Etiología de la Pudrición de Bulbo y Tallo de la Azucena Híbrida (Lilium Spp.) y su Control en el Estado de México

Etiology of Hybrid Lily (Lilium Spp.) Bulb and Stem Rot and its Control in the State of Mexico

Kesia Magos–García¹, Santos Gerardo Leyva–Mir¹ y Luis Antonio Mariscal–Amaro²

¹ UACH, Departamento de Parasitología Agrícola, Carr. México–Texcoco, Km. 38.5, CP 56230, Chapingo, Edo. de México.

² INIFAP–CEVAMEX, Km. 13.5 Carr. Los Reyes–Texcoco, Coatlinchán, Texcoco, Edo. México. Correspondencia: lsantos@correo.chapingo.mx.

Recibido: Septiembre 07, 2009
Aceptado: Octubre 06, 2010

Resumen

La pudrición de bulbo y tallo de la azucena híbrida (Lilium spp.) es una enfermedad que apareció recientemente en Xocotlán, Texcoco, Edo. de México, caracterizada por necrosis ascendente que causa la muerte prematura de plantas ocasionando 50 % de pérdidas en producción. Mediante caracterización morfológica del patógeno y PCR, amplificando la región rDNA ITS, se obtuvo una secuencia genética de 562 pares de bases (pb), indicando que el agente causal fue Fusarium oxysporum Schelecht. Emend. Snyd & Hans. Se evaluó la efectividad biológica de tres fungicidas químicos y un biológico en invernadero observándose que los mejores productos para controlar al hongo fueron Procloraz (SPORTAK®) y Trichoderma harzianum con una eficiencia del 89 % y 82 %, respectivamente.

Palabras clave: necrosis, Lilium spp., Fusarium oxysporum.

Abstract

The bulb and stem rot of hybrid lily (Lilium spp.) is a disease that recently appeared in Xocotlán, Texcoco, Mexico State, which is characterized by necrosis upwardly; it causes the premature death of plants, as well as 50% loss in production. A gene sequence of 562 base pairs (bp) was obtained throughout morphological characterization of the pathogen and PCR, plus rDNA ITS region amplification, indicating that the causal agent was Fusarium oxysporum Schelecht. Emend. Snyd & Hans. The biological efficacy of three chemical and biological fungicides in greenhouse was evaluated, observing that the best products to control the fungus were Prochloraz (SPORTAK®) and Trichoderma harzianum with an 89% and 82% efficiency, respectively.

INTRODUCCION

La producción de azucena híbrida en México ha aumentado de 33 ha sembradas y 6000 gruesas en 2001 a 108 ha y 3208 gruesas en 2007, siendo el estado de Jalisco y Estado de México las zonas productoras más importantes. En Texcoco, Estado de México, se ha observado una pudrición ascendente del bulbo y tallo de esta flor, que ha causado problemas en su producción causando pérdidas severas de 50 %. El agente causal de esta enfermedad no ha sido caracterizado por lo que no se puede hacer un manejo adecuado del mismo. Los objetivos de esta investigación fueron: 1) Identificar el agente causal de la pudrición del bulbo y tallo de la azucena híbrida (Lilium spp.) usando técnicas moleculares y secuenciación de DNA; y 2) Evaluar alternativas de manejo químico y biológico de la enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

En invernaderos de Xocotlán, Texcoco, Edo. de México, se hicieron muestreos dirigidos de plantas adultas de azucena híbrida, variedad "Acapulco", con pudriciones en bulbo y tallo; tomándose cuatro muestras compuestas de 20 plantas que se conservaron en refrigeración a 10 °C en bolsas de plástico. Las muestras se analizaron en el laboratorio de Micología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo. En un invernadero comercial de 1000 m² con 20 áreas de 1 m² se aplicaron cinco tratamientos para evaluar las alternativas de manejo químico y biológico.

Diagnóstico y pruebas de patogenicidad. Se desinfestaron trozos de material vegetal enfermo y se pusieron cinco en cajas petri con medio de cultivo PDA. Del crecimiento obtenido en las cajas se tomaron pedazos de PDA con micelio que se reaislaron para obtener aislamientos puros. El organismo aislado y purificado se inóculo de forma manual en tres repeticiones de 20 plántulas sanas de azucena variedad "Acapulco" a una concentración de 10⁶ conidios/mL de agua. Las plantas inoculadas se sometieron a humedad relativa (HR) del 100 % con un humificador por 72 h. Al finalizar este periodo se llevaron a invernadero a 48 % HR y temperaturas de 20 °C a 25 °C. Del patógeno reaislado a partir de material vegetal con síntomas se hicieron preparaciones semipermanentes y se observaron sus características morfológicas en un microscopio compuesto. Se identificó el patógeno usando el manual de laboratorio de Leslie y Summerell (2006).

