigable con el medio ambiente para el control de esta enfermedad, es el uso de extractos de plantas. Algunos géneros de la familia Heliantheae producen diferentes tipos de alcamidas. Estos compuestos son amidas o esteres hidrofóbicos que contienen ácidos grasos insaturados como parte de su estructura química (Johns et al., 1982). Se ha demostrado que las alcamidas tienen acción biocida, especialmente en algunos insectos, incluso sobre el parásito de humanos denominado Schistosoma mansoni (Frischkorm et al., 1978).

H. longipes es miembro de la familia Heliantheae, presenta diferentes compuestos tóxicos como la afinina, que pertenece al grupo de las alcamidas (Molina et al., 1995). La afinina es la alcamida mayoritaria en las raíces de esta planta y principal responsable de los efectos biológicos específicos observados, entre los que se pueden considerar la acción de anestésico local, el estímulo organoléptico, así como la actividad insecticida y bactericida; este compuesto tiene acción biocida sobre algunas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como en algunos hongos de la clase Ascomicetes (Ramírez et al., 2000; Molina et al., 1996). El objetivo del presente estudio fue evaluar in vitro el efecto inhibitorio del extracto crudo etanólico de H. longipes sobre un aislado de F. oxysporum f. sp. lycopersici obtenido e identificado de raíces de plantas de tomate con síntomas de marchitez.

MATERIALES Y METODOS

Identificación de F. oxysporum f. sp lycopersici. Los aislados con características morfológicas macroscópicas semejantes al género Fusarium, fueron seleccionados para su identificación a nivel de género, en base a sus características morfológicas como: macroconidias en forma de canoa, micelio, clamidiosporas y esporodoquios correspondientes a Fusarium sp. de acuerdo con las claves de Nelson et al. (1983). Los aislados seleccionados con características del género Fusarium, se sembraron inicialmente en PDA, cuando estuvo la caja totalmente invadida por el crecimiento, se agregaron 10 mL del líquido crioconservador (glicerol al 10% - leche descremada al 5%) y se raspó el micelio hasta que se desprendiera y se mezclara con el líquido. Posteriormente, se colocó esta mezcla en tubos Eppendorf de 1.5 mL estériles, y se almacenaron a -72°C (Henao et al., 2006).

Para llevar a cabo la identificación de F. oxysporum f. sp. lycopersici, se realizó la extracción de ADN de las cepas de Fusarium, mediante la técnica de Lee et al. (2000). Para la identificación de FOL por medio de PCR, se utilizaron los primers CNL12 (5'-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3') y CNS 1 (5'-GAGACAAGCATATGACTACTG-3') que codifican para un fragmento de la región intergénica ribosomal (IGS) ubicada entre la subunidad pequeña y la subunidad grande. La temperatura de desnaturalización fue de 94°C por 1 min, seguida de la temperatura de anillamiento de 54°C por 1 min y la temperatura de extensión a 72°C por 2 min (Hyun et al., 2001). Los productos de PCR obtenidos (2.6 kb) fueron visualizados en un gel de agarosa al 2%.

Evaluación de patogenicidad. Esta prueba se utilizó para comprobar la reproducibilidad de la enfermedad inoculando las cepas aisladas en plantas de tomate, aplicando los postulados de Koch. Se utilizaron semillas de tomate (Solanum lycopersicum) tipo Saladett cv., 'Río Grande'. Las semillas se desinfectaron y se sembraron en charolas con una mezcla de turba: perlita a una proporción de 1:1. Las charolas se regaron cada tres días. Cuando las plantas tenían una edad de cinco semanas o cinco a seis hojas verdaderas, fueron inoculadas colocando cuatro cilindros de PDA de 6 mm de diámetro conteniendo a FOL cerca de las raíces, las que fueron cortadas en las puntas con tijeras estériles (Benhamou y Belanger, 1998). Se inocularon cuatro repeticiones (plantas) por cada aislado.

