Manejo de Erwinia amylovora con Aceite Esencial de Orégano (Lippia berlandieri) y Estudio de Resistencia a Estreptomicina en Arboles de Manzano cv. 'Golden Delicious'

Management of Erwinia amylovora with Oregano (Lippia berlandieri) Essential Oil and Resistance Study to Streptomycin on Apple Trees cv. 'Golden Delicious'

Alejandro Romo Chacón¹, David I. Berlanga Reyes¹, Víctor M. Guerrero Prieto¹, Roberto Martínez Campos¹, Sergio Romero Gómez² y Manuel Rafael Ramírez Legarreta³

¹ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C., Unidad Cuauhtémoc, Av. Río Conchos s/n, Parque Industrial, Cuauhtémoc, Chihuahua, CP 31570, México. Correspondencia: archacon13@ciad.mx

³ INIFAP, Campo Experimental Sierra de Chihuahua, Hidalgo 1213, Zona Centro, Cuauhtémoc, Chihuahua, CP 31500, México.

Recibido: Mayo 06, 2011
Aceptado: Agosto 08, 2011

Resumen

El tizón de fuego causado por Erwinia amylovora (Ea), es una de las enfermedades más severas del manzano, debido a que origina la muerte de yemas florales y en ocasiones del árbol completo. Un método para su manejo es el uso de antibióticos. Sin embargo, el uso inapropiado de éstos puede inducir resistencia en las bacterias. En este trabajo se evaluó el aceite esencial de orégano (Lippia berlandieri) (carvacrol 80%) durante los años 2005 y 2006, como una alternativa orgánica para el manejo de Ea. La concentración mínima bactericida (CMB) encontrada in vitro fue de 0.055 a 0.073% (p/v). Se evaluó una concentración de 0.11% (p/v) en campo y se determinó su efecto en la reducción del daño ocasionado por Ea; estos resultados se compararon con los obtenidos con Agry-Mycin 100^MR, Cuprimicin 100^MR y Agry-Gent Plus 800^MR. Durante ambos años, los tratamientos no presentaron diferencias significativas con respecto al testigo. El momento de la aplicación se basó en la detección de poblaciones epifíticas mediante la impresión de estigmas en medio semi-selectivo, temperatura y humedad con valores de 5%, 16.7°C y 78%, respectivamente para 2005. Por otra parte en el ciclo 2006 estos mismos parámetros fueron de 96%, 15.2°C y 70%, respectivamente. La identificación y resistencia de Ea óutilizando medios semi-selectivos, los resultados fueron confirmados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se detectó y aisló una cepa de Ea resistente a estreptomicina. Éste es el primer reporte mediante técnicas moleculares de una cepa de Ea resistente a estreptomicina en la zona manzanera de Chihuahua, México.

Palabras clave: Tizón de fuego, población epifítica, antibióticos, resistencia, PCR.

Fire blight, one of the most severe diseases on apples is caused by Erwinia amylovora (Ea), it provokes the death of flower buds and sometimes the whole tree. Antibiotic use is one of the methods employed to manage Ea, however, inappropriate use can lead to bacteria resistance. During 2005 and 2006, oregano (Lippia berlandieri) essential oil (80% carvacrol) was evaluated as an organic alternative to manage Ea. In vitro bactericidal minimum concentration (BMC) was 0.055 to 0.073% (w/v). A concentration of 0.11% was assessed in field and its effect on reducing the damage caused by Ea was determined. Results were compared against Agry-Mycin 100 ^MR, Cuprimicin 100 ^MR and Agry-Gent Plus 800^MR. Eaepiphytic populations grown in semi-selective media, temperature and humidity, with values of 5%, 16.7°C and 78% respectively for 2005, and 96%, 15.2y 70% for 2006. Identification of Ea and its resistance to streptomycin was performed by growing the bacteria in semi-selective media and results were confirmed by PCR. An Ea strain resistant to streptomycin was detected and isolated. This is the first report of an Ea strain resistant to streptomycin and confirmed by molecular techniques in the most important apple area in the state of Chihuahua, Mexico.

Keywords: Fire blight, epiphytic population, antibiotic, resistance, PCR.

