Identificación del Cornezuelo (Claviceps purpurea (Fr.) Tul.) del Trigo (Triticum aestivum L.) en el Municipio de Nanacamilpa, Tlaxcala, México.

Identification of the Ergot (Claviceps purpurea (Fr.) Tul.) of Wheat (Triticum aestivum L.) in Nanacamilpa, Tlaxcala, Mexico.

Santos Gerardo Leyva–Mir¹, Aurelio Hernández–Bautista¹, Luis Antonio Mariscal– Amaro², Héctor Eduardo Villaseñor–Mir² y Julio Huerta–Espino²

¹ Universidad Autónoma Chapingo, Departamento de Parasitología Agrícola, Carr. México–Texcoco, Km. 38.5, Chapingo, Edo. de México, CP 56230. Correspondencia: lsantos@correo.chapingo.mx

² INIFAP, Campo Experimental Valle de México, Km. 18.5 Carr. Los Reyes–Lechería, Chapingo, Edo. de México, CP 56230.

Recibido: Diciembre 18, 2009
Aceptado: Mayo 06, 2010

Resumen

C. purpurea es el hongo causante de la enfermedad llamada cornezuelo del trigo y afecta el rendimiento hasta en 40 %. En la región de Nanacamilpa, Tlaxcala, se sospecha la presencia de C. purpurea; además de que por el tamaño de los esclerocios encontrados se cree que podría ser Claviceps gigantea. Algunos autores argumentan que para un diagnóstico temprano y que diferencie a los dos patógenos, el tamaño del esclerocio a temprana edad es una característica distintiva. Mediante la extracción de DNA de esclerocios y la amplificación de la región ITS (Internal Transcribed Spacer) se pudo comprobar que el tamaño no es una característica distintiva para la separación de estos dos patógenos, además se observó que C. purpurea en la región de estudio puede alcanzar un tamaño temprano de esclerocio mayor al promedio que se menciona en la literatura. Finalmente se corroboró la presencia de C. purpurea en el municipio de Nanacamilpa, Tlaxcala.

Palabras clave: Claviceps purpurea, esclerocio, ITS.

Abstract

C. purpurea is the fungus causing the disease called "ergot of wheat" and can affect the yield until 40 %. In the region of Nanacamilpa, Tlaxcala, suspects the presence of C. purpurea; in addition, by the sclerotia size its believes that could be C. gigantea. Some authors argue that for an early diagnosis and differentiation of these two pathogens, the sclerotia size at an early age is a distinctive feature. By extraction of DNA and amplification of the ITS region (Internal Transcribed Spacer), was proved that size is not a distinctive feature for the separation of these two pathogens, besides was observed that the fungus in the region may reach a greater early sclerotia size than average mentioned in the literature. Finally it was confirmed the presence of C. purpurea in the town of Nanacamilpa, Tlaxcala.

Los Valles Altos de México (Tlaxcala, Hidalgo, Puebla y Edo. de México) se consideran la región más importante del país en cuanto a la producción de trigo de temporal donde se siembran cerca de 130 mil ha (Rodríguez, 2008).

El cornezuelo del trigo puede afectar el rendimiento hasta en 40 % aún en variedades tolerantes, infestando los ovarios de las estructuras florales produciéndose esclerocios que reemplazan las semillas (Zillinsky, 1984). En la región de Nanacamilpa, los productores desconocen si los esclerocios que han observado en las espigas pertenecen a C. purpurea o si por su tamaño grande pertenecen a C. gigantea. Por otro lado, algunos autores mencionan que el tamaño del esclerocio es suficiente para separar a estos dos patógenos; sin embargo, la identificación morfológica puede no ser tan confiable debido a que algunas características morfológicas pueden traslaparse con la de otras especies por lo que otros métodos son necesarios para la exacta y pronta identificación del patógeno, y uno de ellos es mediante el uso de técnicas moleculares y secuenciación de DNA del esclerocio y la amplificación de la región ITS que permitirían acelerar el proceso de identificación. Ante esta problemática respecto al patógeno en la región de estudio y la importancia que está tomando en el sector trigero, se plantearon lo objetivos de corroborar la presencia de C. purpurea y C. gigantea en Nanacamilpa, Tlaxcala; y comprobar si el tamaño del esclerocio es una característica distintiva para separar morfológicamente a los dos patógenos.

MATERIALES Y MÉTODOS

En la región de Nanacamilpa, Tlaxcala, en un muestreo al azar en plantas de trigo de la variedad Temporalera M87 se colectaron en bolsas de papel esclerocios probablemente de C. purpurea (SC1) o C. gigantea (SC2). De manera empírica las personas que diagnostican en la región separan a C. purpurea y C. gigantea de acuerdo al tamaño por lo que esclerocios >2 cm se clasificaron como C. gigantea (SC1), y < 2 cm como C. purpurea (SC2).