Se midió incidencia y severidad utilizando la escala de Diener (Diener y Ausubel, 2005). La cual indica las categorías siguientes: 0, planta muerta; 1, las hojas viejas muertas, las jóvenes crecimiento detenido; 2, las hojas viejas cloróticas, hojas jóvenes con crecimiento detenido; 3, hojas viejas tienen clorosis vascular, hojas jóvenes con crecimiento detenido; 4, los peciolos de las hojas con crecimiento detenido; 5, no hay síntomas visibles. El experimento tuvo un diseño completamente al azar, los resultados se analizaron estadísticamente en Minitab mediante la prueba de Kruskal-Wallis mostrando diferencia significativa entre tratamientos (p=0.0002).

Actividad inhibitoria del extracto de H. longipes. El extracto de H. longipes se elaboró con las raíces secas y molidas de esta planta colectadas en la Sierra Gorda de Guanajuato. Para obtenerlo, se usó una proporción de 1:10, esto es 1 g de raíz macerada por cada 9 mL de solvente, el cual fue etanol al 98%. El extracto se obtuvo al exponer el tejido macerado al solvente a temperatura ambiente durante 30 días. El extracto crudo se filtro con un papel filtro Whatman No. 1 y se concentró en rotavapor (IKA). La determinación de la concentración de afinina se llevó a cabo por medio de cromatografía de líquidos de alta resolución HPLC, donde la afinina se purificó a partir del extracto crudo mediante cromatografía en capa fina (TLC), sobre capas de vidrio 20x20 cm cubiertas con una capa de gel de sílice de aproximadamente 0.5 mm de espesor. La muestra de extracto en las placas se corrió con el sistema de solventes constituidos por una mezcla de hexano: acetato de etilo (2:1 v/v), posteriormente se secaron a temperatura ambiente y se asperjaron con una solución de fluoresceína al 0.02% y se observó bajo luz ultravioleta. La retención relativa de la afinina es de 0.5, dicha banda se colectó y se eluyó con acetato de etilo, el cual posteriormente se evaporó. La fracción se resuspendió en etanol y se analizó en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución, en una columna C18, como fase móvil se utilizó acetonitrilo: agua en un gradiente de 40 a 70%, con un tiempo de corrida de 40 min a un flujo de 1 mL min^-1. El tiempo de retención fue de 23 min correspondiente a la afinina (Ramírez et al., 2000). El extracto fue almacenado en oscuridad a 4°C.

Para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) in vitro se utilizaron cinco concentraciones del extracto con base a la cantidad de afinina (75, 150, 300, 600 y 1200 μg mL^-1), cada concentración se agregó a medio PDA, se colocó un cilindro de PDA de 6 mm de diámetro conteniendo a FOL y se incubó a 28°C. El diámetro del micelio se midió cada 24 h, hasta que el control alcanzó el límite del borde de la caja Petri. Se realizaron 10 repeticiones de cada concentración con un diseño completamente al azar. Se determinó la CMI con el programa PROBIT SAS 9.1 y se realizó un ANOVA y prueba de medias en GraphPad 3.0.

RESULTADOS

Identificación de F. oxysporum f. sp. lycopersici. Como resultado del aislamiento de Fusarium según su morfología macro y microscópica se obtuvieron 17 aislados. Nueve de ellos (0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 y 17) fueron identificados como F. oxysporum f. sp. lycopersici por medio de amplificación por PCR, usando los primers CNL12 y CNS1 (Figura 1). El fragmento amplificado por PCR fue de 2.6 kb, este fragmento corresponde a F. oxysporum f. sp. lycopersici acorde con lo reportado por Hyun et al. (2001). Aunque Alves et al. (1999) reporta que existen dos IGS en aislados de F. oxysporum, la IGS pequeña (2.55 kb) y la grande (2.6 kb).