En el estado de Chihuahua, principal zona productora de manzana en México (SIAP, 2006), al igual que en otros países del mundo donde se cultivan especies como el manzano (Malus sylvestris var. domestica) el patógeno Erwinia amylovora, agente causal del tizón de fuego, es un grave problema. Los efectos de la enfermedad son devastadores y los árboles infectados pueden llegar a morir (Shtienberg et al., 2003). En la flor, los estigmas son el sitio principal para el desarrollo de altas poblaciones epifíticas; aún en climas secos, donde la infección puede desarrollarse durante períodos ocasionales de alta humedad causados por lluvia o irrigación excesiva. Sin embargo, la incidencia de la enfermedad es significativamente menor que el porcentaje de flores colonizadas (Bubán et al., 2003; Thomson y Gouk, 2003). Actualmente existen diferentes medios semi-selectivos (Miller y Schroth, 1972; Ishimaru y Klos, 1984; Kritzman et al., 2003) y técnicas de biología molecular para la identificación de Ea (Bereswill et al., 1992; Momol et al., 1998; Taylor et al., 2001; Llop et al., 2006), así como diferentes modelos de predicción de la enfermedad (Thomson et al., 1982; Bubán et al., 2004). Los avances en la implementación del biocontrol del tizón de fuego han resultado a partir de varios factores, incluyendo el incremento en importancia de la enfermedad, el desarrollo de resistencia a los antibióticos sintéticos y a la demanda social para impulsar la seguridad y sustentabilidad de los sistemas de producción agrícola (Johnson y Stockwell, 2000). Otras investigaciones han mostrado la posibilidad del uso de compuestos antimicrobianos derivados de plantas, como el carvacrol presente en el aceite esencial de orégano (Lippia berlandieri) en cantidades del 60 al 70% (Ultee et al., 2002). Por tal motivo, es necesario encontrar nuevos compuestos para el manejo de Ea (Tsiantos et al., 2003). Los objetivos en este estudio fueron evaluar al aceite de orégano como una alternativa orgánica contra Ea, comparar su eficiencia en campo con respecto a los antibióticos sintéticos utilizados en la región y determinar la presencia de bacterias resistentes a estreptomicina.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo experimental fue llevado a cabo durante los ciclos 2005 y 2006 en árboles de manzano cultivar 'Golden Delicious' de 28 años de edad, injertados sobre portainjerto franco, con una densidad de plantación de 1000 árboles (5x4 m) y una altura de 6 m en una superficie de 2 ha. Las líneas de plantación están orientadas en una dirección de norte a sur. La localización del huerto es la 'Quinta Lupita' en el municipio de Cuauhtémoc, Chih., ubicado a LN 28° 26' 39" y 106 53' 15" de LO.

Fenología de floración. Se evaluaron tres árboles en los cuales se marcaron cuatro ramas, cada una con un mínimo de 100 racimos florales, evaluando doce repeticiones para determinar el porcentaje de yemas brotadas en el estadio plena floración, las lecturas se realizaron a un intervalo de tres días a partir del 23 de marzo al 18 de abril y del 7 al 28 de abril, para los años 2005 y2006, respectivamente (Guerrero et al., 2006).

Poblaciones epifíticas de Erwinia amylovora (Ea). La determinación de las poblaciones epifíticas de Ea en flores, se realizó durante dos ciclos en el lote experimental mediante la impresión de estigmas en medio de cultivo CCT (Ishimaru y Klos, 1984), con un intervalo de tres días durante seis y ocho fechas en 2005 y 2006, respectivamente. La edad de las flores evaluadas fue entre uno y cuatro días (Thomson y Gouk, 2003), seleccionando preferentemente la flor rey de cada racimo floral para un total de 108 flores por fecha, las flores fueron emasculadas realizando la impresión únicamente con los estigmas (Thomson, 1992). Las cajas con el medio CCT fueron cuadriculadas para realizar nueve impresiones por caja, las cuales se incubaron por 24 h a una temperatura de 29±1°C. Posteriormente se realizaron observaciones con el objetivo 2X de un estereoscopio y se determinó el porcentaje de bacterias correspondientes a Ea, de acuerdo a las características morfológicas de la colonia (Manulis et al.,1998).

Pruebas de sensibilidad a estreptomicina. Para estas pruebas se utilizó el medio semiselectivo Miller y Schroth (1972) y 100 colonias de Ea obtenidas durante la impresión de estigmas, las cuales se suspendieron en agua peptonada (8.5g L^-1 de NaCl y 1g L^-1 de peptona) mediante un vortex, hasta obtener una concentración de 1x10⁷ UFC mL^-1. Posteriormente se inocularon y sembraron por extensión 100 μL de la suspensión en cajas Petri con medio sólido Miller y Schroth, mezclado con estreptomicina a una concentración de 100 μL L^-1 respectivamente. También se hicieron inoculaciones en el medio de cultivo sin antibiótico como testigo positivo. Los resultados fueron evaluados después de 48h de incubación a 29°C. La prueba se realizó por triplicado.