Aislamiento de DNA. Fueron dos aislamientos: a) DNA de 20 g de micelio liofilizado de un cultivo puro en PDA proveniente de un esclerocio desinfestado; y b) DNA de 20 mg de esclerocio desinfestado y pulverizado (tratado con nitrógeno líquido). Estos dos procedimientos se hicieron tanto para esclerocios SC1 y SC2 usándose el Kit DNeasy Plant (QIAGEN), mediante el Mini protocolo para purificación del DNA total para tejido vegetal. El procedimiento se realizó de acuerdo a las instrucciones dadas por el fabricante (DPH, 2006).

PCR y purificación. Mediante electroforesis (gel de agarosa 1 %) se observó la calidad e integridad del DNA realizándose así la PCR utilizando primeramente la muestra SC1. La región genómica conteniendo los fragmentos de ITS1, 5.8 rDNA y ITS2 fue amplificada usando los primers ITS5, ITS4, ITS1F, ITS1 (White et al. 1990), con las combinaciones ITS5–ITS4, ITS1F–ITS4 y ITS1–ITS4. Se realizaron cuatro repeticiones de cada muestra de DNA. Una vez optimizado el protocolo con SC1, se realizó la PCR con estas condiciones usando SC2. Se hizo la purificación de la PCR para SC1 y SC2 sólo con el DNA del esclerocio y los primers ITS4 (reverse) y ITS1F (forward), mediante el kit "AccuPrep PCR Purification Kit" de BIONEER.

Secuenciación y análisis. Los productos purificados de esclerocio SC1 y SC2 se secuenciaron en el Colegio de Ciencias Biológicas de la Universidad de California (Davis, CA). Las secuencias se analizaron con el programa BioEdit, se usó la opción Cap contig para obtener la secuencia consenso. Finalmente se compararon las secuencias de ITS1, 5.8 rDNA y ITS2 con las secuencias depositadas en el GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information) por medio del BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para saber si SC1 y SC2 pertenecían a la misma o a diferente especie, y para asegurar ese resultado también se uso el programa ClustalW2 para seleccionar una en base al número de nucleótidos, homología y referencia de la secuencia. Además, ambas secuencias se compararon con otras 19 secuencias de especies diferentes de Claviceps spp., más un control (C.purpurea_AB371642). El análisis se realizó por medio de un árbol filogenético, tomándose las secuencias de ITS disponibles de la misma especie de la base de datos de GenBank.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La concentración de DNA extraído, integro y de alta calidad, fue 5 ng/μl para micelio y 73 ng/μl para esclerocio. Solo se observó una buena amplificación ITS en la PCR de DNA de esclerocio con bandas gruesas y brillantes. Para DNA de micelio no hubo amplificación, posiblemente por degradación del DNA. Los aislamientos SC1 y SC2 mostraron bandas gruesas de DNA arrojando productos aproximados de 600 pares de bases (pb), para cada aislamiento. La secuencia de SC1 con 599pb tuvo una alta homología a las contenidas dentro del GenBank. Los resultados del BLAST del NCBI arrojaron una identidad del 99% con C. purpurea AB160991.1 y C. purpurea AB162147.1. Para SC2 el BLAST arrojó un 99% de homología con las secuencias AJ309368.1 y 97% de homología para de C. purpurea. El análisis de homología en ClustalW2 arrojo un 98% de semejanza entre las secuencias de SC1 y SC2, por lo que para la identificación molecular de Claviceps spp., sólo es necesario la amplificación de la ITS. Se concluye que los esclerocios, SC1 y SC2, molecularmente son de C. purpurea. Se desecha la idea de que el tamaño de esclerocio puede ser una característica distintiva de diagnóstico de campo para separar a C. gigantea de C. purpurea, ya que C. purpurea puede desarrollar esclerocios grandes en la región de Nanacamilpa, Tlaxcala, posiblemente por las condiciones ambientales en las cuales se desarrolla el cultivo. Así mismo, se corrobora la presencia de C. purpurea en esta región.

LITERATURA CITADA

DNeasy Plant Handbook (DHP). 2006. QIAGEN. www1.qiagen.com/HB/DNeasy96Plant. 01/01/2009.         [ Links ]

Rodriguez–Contreras, E., Villaseñor–Mir H. E., Leyva–Mir S. G. , Huerta–Espino J., Sandoval–Islas S y Santos–Posadas H. M. 2008. Efecto de Septoria tritici en el rendimiento de trigo de temporal en ambientes lluviosos de los Valles Altos Centrales de México. Agrociencia 42:435–442.         [ Links ]

White, T. J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J. W. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. pp 315–322. In: PCR protocols: A Guide to Methods and Applications fed. M.A Innis, D.H. Gelfand, J. J. Sninsky & T. J. White), Academic Press: San Diego, CA, USA. 520 p.         [ Links ]

Zillinsky, F. J. 1984. Enfermedades comunes de los cereales de grano pequeño: una guía para su identificación. CIMMYT, el Batán, México. 141 p.         [ Links ]