Embriones Transgénicos de Mango (Mangifera indica) cv. 'Ataulfo' con el Gen de la Defensina J1
Transgenic Mango Embryos (Mangifera indica) cv. 'Ataulfo' with the Defensin J1 Gen
Marisela Rivera Domínguez1, Karen Rosalinda Astorga Cienfuegos1, Socorro Vallejo Cohen1, Irasema Vargas Arispuro1 y Ernesto Sánchez Sánchez2
1 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C., Coordinación de Ciencia de los Alimentos, Carr. a la Victoria km. 0.6, Hermosillo Son., CP 83000, México.
]]> 2 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Apdo. Postal 189, Navojoa, Son., CP 85800, México. Correspondencia: marisela@ciad.mx
Recibido: Septiembre 01 2010
Aceptado: Diciembre 07, 2010
Resumen
En el presente trabajo se realizó la transformación genética de embriones somáticos de mango cv. 'Ataulfo con el gen de la defensina J1 de chile pimiento. En ensayos in vitro se demostró que extractos proteicos de embriones transformados inhibieron el crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides, Aspergillus niger y Fusarium sp. En contraste, extractos proteicos de embriones sin transformar no afectaron el crecimiento de los hongos. Estos resultados, junto con la amplificación de los genes J1 y nptII del ADN genómico, nos indican la incorporación y la expresión del transgen en los embriones.
Palabras clave: Transformación genética, biobalística, proteínas de defensa, defensina J1 de chile pimiento.
Abstract
]]> In this paper, the genetic transformation of somatic embryos of mango cv. 'Ataulfo' with the Bell pepper J1 defensin gene was performed. In vitro tests showed that protein extracts from processed embryos inhibited the growth of Colletotrichum gloeosporioides, Aspergillus niger and Fusarium sp. In contrast, protein extracts from embryos without change did not affect the growth of fungi. These results, together with the amplification of J1 and nptII genes of the genomic DNA, show the incorporation and expression of the transgene in the embryos.Keywords: Genetic transformation, biolistic, defense proteins, bell pepper J1 defensin.
A nivel mundial, México es el principal exportador de mango (Mangifera indica L.) y ocupa el quinto lugar en su producción. Entre los principales problemas que enfrenta la industria del mango se encuentran las enfermedades. Particularmente, la antracnosis causada por Colletotrichum gloeosporioides Penz, es la enfermedad más importante. Los fungicidas comerciales que son utilizados para el control de estas enfermedades sólo ofrecen protección temporal. Por lo que las enfermedades fúngicas siguen siendo un problema limitante en estos cultivos. Por otro lado, es conocido que las defensinas juegan un papel importante en el mecanismo de defensa contra hongos, bacterias y protozoos y no son tóxicos a células de mamíferos y plantas. En ensayos in vitro se ha determinado su actividad antimicrobiana y la resistencia que ejercen contra fitopatógenos en plantas transgénicas (Zainal etal., 2009). Las cuantiosas pérdidas económicas en el cultivo de mango, ocasionadas principalmente por fitopatógenos demanda la generación de nuevas líneas mejoradas resistentes, por lo que el presente trabajo se enfocó en la transformación de embriones somáticos de mango cv. Ataulfo' con el gen de la defensina J1 con la finalidad de conferir la protección contra hongos fitopatógenos.
La transformación genética por biobalística fue realizada utilizando el plásmido pKYLX80-J1 conteniendo el gen J1 de chile pimiento (Meyer et al., 1996) bajo el promotor CaMV35S y el gen de resistencia a kanamicina nptII incorporado al plásmido pKYLX80. Las condiciones del bombardeo fueron presión del gas helio de 1200 psi, presión de disparo de 800 psi y distancia de 9 cm., en una cámara de bombardeo PDS-1000/He Du Pont Biolistics Microparticle Acceleration System (BIO RAD). Los embriones bombardeados se mantuvieron por 16 h en medio osmótico y posteriormente, fueron transferidos a medio de mantenimiento y de germinación e incubados en obscuridad a 27°C (Rivera-Domínguez et al., 2004) bajo condiciones selectivas (300 mg de kanamicina). La reacción de PCR se realizó utilizando ADN genómico de embriones en germinación con iniciadores específicos para el gen nptII (Blake et al., 1991) y J1 (Houlné et al., 1998). El ensayo in vitro se realizó exponiendo a los hongos Colletotrichum gloeosporioides, Aspergillus niger y Fusarium sp., y discos impregnados con extractos proteicos de embriones en germinación (Meyer et al., 1996). Se realizaron al menos cinco réplicas en cada ensayo y se repitió en dos ocasiones.
La transformación de embriones de mango con el gen J1 , fue verificado mediante la amplificación del gen nptII y el gen J1 [Figura 1 (A1) y (A2)]. El ensayo in vitro de los hongos C. gloeosporioides, A. niger y Fusarium sp., reveló que al igual que el fungicida comercial benomilo (control positivo), el extracto proteico obtenido de los tejidos transformados, logró inhibir el crecimiento de los hongos formado un halo de inhibición del crecimiento micelial alrededor de los discos impregnados. En contraste, se muestra proliferación y crecimiento del fitopatógeno alrededor y sobre los discos impregnados con agua destilada estéril, buffer de extracción y del extracto proteico de los tejidos sin transformar [Figura 1 (A3), (A4) y (A5)].
Los extractos proteicos obtenidos de embriones transgénicos de mango cv. 'Ataulfo' lograron inhibir el crecimiento de los hongos C. gloeosporioides, A. niger y Fusarium sp. Estos resultados junto con la amplificación de los genes J1 y nptII del ADN genómico de los embriones, indican la incorporación y la expresión del transgen. Este es el primer trabajo que reporta la transformación genética de embriones de mango utilizando el gen de la proteína J1.
]]> LITERATURA CITADA
Blake, N.K., Ditterline, R.L. and Stout, R.G. 1991. Polymerase chain reaction for monitoring multiple interaction in Agrobacterium-mediated transformation. Crop Science 31:1686-1688. [ Links ]
Houlné, G., Meyer, B. and Schantz., R. 1998. Alteration of the expression of a plant defensin gene by exon shuffling in bell pepper (Capsicum annuum L.). Molecular and General Genetic 259:504-510. [ Links ]
Meyer, B., Houlné, G., Pozueta-Romero, J., Schantz, M.L. and Schantz, R. 1996. Fruit specific expression of a defensin type gene family in bell pepper. Plant Physiology 112:615-622. [ Links ]
Rivera-Domínguez, Μ., Manzanilla, M.A., Robles, Μ. and Gómez-Lim, M.A. 2004. Induction of somatic embryogenesis and plant regeneration of "Ataulfo" mango (Mangifera indica). Plant Cell, Tissue, and Organ Culture 79:1-4. [ Links ]
Zainal, Z., Marouf, E., Ismail, I. and Fei, C.K. 2009. Expression of the Capsicuum annum (Chili) defensin gene in transgenic tomatoes confers enhanced resistance to fungal pathogens. American Journal of Plant Physiology 4:70-79. [ Links ]
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