Identificación de Erwinia amylovora por PCR. La identidad de las cepas aisladas en el medio de cultivo CCT se confirmó por medio de PCR. Por medio de esta técnica se detectó y amplificó una secuencia de nucleótidos exclusiva del plásmido pEA29. Este plásmido no es transmisible a otra especie y es común a todas las cepas de Ea encontradas hasta la fecha. Cada reacción de 20μL contenía: buffer de reacción 2 µL MgCl₂ 50mM, dNTPS 10mM; 10 pmol µL^-1 de cada iniciador; 1 μL del DNA de la muestra, y 5 Uµ^-1 de Taq polimerasa. Se usaron los iniciadores pEA29A (CGGTTTTTAACGCTGGG) y pEA29B (GGGCAAATACTCGGATT) (Bereswill et al., 1992). Se emplearon las siguientes condiciones de reacción: desnaturalización a 93°C por 5 min, seguido por 40 ciclos de 93°C por 30 seg, 52°C por 30 seg, y un tiempo de extensión final de 10 min a 72°C. Los productos del PCR fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% y la tinción del DNA se realizó con bromuro de etidio. El tamaño del fragmento amplificado esperado fue de 900 pares de bases (Bereswill et al., 1992); aunque se han reportado variaciones que van de 900 a 1100 pares de bases (Lecomte et al.,1997).

Pruebas de resistencia a estreptomicina por PCR. La resistencia de cepas aisladas como positivas en el medio Miller y Schroth (1972), fue confirmada por medio de la amplificación de genes de resistencia a estreptomicina presentes en el transposón TN5393. Se usaron parejas de iniciadores específicos para los genes de la estreptomicina fosforilasa Stra5 (GGTTGCCTGTCAGAGGCGG) y Stra3 (GTCAGAGGGTCCAATCGC) con una Tm de 58°C y un fragmento de amplificación esperado de 750 pb. La presencia del transposon se detectó por medio de la amplificación de la transposasa usando los iniciadores específicos TN5393-5 (CGGCAAGATGCTCGTGCCGTG) y TN5393-3 (AGTCAGAATGCGATTCACC) con una Tm de 57°C y un fragmento de amplificación esperado de 2298 pb. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización 2 min a 94°C seguida de 30 ciclos de 94°C por 30 seg, 58°C por 30 seg, y 72°C por 2 min y 30 seg, finalmente un tiempo de extensión de 72°C por 15 min. Los productos fueron separados por electroforesis.

Determinación in vitro de la concentración mínima bactericida (CMB). El aceite esencial de orégano (Lippia berlandieri) con un contenido de 80% de carvacrol usado en este trabajo fue proporcionado por Agroindustrial Don Pablo Licón (www.agrodonpablo.com). La actividad antibacterial se determinó usando diluciones del aceite esencial en agar o caldo, utilizando diferentes emulsificantes para su incorporación al medio de acuerdo a Burt (2004). Como testigo se utilizó una cepa local de Ea aislada previamente. Para la preparación del preinóculo se colocó una concentración de Ea de 1 x 10⁷ UFC mL^-1 en un matraz Erlemmeyer con 250 mL de caldo Luria-Bertani (LB). El matraz se mantuvo en agitación constante a 165 rpm y a una temperatura de 29± °C durante 48 h. Transcurrido este tiempo de adaptación se contabilizó la población existente usando una cámara de Neubauer y éste resultado se utilizó para calcular el inóculo final. Se colocaron 100 μL de la suspensión 1x10⁷ UFC mL^-1 en los matraces con 250 mL de LB. Transcurrida 1 h se añadieron diferentes porcentajes del aceite esencial de orégano: 0.027, 0.036, 0.045, 0.055, 0.064 y 0.073% (p/v), utilizando como emulsificante un detergente líquido comercial al 0.2% (v/v), posteriormente se colocaron bajo las mismas condiciones de crecimiento que el preinóculo. La viabilidad de las bacterias se determinó por conteo en placa, para lo cual se utilizó 1 mL de muestra y se diluyó con agua peptonada. Las diluciones seriales fueron puestas en medio de cultivo CCT e incubadas por 24 h a una temperatura de 28°C. Todas las pruebas se realizaron por triplicado.

Tratamientos en campo. Los tratamientos consistieron en la aspersión de los antibióticos utilizados en la región cuyos ingredientes activos son: Estreptomicina, gentamicina y oxitetraciclina, un testigo asperjando solamente agua y como tratamiento alternativo se aplicó 0.11% (p/v) del aceite esencial de orégano. Éste porcentaje se basó en los resultados obtenidos in vitro y a lo reportado por Burt (2004).