Identificación molecular mediante PCR. Se utilizaron cepas del reaislamiento obtenido en las pruebas de patogenicidad. La extracción de DNA se realizó con el método AP utilizado en el CINVESTAV (Balbas, 2002), verificándose su calidad mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.2 %; este gel se observó en el fotodocumentador (Bio–Imaging Systems Mini Bis Pro). Para la PCR se prepararon 10 muestras de DNA mismas que se metieron al Termociclador (Termal Cycler 2720 Appliedm Biosystems) para llevar a cabo la amplificación de la región rDNA ITS con los iniciadores universales ITS4 e ITS5. Concluido el paso anterior se visualizaron en el fotodocumentador los fragmentos de ADN amplificados, en un gel de agarosa al 1.2 % donde se incluyó un marcador molecular de 100 pb. La limpieza del producto de la PCR se hizo con el producto comercial WIZARD SV GEL Y PCR CLEAN–UP SYSTEM® (Promega®). Las muestras se secuenciaron en el secuenciador Genetic Analizer 3100 (Applied Biosystem Corp.®) del Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Nacional Autónoma de México.

Prueba de efectividad en invernadero. El experimento se realizó bajo un diseño en bloques completos al azar con cuatro repeticiones y unidades experimentales de 10 plantas. Los tratamientos fueron: 1) Testigo sin aplicación, 2) T. harzianum (PHC®T–22®) 5 g/L agua, 3) Benomil (BENOLATE 50PH®) 4 g/L agua, 4) Tiabendazol (TECTO 60®) 5 g/L agua, y 5) Procloraz (SPORTAK® 45 CE) 0.002 L/L agua. Se inocularon 200 plantas de azucena de la variedad "Acapulco" siguiendo el mismo procedimiento que en las pruebas de patogenicidad, 50 por bloque y 10 plantas por cada tratamiento. Cada fungicida químico se asperjó directamente al cuello de las plantas, para T. harzianum se retiraron las plantas del sustrato y se inoculó la raíz. Las evaluaciones de porcentaje de control se hicieron a los 30 y 65 dda. Con los datos obtenidos se hizo un análisis de varianza (ANOVA) y prueba de Tukey (α=0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La incidencia de la enfermedad en invernadero fue 74 % con síntomas presentes en etapa de formación de botones, coincidiendo con Kenneth y Horst (1997) quien observó síntomas en el estado de floración. Los síntomas fueron plantas con hojas amarillentas y curvadas, una coloración púrpura del cuello y en algunos casos necrosis. Las colonias del patógeno en PDA fueron de color blanco con un halo púrpura y micelio algodonoso; presentando gran cantidad de macroconidios coincidiendo con Li et al., (2000) y Leslie y Sumerell (2006). Las características morfológicas del hongo correspondieron al género Fusarium spp, y mediante las claves taxonómicas para la identificación de especies de Fusarium spp., se comprobó que el agente causal fue F. oxysporum coincidiendo con Romero (1988), Forsberg (1975) y Leslie y Summerell (2006). Con la técnica de extracción mediante AP se obtuvieron muestras de DNA de buena calidad mismas que mostraron una fuerte amplificación en la PCR y cuyo resultado fue un producto de 600 pb. Estas secuencias obtenidas se compararon con las del GenBank del NCBI, con el programa Clustal, el cual mostró que las secuencias pertenecieron a F. oxysporum, con un porcentaje de alineación del 98%. Mediante la graficación de las secuencias se determinó que la fase sexual del hongo fue Gibberella moniliformis, coincidiendo con Leslie y Summerell (2006). El análisis de varianza y la prueba de Tukey indicaron que Procloraz (SPORTAK®) mostró un porcentaje de eficiencia de 89 % de control, T. harzianum alcanzó un 82 %, y los productos con menor efecto fueron Tiabendazol con 73 % y Benomil con 59 %.

CONCLUSIONES

El agente causal de la pudrición del bulbo y tallo de la azucena híbrida fue la especie F. oxysporum corroborándose con la técnica de PCR. El biofungicida T. harzianum y el fungicida Procloraz (SPORTAK®) presentaron el mejor control de F. oxysporum en invernadero.

LITERATURA CITADA

Balbas, P. 2002. De la Biología molecular a la biotecnología. Ed. Trillas. México. 105 p.         [ Links ]

Forsberg, J. L. 1975. Diseases of ornamental plants. University of Illinois Press. Chicago, USA. 2nd Edition. pp 28–29.         [ Links ]

Kennet, R., and Horst, R. K. 1997. Compendium of chrysantemum diseases. Amer. Phytopathological Society. 62 p.         [ Links ]

Leslie, J. F. and Summerell, S. B. 2006. The Fusarium laboratory manual. Firts edition. Ed. Blackwell Publishing. Iowa, USA. 388 p.         [ Links ]

Li S., Tam, Y. K., and Hartman, G. L. 2000. Molecular differentiation of Fusarium solani f. sp. glycines from other F. solani based on mitochondrial small subunit rDNA sequences. Phytopathology 90:491–497.         [ Links ]

Romero, C. S. 1988. Hongos fitopatógenos. Universidad Autónoma Chapingo, Chapingo, Estado de México. 347 p.         [ Links ]