Enzimas Líticas Producidas por Trichoderma spp. y su Correlación con la Inhibición in vitro de Patógenos Causantes de la Pudrición de la Raíz del Garbanzo

Lytic Enzymes Produced by Trichoderma spp. and Their Correlation With in vitro Inhibition of Chickpea Root Rot Pathogens

Jesús Edén Paredes Escalante¹, José Armando Carrillo Facio¹, Josefa Adriana Sañudo Barajas¹, Raúl Allende Molar¹, Raymundo Saúl García Estrada¹, Roberto Gregori² y John M. Labavitch³

¹ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. Unidad Culiacán, Apdo. Postal 32A, km. 5.5 Carr. Culiacán-El Dorado, Culiacán, Sin., CP 80129, México.

³ Department of Plant Sciences, University of California, Davis, CA, 95616, USA. Corresponding author: acarrillo@ciad.edu.mx

Recibido: Marzo 25, 2010
Aceptado: Noviembre 08, 2010

Resumen

Las cepas nativas de Trichoderma viridae (CIAD 01-570903 y CIAD 03-580903), T. harzianum (CIAD 04560903 y CIAD 05-550903), y T. lignorum (CIAD 02-590903 y CIAD 06-540903) inhibieron in vitro a F. oxysporum, S. rolfsii y R. solani. La actividad quitinasa y la inhibición de hongos patógenos de las cepas presentaron una correlación de Pearson's r = 0.90 para la inhibición de S. rolfsii. T. lignorum (CIAD 06 540903) fue cultivada bajo micoparásitos de hongos simulados contra paredes celulares de F. oxysporum, S. rolfsii, R. solani o glucosa como fuente de carbono. La cepa tuvo una inducción diferencial de quitinasa y una actividad de β-1,3-glucanasa contra las paredes celulares de R. solani, lo que sugiere su posible papel dentro de la lisis de la pared de estas últimas.

Palabras clave: Trichoderma, control biológico, β-1,3-glucanasa, quitinasa.

Native strains of Trichoderma viridae (CIAD 01570903 and CIAD 03-580903), T. harzianum (CIAD 04560903 and CIAD 05-550903), and T. lignorum (CIAD 02590903 and CIAD 06-540903) showed inhibition in vitro against F. oxysporum, S. rolfsii, and R. solani. The chitinase activity and the inhibition of fungal pathogens by the Trichoderma strains presented a Pearson's correlation r = 0.90 for S. rolfsii inhibition. T. lignorum (CIAD 06 540903) was grown under simulated mycoparasitism with F. oxysporum, S. rolfsii or R. solani cell walls or glucose used as a carbon source. T. lignorum showed a differential induction of chitinase and β-1,3-glucanase activity when grown with cell walls of R. solani, suggesting possible roles for these enzymes in pathogen cell wall lysis.

Keywords: Trichoderma, biological control, β-1,3-glucanase, chitinase.

La capacidad de Trichoderma spp. de secretar β-1,3-glucanasa y quitinasas extracelulares se ha correlacionado con el control biológico de hongos patógenos vegetales, por su papel en la ruptura de las paredes celulares de los patógenos (Harman et al., 1993). Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, y Rhizoctonia solani se distribuyen ampliamente en las regiones productoras de cártamo en México. Pueden infectarn raicesy producir pérdidas en la producción de garbanzo (Akram et al., 2008). Aún cuando existen biofungicidas producidos a base de Trichoderma spp, es de suma importancia realizar la detección continua de nuevas cepas con una amplia gama de actividad contra distintos fitopatógenos. El presente estudio correlaciona la actividad extracelular de la quitinasa, la proteasa y β-1,3-glucanasa de cepas de Trichoderma spp. aisladas de la rizósfera del garbanzo y su capacidad para antagonizara F. oxysporum, R. solani y S. rolfsii.

Las cepas de Trichoderma fueron evaluadas en cultivos duales en agar de papa dextrosa (PDA) para seleccionar inhibidores de crecimiento de micelio de F. oxysporum, R. solani y S. rolfsii. La quitinasa y la proteasa en las cepas de Trichoderma fueron inducidas de acuerdo a Harman et al. (1993) y la actividad fue evaluada mediante la técnica de difusión radial. La quitina (0.02%) o gelatina (3%) se incluyeron dentro de un gel de agarosa de 0.8 % preparado en 25 mL de acetato de sodio (50 mM, pH 6). Después de la solidificación, se cortaron pozos con un diámetro de 6 mm; se agregaron 50 μL de medio de cultivo filtrado y se incubaron las placas (24 h a 37 °C). Una tinción con un 1% de solución rojo Congo (Sigma) produjo halos claros de la actividad de quitinasa, mientras que la proteasa se visualizó sin manchas. El experimento se llevó a cabo bajo un diseño completamente al azar y los tratamientos se repitieron cuatro veces. La correlación entre el crecimiento de inhibición y las actividades enzimáticas se presentaron como un coeficiente Pearson (r). La cepa de T. lignorum se utilizó para asemejar micoparasitismo contra el hongo (Harman et al., 1993). Los hongos se cultivaron en caldo de papa-dextrosa (CPD) (110 rpm y 25 °C) durante siete días y después se autoclavearon; el micelio se centrifugó (3500 g, 10 min), se lavó con acetona, se secó (50°C 48 h), posteriormente se utilizó como fuente de carbono o glucosa como control. Los tratamientos se repitieron cinco veces. Se recuperaron las enzimas secretadas en los cultivos (0.45 μm de membrana de tamaño poro) y se almacenaron a -80°C hasta su uso. La generación de extremos reductores contra quitina o laminarina (0.5%, Sigma) fue controlada a 37 °C durante 40 minutos con el ensayo de la 2-cianoacetamida. Una unidad de quitinasa o de actividad de β-1,3-glucanasa fue la cantidad de enzima que catalizó la liberación de 1 μmol de N-acetilglucosamina o glucosa por minuto, respectivamente. Los datos fueron sometidos a análisis de varianza y se compararon las medias (Tukey's test P≤0.05).