Tiempo de aspersión y evaluación de tratamientos. La aplicación se realizó de acuerdo al modelo línea de predicción de temperaturas medias (LTM) propuesto por Thomson et al. (1982), modificado por Bubán et al. (2004) y al porcentaje de impresiones positivas de estigmas en medios semiselectivos.

El primer modelo está basado en la relación de las temperaturas y la ocurrencia del patógeno en las flores, indicando que el patógeno podría no ser detectado en las flores cuando la temperatura media diaria estuviera por debajo de los 15.6°C. Sin embargo, estudios realizados en Hungría por Bubán et al. (2004) mejoraron este método considerando también eventos de humedad. Estos autores reportaron las siguientes condiciones:

Ocurrencia de la infección (Denotado por I), cuando el promedio de las temperaturas medias se encuentra por arriba de la línea de predicción y además existe un evento de humedad (>1 mm de lluvia, ó >1 h de rocío) durante el mismo día o un día antes. Riesgo de infección alto (H), cuando el promedio de las temperaturas medias se encuentra por arriba de la línea de predicción, sin un evento de humedad. Riesgo de infección moderado (M), cuando el promedio de las temperaturas medias es > 15°C pero < a 15.6°C. Las aspersiones se efectuaron con una mochila motorizada, utilizando 3 L de la solución por árbol cuando las temperaturas no excedieran los 15°C. Cada tratamiento fue aplicado a cinco árboles por bloque.

El daño ocasionado por Ea se determinó contabilizando el total de racimos florales después de 30 días de efectuados los tratamientos, considerando el árbol completo para la evaluación. La eficiencia de los tratamientos fue determinada de acuerdo a Beer (1978), con la siguiente formula:

Donde: DI_ck es la media de la incidencia de la enfermedad con la aplicación del tratamiento testigo (agua) y DI_tr, es la media de la incidencia de la enfermedad de la aplicación en los diferentes tratamientos. El registro de las condiciones climatológicas fue proporcionado por la Unión Agrícola Regional de Fruticultores del Estado de Chihuahua (UNIFRUT 2005 y 2006), considerando la estación meteorológicamás cercana al lote experimental.

Análisis estadístico. Para analizar los datos obtenidos en la aplicación de los tratamientos en campo se empleó un diseño en bloques completamente al azar con una unidad experimental de cinco árboles. Los análisis se realizaron mediante el paquete SAS (2003), una vez que se realizó el análisis de varianza (ANOVA) con F<0.05, se hicieron comparaciones de medias mediante la prueba de Tukey (P<0.05).

RESULTADOS Y DISCUSION

Fenología de floración. El período de floración durante el año 2005 fue más compacto comparado con el ciclo 2006 (Figura1), esto debido a la mayor acumulación de unidades frío (UF) con 979 y 613, respectivamente (UNIFRUT, 2005; 2006). De acuerdo a Hauagge y Cummins (1991), los requerimientos para romper la dormancia apical en manzano 'Golden Delicious', fue superior a las 1000 UF. De igual manera Llamas et al. (2002), mencionan que la escasa acumulación de frío se ve reflejado en una brotación escasa, tardía e irregular. Razón por la cual, el extenso periodo de floración durante el año 2006 dificulta el manejo de Ea, debido a que día a día se abren nuevas flores y son el tejido más susceptible para la infección y al no existir bactericidas sistémicos las flores que abren después de la aplicación no quedan protegidas (Kritzman et al., 2003; Shtienberg et al., 2003).