Efecto inhibitorio. Para la prueba in vitro de inhibición del extracto de H. longipes sobre F. oxysporum f. sp. lycopersici, se seleccionó el aislado 10 (el cual se denominó FOL10), ya que fue positiva en la identificación por PCR, y fue la cepa que presentó la sintomatología más severa en la prueba de patogenicidad, el valor de severidad fue de 0 (planta muerta).

El extracto de H. longipes se concentró un 95% y la cantidad de afinina fue de 5.5 mg mL^-1. El aislado identificado FOL10, que fue el que mostró mayor severidad en el daño, se usó para determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto de H. longipes sobre F. oxysporum f. sp. lycopersici. En la Figura 2 se muestran los porcentajes de inhibición de las diferentes concentraciones de afinina en extracto de H. longipes sobre FOL. Las dosis de 600 y 1200 μg mL^-1 de afinina presentaron una inhibición del 100%. La dosis letal media (DL₅₀) fue de 164.2 con límites fiduciales de 133.9-199.9 μg mL^-1 (corresponde al 95% de confiabilidad), y la dosis letal 90 (DL₉₀) fue de 348.6 (límites fiduciales de 273.3-524.2) μgmL^-1.

La concentración de 600 μg mL^-1, presentó un 100% de inhibición al final de la prueba, cuando el testigo absoluto invadió toda la caja Petri. Después de 32 días, a la misma temperatura de incubación, se presentó crecimiento de FOL10, por lo que el porcentaje de inhibición disminuyó a 89%. Los resultados obtenidos nos muestran que el extracto de H. longipes se comporta como agente fungistático.

Los resultados de la prueba del efecto inhibitorio con respecto a la cinética de crecimiento radial de FOL10, muestran que la producción del micelio en presencia de las diferentes concentraciones del extracto de H. longipes es menor que el producido en el testigo absoluto (Figura 3).

Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células en un intervalo corto de tiempo. El incremento del número de células por unidad de tiempo es proporcional al número de células presentes en el cultivo. A la constante de proporcionalidad (μ) se le denomina tasa específica de crecimiento (TEC), que se define como la velocidad específica de crecimiento microbiano, dado por el inverso del tiempo. En el Cuadro 2, se muestran las ecuaciones lineales de cada tratamiento obtenidas de la cinética de crecimiento, y la TEC de FOL10; para las concentraciones de 600 y 1200 μg mL^-1 de afinina (0 día^-1) hay una disminución del 100% con respecto al testigo absoluto (0.6775 día^-1), y en la de concentración de 300 μg mL^-1 de afinina (0.165 día^-1) hay una disminución del 24.3% con respecto al testigo absoluto (0.6775 día^-1).

DISCUSIÓN

Actualmente se ha estudiado el efecto fungistático de la afinina sobre algunos microorganismos, en el presente trabajo obtuvimos una inhibición del 90% sobre el crecimiento de la cepa de F. oxysporum f. sp. lycopersici con una dosis de 348 μg mL^-1 de afinina. Respecto a otros microorganismos, Ramírez et al. en el 2000 reportan que se requieren 25 μg mL^-1 de afinina para inhibición del 90% sobre el crecimiento de Sclerotium rolfsii y 28 μg mL¹ para Sclerotium cepivorum; para Fusarium sp. una inhibición del 38% del crecimiento con 150 μg mL^-1 de afinina. Para Rizoctonia solani AG-3 un 100% de inhibición con 150 μg mL^-1 de afinina y Verticillum sp. 45% de inhibición a la misma concentración (Molina et al., 2004). Esto nos indica que la acción fungistática de la afinina, varía de manera considerable según el microorganismo que se evalúe.

La TEC de F. oxysporum f. sp. lycopersici 10 con las concentraciones 600 y 1200 μg mL^-1 de afinina mostró una disminución del 100% con respecto al testigo absoluto, en comparación con Quintana et al. (2010) quienes reportan que el extracto metanólico de Daturia stramonium causó un efecto moderado en la producción de biomasa del hongo, encontrando valores estadísticamente similares (p<0.05) con respecto al control. La TEC de crecimiento del hongo fue de 0.040 para el control metanólico y 0.037 mg h^-1 por cm² para el extracto metanólico de D. stramonium, mostrando una disminución del 7.5%.