Todas las cepas mostraron una mayor inhibición de S. rolfsii y R. solani que F. oxysporum, así como diferencias en su capacidad para inhibir el crecimiento de micelio (datos no presentados). La quitinasa en la cepa T. lignorum (CIAD 06540903) hidrolizó 4.5 mm² de substrato por mL de cultivo y resultó significativamente superior a 2.03 y 2.74 mm² mL^-1 de la actividad producida por los aislamientos de T. viridae (CIAD 01-570903 y CIAD 03-580903). La correlación más alta entre la actividad de la quitanasa y la inhibición in vitro, se observó en S. rolfsii (0.902) y F. oxysporum (0.862); se encontró una correlación lineal no representativa para la actividad de la proteasa (0.5). T. lignorum CIAD 06-540903 destacó para inhibir el crecimiento de micelio y en la capacidad para producir actividad de quitanasa, así como por una correlación mayor a 0.7 en el ensayo de difusión radial. F. oxysporum reveló una suceptibilidad relativamente baja in vitro a las cepas de Trichoderma spp. evaluadas. Una posible explicación es la capa de proteínas (7 o 8 % peso seco) que cubre las capas de las paredes celulares de la quitina y el glucano, pudiendo así proteger la acción de quitinasas y glucanasas (Schoffelmeer et al., 1999); sin embargo, en este estudio la actividad de proteasa no se correlacionó con el antagonismo.

Bajo micoparasitismo simulado, R. solani indujo la mayor actividad de quitinasa y β-1,3-glucanasa (Cuadro 1) de T. lignorum. La actividad de quitinasa frente a F. oxysporum y S. rolfsii no fue distinta a la del control. Una alta actividad enzimática de β-1,3-glucanasa y una actividad menor de quitinasa se reportó en Trichoderma cuando se cultiva en medio mineral suplementado con micelio o pared celular de patógenos de las plantas (El-Katatny et al., 2000). Sin embargo, la actividad de β-1,3-glucanasa en T. lignorum, crecido en la glucosa, fue menor que en el medio con paredes celulares del patógeno, lo que sugiere que los β-1,3-glucanos no son totalmente necesarios para inducir la expresión de β-1,3-glucanasa (El-Katatny et al., 2000). La actividad quitinasa en el medio con pared celular de R. solani tuvo el doble de actividad que en los medios con S. rolsfii, F. oxysporum o glucosa (Cuadro 1). La quitinasa ha sido propuesta como regulador de las reacciones metabólicas relacionadas con el crecimiento y desarrollo en el micoparásito; y la actividad exo-quitinasa de Trichoderma fue reportada en medios suplementados con mono y disacáridos lo cual surgirió una inducción constitutiva. Nuestro ensayo no discriminó entre acción endo y exo para sugerir la expresión constitutiva de la exo-quitinasa de la cepa evaluada.

LITERATURA CITADA

Akram, A., Iqbal, S.M., Qureshi, R.A., and Rauf, C.A. 2008. variability among isolates of Sclerotium rolfsii associated with collar rot disease of chickpea in Pakistan. Pakistan Journal of Botany 40:453-460.         [ Links ]

El-Katatny, M.H., Somitsch, W., Robra, K.H., El-Katatny, M.S. and Gubitz, G.M. 2000. Production of chitinases and β-1,3-glucanase by Trichoderma harzianum for control of the phytopathogenic fungus Sclerotium rolfsii. Food Technology Biotechnology 38:173-180.         [ Links ]

Harman, G.E., Hayes, C.K., Lorito, M., Broadway, R.M., Di Pietro, A., Peterbauer, C. and Tronsmo, A. 1993. Chitinolytic enzymes of Trichoderma harzianum: Purification of chitobiosidase and endochitinase. Phytopathology 83:313-318.         [ Links ]

Schoffelmeer, E.A.M., Klis, F.M., Sietsma, J.H., and Cornelissen, B.J.C. 1999. The cell wall of Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology 27:275-282.         [ Links ]