Porcentaje de poblaciones epifíticas de Erwinia amylovora. Los resultados obtenidos en la impresión de estigmas muestran una menor incidencia de flores colonizadas por Ea durante el 2005, con valores de 5, 5 y 17% al acumularse 112, 189 y 212 unidades térmicas (UT), respectivamente (Figura 2). De acuerdo al método de predicción propuesto por Bubán et al. (2004), el mayor riesgo de infección se presentó al acumularse 189 UT, debido a que las temperaturas promedio estuvieron por encima del umbral con 16.7°C (Figura 2), además de ser la única fecha con presencia de lluvia (0.60 mm), registrando una humedad del 78% (UNIFRUT, 2005), mientras que al acumularse 112 UT el riesgo de infección fue moderado (M). El bajo porcentaje de poblaciones epifíticas de Ea durante 2005, se deben posiblemente a las bajas temperaturas registradas durante la evaluación (Figura 2). Estudios realizados por Bubán et al. (2004), atribuyen la ausencia de Ea en cuatro de cinco huertas muestreadas debido a un período frío antes de la floración. Por otra parte, la incidencia de flores colonizadas con Ea durante 2006 registró un mayor porcentaje de poblaciones epifíticas de Ea en todas las fechas de muestreo (Figura 2), debido posiblemente a las altas temperaturas y a la menor acumulación de unidades frío (613) (UNIFRUT, 2006), registradas durante la evaluación, condiciones que favorecieron el establecimiento de la bacteria aunado a un periodo más extenso en la floración (Figura 1). Durante éste año en la parcela experimental no se registraron eventos de precipitación pluvial, prevaleciendo en la mayoría de los muestreos un riesgo de infección moderado por presentar temperaturas mayores a los 15°C (Bubán et al 2004); sin embargo, debido al manejo del productor quien incrementó la humedad por más de una hora mediante la irrigación, modificó el riesgo de infección moderado (M), a la posible ocurrencia de la infección (I). Estudios realizados por Pusey (2000), menciona que la enfermedad inició en las flores solo cuando la humedad y la incidencia fue superior a 77% incluso cuando las aplicaciones de agua fueron seguidas de un periodo de secado inmediato de 52 min. De igual manera menciona que en el huerto la humedad del suelo afecta el potencial de agua del hospedero, por lo que la bacteria podría multiplicarse sobre los estigmas a menor humedad relativa que la que existe en la tasa floral. Por esta razón la aplicación de los tratamientos se realizó a las 214 UT por presentar el mayor porcentaje de flores colonizadas (96%), así como una humedad relativa del 70% (Figura 2). Miller y Schroth (1972) reportaron que el establecimiento de poblaciones epifíticas de Ea sobre los estigmas es un paso crítico para la infección de flores. A la fecha en la región productora de manzana del estado de Chihuahua regularmente se realizan de cuatro a siete aplicaciones durante floración, con productos a base de estreptomicina, dependiendo de las condiciones climáticas (temperatura, lluvia o granizo).

Pruebas de sensibilidad a estreptomicina. Al evaluar la sensibilidad de las cien cepas de Ea aisladas durante la impresión de estigmas en el medio de cultivo Miller y Schroth (1972), suplementado con estreptomicina a 100 μLL^-1, únicamente se observó el crecimiento de una colonia de Ea a las 48 h de incubación. Investigaciones realizadas por Norelli (2004) menciona que en algunas áreas de Norteamérica, las cepas de Ea resistentes a estreptomicina, han reducido la efectividad de éste antibiótico. Estas cepas resistentes a estreptomicina se incrementaron constantemente de 1994 a 1998, alcanzando un 57%. Al prohibir el uso de la estreptomicina en 1997 este porcentaje se redujo al 15% (Manulis et al.,2003).

Identificación de Erwinia amylovora por PCR. La técnica PCR permitió confirmar la identidad de las cepas aisladas durante la impresión de estigmas en el medio de cultivo CCT; sin embargo algunas muestras no mostraron amplificación en los carriles 3 y 14 (Figura 3A). Resultados similares fueron reportados por Llop et al. (2006), quienes realizaron ensayos para la caracterización molecular de diferentes aislados de Ea por PCR, utilizando iniciadores específicos para el plásmido pEA29. Esta observación parece estar más ligada a la dificultad de obtener una buena amplificación de las secuencias del primer en las muestras que con la posibilidad de que el primer no se encuentre presente en las cepas analizadas. Sin embargo, en estudios recientes se encontró una cepa sin este plásmido por lo que este problema se puede evitar mediante el uso de métodos de PCR basados en el DNA cromosómico (Obradovic et al., 2007).

Pruebas de resistencia a estreptomicina por PCR. Al confirmar la resistencia a estreptomicina del aislado obtenido en el medio de cultivo Miller y Schroth (1972), ésta dio positiva al transposon mostrando la banda característica mediante la amplificación (Figura 3B). Resultados similares fueron reportados por Chiou y Jones (1991) al evaluar cepas de Ea resistentes a este antibiótico en medio B de King's con 50 μgmL^-1, y posteriormente por PCR conteniendo un plásmido de aproximadamente 3.2 Kb. debido al uso generalizado de estreptomicina para el manejo del tizón de fuego, razas de Ea resistentes a estreptomicina son comunes en varias regiones de estados Unidos. La búsqueda de alternativas que reemplacen o complementen a la estreptomicina es un objetivo importante para investigaciones futuras (Norelli, 2004). La detección de genes resistentes a estreptomicina en bacterias de Ea aisladas en medios de cultivo que contienen éste antibiótico es una fuerte evidencia de la presencia de cepas resistentes en el estado de Chihuahua.