Se considera además que la tasa específica de crecimiento depende únicamente de la concentración de sustrato y presenta inhibición con altas concentraciones del mismo, tal como sucede con muchas sustancias tóxicas a nivel de pared celular, de membrana celular, de sistema de transporte, de replicación de ácidos nucléicos, de síntesis de proteínas, entre otros procesos importantes en el ciclo celular (Vargas et al., 2002).

El mecanismo de acción de la afinina como fungicida o fungistático todavía se desconoce. Pudiera ser por la inhibición de la actividad de la enzima hidroxidecanoildeshidratasa (HDDasa), esta enzima inicia la ruta de desaturación de ácidos grasos (ácido palmítico, esteárico, oleico y linoleico) y es inhibida específicamente por el 3-decinoil-N-acetil cisteamina (Ramírez et al., 2000).

Aunque el compuesto mayoritario del extracto de H. longipes es la afinina, es posible que participen otros compuestos bioactivos presentes en el extracto crudo. Sobre ello, Ramírez et al. (2000) reportaron diferencias entre la afinina purificada y el extracto crudo, en cuanto a su capacidad de reducir la acumulación de los ácidos grasos (palmítico, esteárico, oleico y linoleico) en el micelio de S. rolfsii. De igual manera, el efecto inhibitorio se puede deber a la presencia de metabolitos secundarios, como los alcaloides y fenoles, producidos por las plantas como defensa ante el ataque microbiano, en este caso los hongos, por lo que han sido nombrados por algunos autores como compuestos antifúngicos (Hernández et al., 2007; Montes et al., 2000). Una de las ventajas de obtener sustancias tales como la afinina, producidas por biosíntesis de plantas, es que no tienen efectos secundarios conocidos en el ecosistema, dado que pueden ser metabolizados por uno u otro organismo, a diferencia de los fungicidas químicos comúnmente aplicados hasta ahora.

CONCLUSIONES

Se lograron obtener nueve asilamientos de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, los cuales mostraron una gran variación en virulencia. Se demostró el efecto inhibitorio del extracto crudo de H. longipes sobre FOL10, mostrando que a concentraciones de 600 y 1200 μg mL^-1 de afinina se presentó una inhibición del 100% y un valor de TEC para estas concentraciones de 0 días^-1. Esto nos indica el potencial de inhibición que tiene el extracto de H. longipes sobre F. oxysporum f. sp. lycopersici que es un patógeno importante del cultivo tomate.

LITERATURA CITADA

Alves SM, Eslava AP and Diazminguez JM. 1999. Genetic diversity of Fusarium oxysporum strains from common bean fields in Spain. Applied and Environmental Microbiology 65:3335-3340.         [ Links ]

Benhamou Ν and Belanger R. 1998. Benzothiadiazole-mediated induced resistance to Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici in tomato. Plant Physiology 118:1203-1212.         [ Links ]

Diener AC and Ausubel FM. 2005. Resistance to Fusarium oxysporum 1, a dominant Arabidopsis disease-resistance gene, isnotrace specific. Genetics 171:305-321.         [ Links ]

Frischkorm CG, Frischkorm HE and Carrazzoni E. 1978. Cercaricidal activity of some essential oils of plants from Brazil. Naturwissensehaften 65:480-483.         [ Links ]

Henao I, Franco CM y Marin G. 2006. Evaluación de métodos de conservación para Aspergillus niger con actividad enzimática amilolítica. Universitas Scientiarum 11:51-60.         [ Links ]

Hernández AR, Barrera NL, Bautista BS and Bravo LL. 2007. Antifungal potential of crude plant extracts on conidial germination of two isolates of Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Penz. Y Sacc. Revista Mexicana de Fitopatología 25:180-185.         [ Links ]