Evaluación de los tratamientos en campo. Al evaluar la cantidad de racimos florales con daño durante 2005, se registraron diferencias estadísticamente significativas, únicamente entre los tratamientos de Agry-Mycin y Cuprimicin 100™, presentando este último la mayor eficiencia en el control de la enfermedad (56%). Sin embargo ninguno de los tratamientos fue diferente al testigo donde solo sé aplico agua (Cuadro 1). de igual manera en 2006 se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, así como un mayor número de racimos florales con daño (Cuadro 1), debido posiblemente al período más extenso en la floración (Figura 1) y al mayor porcentaje de poblaciones epifíticas obtenidas durante la impresión de estigmas (37 hasta 96%; Figura 2 B). Altas poblaciones epifíticas de Ea en flores sin ocasionar daños significativos, han sido reportadas en numerosos estudios (Bubán et al., 2003). Aproximadamente el 50% de las flores sanas en huertos de peral al ser infestadas con 10⁶ células de Ea por flor presentaron una incidencia de la enfermedad entre uno o tres brotes infectados por árbol, observando también que la susceptibilidad en flores de peral y manzano varía año con año de acuerdo a la fase de floración.

Al evaluar los tratamientos durante 2006, la eficiencia de Agry-Mycin 100^MR y Cuprimicin 100^MR fue similar con 17 y 24%, respectivamente. El tratamiento de aceite de orégano presentó una mayor eficiencia en el control de la enfermedad (39%), mientras que el tratamiento con Agrygen Plus 800^MR no presentó control (Cuadro 1). En ambos ciclos no se registraron diferencias significativas entre los tratamientos y el testigo (Cuadro 1). 'En estudios realizados por Tsiantos et al. (2003), al evaluar la eficiencia de diferentes productos como alternativa para el manejo del tizón de fuego en árboles de peral y bajo condiciones de inoculación artificial, Agrepet (estreptomicina 20%), presentó el mejor control preventivo y curativo con 90 y 63%, respectivamente, mientras que Bactosan (Pongamin, extracto de la planta Pongamia pinnata), funcionó sólo como preventivo cuando la concentración del inóculo fue menor o igual a 10⁵ UFCmL^-1. En el presente estudio, la baja eficiencia de los tratamientos en el control de Ea, se debe posiblemente a que no se presentaron condiciones óptimas de humedad (Bubán et al., 2004), para que ocurriera la infección, aún cuando el porcentaje de poblaciones epifíticas fue alto en 2006 (Figura 2 B). En estudios realizados por Pusey (2000) bajo condiciones de laboratorio, simulando diferentes rangos de humedad en las flores, concluyó que la colonización de estigmas por Ea bajo condiciones secas, no ocasiona daño a las flores, a menos que la lluvia facilite el movimiento del patógeno al receptáculo floral donde generalmente ocurre la infección. de acuerdo a los resultados obtenidos en la presente investigación, cuando no existe un evento de humedad (lluvia o riego) y están presentes las demás condiciones como son poblaciones altas de Ea y temperaturas por encima del umbral, el riesgo es alto; sin embargo se puede omitir la aplicación de los productos químicos para el manejo de esta bacteria. Aspersiones con más de 1000 L de agua por hectárea, podría facilitar el desplazamiento de la bacteria hacia el receptáculo floral donde ocurriría la infección, ocasionando más de 500 racimos florales con daño en árboles estándar (datos no publicados). En regiones áridas, el daño ocasionado por Ea durante floración puede ser controlado en cierto grado, particularmente en sitios con suelos arenosos limitando la irrigación durante el período de floración e inicio de amarre de frutos (Pusey, 2000). En estudios realizados en perales por Rosenberger y VanCamp (2003), se obtuvo una incidencia entre 21 y 368 frutos infectados con una media de 149, encontrando que la mayor incidencia de Ea en los frutos, fue en la orientación sureste y en la localización del cañón de riego, mientras que en la sección en que no se utilizó el cañón dentro del mismo bloque y orientación, se registraron uno o dos frutos infectados por árbol.

CONCLUSIONES

Durante el año 2006 se registró una menor acumulación de frío, con un período floral más extenso, que favoreció la multiplicación de la bacteria, debido a esto se obtuvo un mayor porcentaje de flores con poblaciones epifitas bacterianas y un incremento del daño ocasionado por Ea; fue en este año cuando se obtuvo un mayor efecto con la aplicación del aceite de orégano. Sin embargo para demostrar su eficiencia es necesario evaluarlo cuando las condiciones para la infección de E. amylovora sean las óptimas ya que los resultados obtenidos en los dos años no son concluyentes.

La detección de la primera cepa resistente a estreptomicina en la región, demuestra la importancia del uso de alternativas para el manejo de enfermedades en el manzano o del conocimiento de las condiciones óptimas de infección de E. amylovora con la finalidad de disminuir el número de aplicaciones de los antibióticos cuando estos no sean necesarios, y por ende el desarrollo de cepas resistentes.

AGRADECIMIENTOS. Los autores agradecen a Fundación Produce Chihuahua, A. C., y a la Unión Agrícola Regional de Fruticultores del Estado de Chihuahua, A.C. (UNIFRUT), por el apoyo financiero, al Sr. Johan Letkeman Wibe, por las facilidades prestadas para establecer la parcela experimental en su huerto, a la empresa Agro Industrial Don Pablo Licón, por facilitarnos el aceite de orégano, así como al Dr. Alfonso A. Gardea Béjar y al Dr. Agustín Rascón Chu por sus comentarios al manuscrito.

Anstey TH. 1965. Prediction of full bloom date for apple, pear, cherry, peach and apricot from air temperature data. Journal of American society for Horticultural science 88:57-66.         [ Links ]

Beer SV. 1978. Techniques for field evaluation of spray material to control fire blight of apple and pear blossoms. Pp: 46-50. In: Zher E. (ed). Methods for evaluating plant fungicides, nematicides and bactericides. American Phytopathological Society. St Paul Minnesota, USA. 141p.         [ Links ]

Bereswill S, Pahl A, Bellemann P, Zeller W and Geider K. 1992. Sensitive and species-specific detection of Erwinia amylovora by polymerase chain reaction analysis. Applied and Environmental Microbiology 58:3522-3526.         [ Links ]

Bubán T, Orosz-Kovács Zs and Farkas Á. 2003. The nectary as primary site of infection by Erwinia amylovora (Burr.) Winslow et al.: a mini review. Plant Systematics and Evolution 238:183-194.         [ Links ]

Bubán T, Rutkai E, Dorgai L and Thomson ST. 2004. Prediction infection risk on the basis of weather-related factors and Erwinia amylovora colonization in apple and pear flowers. International Journal of Horticultural Science10:39-54        [ Links ]

Burt S. 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods-a review. International Journal of Food Microbiology 94: 223-253.         [ Links ]

Chiou CS and Jones AL. 1991. The analysis of plasmid-mediated streptomycin resistance in Erwinia amylovora. Phytopathology 81:710-714.         [ Links ]

Guerrero PVM, Romo CA, Orozco AJA, Berlanga RDI, Gardea BAA y Parra QAR. 2006. Polinización en manzanos 'Red Delicious' y 'Golden Delicious'. Revista Fitotecnia Mexicana 29:41-45.         [ Links ]

Hauagge R and Cummins JN. 1991. Phenotypic variation of length of bud dormancy in apple cultivars and related Malus species. Journal of the American Society for Horticultural Sience 116:100-106.         [ Links ]

Ishimaru C and Klos EJ. 1984. Anew medium for detecting Erwinia amylovora and its use in epidemiological studies. Phytopathology 74:1342-1345.         [ Links ]

Johnson KB and Stockwell VO. 2000. Biological control of fire blight. Pp 319-337. In: Vanneste JL. Fire blight: The Disease and its Causative Agent Erwinia amylovora. Eds. Cab International. Wallingford UK. 370 p.         [ Links ]

Kritzman G, Shwartz H, Marcus R, Manulis S, Klietman F, Oppenheim D, Zilberstaine Μ and Shtienberg D. 2003. Testing a rapid diagnostic medium for Erwinia amylovora and development of a procedure for sampling blossoms in pear orchard. Phytopathology 93:931-940.         [ Links ]

Lecomte P. Manceau Ch, Paulin JP and Keck Μ. 1997. Identification by PCR analysis on plasmid pEA29 of isolates of Erwinia amylovora responsible of an outbreak in Central Europe. European Journal of Plant Pathology 103:91-98.         [ Links ]

Llamas LJ, Carvajal ME, Orozco AJA, Rascón CA, Romo CA, Guerrero PVM, González HVA y Gardea BAA. 2002. Respuesta metabólica y brotación de yemas de manzano por la aplicación de promotores de brotación. Revista Fitotecnia Mexicana 25:411-417.         [ Links ]

Llop P, Donat V, Rodríguez Μ, Cabrefiga J, Ruz L, Palomo JL, Montesinos E and López ΜΜ. 2006. An indigenous virulent strain of Erwinia amylovora lacking the ubiquitous plasmid pEa29. Phytopathology 96:900-907.         [ Links ]

Manulis S, Kleitman F, Shtienberg D, Shwartz H, Oppenheim D, Zilberstaine Μ and Shabi E. 2003. Changes in the sensitivity of Erwinia amylovora populations to streptomycin and oxolinic acid in Israel. Plant Disease 87:650-654.         [ Links ]