Hyun J K, Yong K C, and Byung R M. 2001. Variation of the intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA among Fusarium oxysporum formae specials. Journal of Microbiology 39:265-272        [ Links ]

Janssen D. 2002. Tomatoes: Possible Causes of Sudden Wilt and Deathfile. University of Nebraska. http://lancaster.unl.edu/hort/Articles/2002/TomatoWilt.htm (consulta, febrero 2011).         [ Links ]

Johns T, Graham K and Towers GHN. 1982. Mulluscicidal activity of affinin and other isobutylamides from the Asteraceae. Phytochemistry 21:2737-2738.         [ Links ]

Lee YM, Choi YK and Min BR. 2000. PCR-RFLP and sequence analysis of the rDNA ITS region in the Fusarium spp. Journal of Microbiology 38:66-73.         [ Links ]

Molina TG, Salgado GR and Ramírez CE. 1995. Presence of the bornyl ester of deca-2E-6Z-8E-trienoic acid in Heliopsis longipes. Journal of Natural Products 58:1590-1591.         [ Links ]

Molina TG, Salgado GR, Ramírez CE and Del Río REN. 1996. Purely olefinic alkamides in Heliopsis longipes and Acmella (Spilanthes) oppositifolia. Biochemical Systematic Ecology 24:43-47.         [ Links ]

Molina TJ, Salazar CCJ, Armenta SC and Ramírez CE. 2004. Fungistatic and bacteriostatic activities of alkamides from Heliopsis longipes Roots: Affinin and reduced amides. Journal of Agricultural Food Chemistry 52:4700-4704.         [ Links ]

Montes BR, Cruz CV, Martínez MG, Sandoval GG, García LR, Zilch DS, Bravo LL, Bermudez TK, Flores MH y Carvajal MM. 2000. Propiedades antifúngicas en plantas superiores. Análisis retrospectivo en investigaciones. Revista Mexicana de Fitopatología 18:125-131.         [ Links ]

Montiel GL, González FF, Sánchez GBM, Guzmán RS, Gamez VFP, Acosta GJA, Rodríguez GR, Simpson WJ, Cabral EM y Mendoza EM. 2005. Especies de Fusarium presentes en raices de frijol (Phaseolus vulgaris L.) con daños de pudrición, en cinco estados del centro de México. Revista Mexicana de Fitopatología 23:1-7.         [ Links ]

Nelson PE, Toussoun TA and Marasas WFO. 1983 Fusarium Species. An Illustrated Manual for Identification. The Pennsylvania State University Press. 193p.         [ Links ]

Quintana OEA, Plascencia JM, Burgos HA, Guerrero RJ, Parra VNV y Cortez RMO. 2010. Extracto metanólico de Datura stramonium para el control in vitro e in vivo de Ramularia cercosporelloides, agente causal de la falsa cenicilla del cártamo (Carthamus tinctorius). Revista Mexicana de Micología 31:19-27.         [ Links ]

Ramírez CE, Lucas VL, Virgen CG y Molina TJ. 2000. Actividad fungicida de la afinina y del extracto crudo de raíces de Heliopsis longipes en dos especies de Sclerotium. Agrociencia. 34:207-215.         [ Links ]

Vargas A, Moreno J y Buiton G. 2002. Estrategia de control de tiempo óptimo para un Sbr usando aprendizaje iteractivo. Coordinaciones de Automatización y Bioprocesos Instituto de Ingeniería, UNAM. www.bvsde.paho.org/bvsaidis/aresidua/peru/mextar060.pdf (consulta, febrero 2011).         [ Links ]

Ward EWB. 1986. Biochemical mechanisms involved in resistance of plants to fungi. Biology and Molecular Biology of Plant Pathogen Interactions. Springer-Verlang. Berlin-Herdelberg Pp:107-131.         [ Links ]