Manulis S, Zutra D, Kleitman F, Dror O, David I, Zilberstaine Μ and Shabi E. 1998. Distribution of streptomycin-resistant strains of Erwinia amylovora in Israel and occurrence of blossom blight in autumn. Phytoparasitica 26:223-230.         [ Links ]

Miller TD and Schroth MN. 1972. Monitoring the epiphytic population of Erwinia amylovora on pear with a selective medium. Phytophathology 62:1175-1182.         [ Links ]

Momol MT, Norelli JL, Piccioni DE, Momol EA, Gustafson HL, Cummins JN and Aldwinckle HS. 1998. Internal movement of Erwinia amylovora through symptomless apple scion tissues into the rootstock. Plant Disease. 82:646-650.         [ Links ]

Norelli JL. 2004. Fire Bligth Pp: 443-447. In: Goodman RM (ed). Encyclopedia of Plant and Crop Science. Marcel Dekker, Inc. NY., USA. 1329p.         [ Links ]

Norelli JL, Jones AL and Aldwinckle HS. 2003. Fire management in the twenty-first century, using new technologies that enhance host resistance in apple. Plant Disease 87:756-765.         [ Links ]

Obradovic D, Balaz J and Kevresan S. 2007. Detection of Erwinia amylovora by novel chromosomal polymerase chain reaction primers. Microbiology 76:748-756.         [ Links ]

Portillo RMC, Viramontes RS, Muñoz CLN, Gastelum FMG and Nevarez MVG. 2005. Antifungal activity of Mexican oregano (Lippia berlandieri Shauer). Journal of Food Protection 68:2713-2717.         [ Links ]

Pusey LP. 2000. The role of water in epiphytic colonization and infection of pomaceous flowers by Erwinia amylovora. Phytopathology 90:1352-1357.         [ Links ]

Rosenberg DA and VanCamp KL. 2003. Temperature declines during storms and irrigation may contribute to fire blight infection of pear fruit. Plant Health Progress. (doi:10.1094/PHP-2003-0310-01-RS).

SAS Institute. 2003. Version 9.1. SAS institute Inc. Cary, NC, USA. 1028p.         [ Links ]

SIAP. 2006. Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera, Sagarpa. Anuario estadísticas de la producción agrícola. http://www.siap.sagarpa.gob.mx/ (consulta, julio 2006).         [ Links ]

Shtienberg D, Shwartz H, Oppenheim D, Zilberstaine Μ, Herzog H, Manulis S and Kritzman G. 2003. Evaluation of local and imported fire blight warning systems in Israel. Phytopathology 93:356-363.         [ Links ]

Taylor RK, Guilford PJ, Clark RG, Hale CN and Forster RLS. 2001. Detection of Erwinia amylovora in plant material using novel polymerase chain reaction (PCR) primers. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 29:35-43.         [ Links ]

Thomson SV. 1992. Monitoring flowers for presence of epiphytic Erwinia amylovora by stigma streaking. Phytopathology 82:1077.         [ Links ]

Thomson SV, Schroth MN, Moller WJ and Reil WO. 1982. A forecasting model for fire blight of pear. Plant Disease 66:576-579.         [ Links ]

Thomson SV and Gouk SC. 2003. Influence of age of apple flowers on growth of Erwinia amylovora and biological control agents. Plant Disease 87:502-509.         [ Links ]

Tsiantos J, Psalllidas P and Chatzaki A. 2003. Efficacy of alternatives to antibiotic chemicals for the control offire blight of pears. Annals of Applied Biology 143:319-323.         [ Links ]

Ultee A, Bennik MHJ and Moezelaar R. 2002. The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food born pathogen Bacillus cereus. Applied and Environmental Microbiology 68:1561-1568.         [ Links ]

UNIFRUT, Unión Agrícola Regional de Fruticultores del Estado de Chihuahua, A. C. 2005. Estadísticas realizadas por UNIFRUT. http://www.unifrut.com.mx/index_archivos/estaciones (Consulta, junio 2005).         [ Links ]

UNIFRUT, Unión Agrícola Regional de Fruticultores del Estado de Chihuahua, A. C. 2006. Estadísticas realizadas por UNIFRUT. http://www.unifrut.com.mx/index_archivos/estaciones (Consulta, junio 2006).         [ Links ]

Valero Μ and Giner MJ. 2006 Effects of antimicrobial components of essential oils on growth of Bacillus cerus INRA L2104 in and the sensory qualities of carrot broth. International Journal of Food Microbiology 106:90-94.         [ Links ]