La Infección de Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. y Sacc. en Aguacatero (Persea americana Mill.): Aspectos Bioquímicos y Genéticos

Infection of avocado (Persea americana Mill.) by Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. y Sacc.: Biochemical and genetics aspects

Edgar Saúl Rodríguez–López, Juan Manuel González–Prieto y Netzahualcoyotl Mayek–Pérez

¹ Instituto Politécnico Nacional, Centro de Biotecnología Genómica, Blvd. del Maestro s/n esq. Elías Piña, Col. Narciso Mendoza, Reynosa, Tamaulipas, México CP 88710. Correspondencia: nmayek@ipn.mx

Resumen

El hongo Colletotrichum gloeosporioides es el agente causal de la antracnosis del aguacatero (Persea americana), enfermedad que ocasiona pérdidas cercanas al 20% de la producción. La infección inicia después del reconocimiento de alcoholes grasos y ceras en la superficie del fruto y dos horas más tarde los genes del hongo CgMEKx y CgMEKl se fosforilan. Dichos genes están involucrados en la diferenciación y germinación de conidios así como en la formación del apresorio. Además, los conidios secretan las proteínas CHIP2 y CHIP3, mismas que se relacionan con el contacto a la superficie del fruto. La activación del gen cap20 ayuda al apresorio a desarrollarse después que se producen las hifas infectivas, para proveer de presión y secretar enzimas degradadoras de la pared celular. Los cambios en el pH del hospedante activan al gen pac1 que induce la expresión del gen pelB y entonces se producen las enzimas poligalacturonasa y pectato–liasa. Los frutos de aguacate producen dieno y especies de oxígeno reactivas. Dichos compuestos provocan la quiescencia del hongo hasta que sus niveles disminuyen y el fruto madura. El proceso infectivo biotrófico produce la secreción de la proteína CIH1 y la etapa necrotrófica involucra las proteínas CLTA1 y CgDN3, mismas que se relacionan con la necrosis de tejidos en una etapa posterior.

Palabras clave: Antracnosis, transducción de señales.

Abstract

The fungus Colletotrichum gloeosporioides is the causal agent of anthracnose in avocado (Persea americana), disease which causes production losses near 20%. Fungal infection starts after recognition of fatty alcohols and waxes at the fruit surface, and two hours later CgMEKx and CgMEK1 genes are phosphorylated. These genes are involved in differentiation and conidia germination as well as appresorium formation. In addition, proteins CHIP2 and CHIP3, related with fruit surface contact, are secreted. Activation of gene cap20 helps the apressorium to develop after infective hyphae are produced, to provide pressure and secrete cell–wall degrading enzymes. Changes in host pH activate pac1 gene which induces pelB gene expression and then polygalacturonase and pectate–lyase enzymes are produced. Avocado fruits produce diene an reactive–oxygen species. These compounds provoke fungal quiescence until their levels decrease as well fruit ripens. The biotrophic infective process produces secretion of CIH1 protein, and the necrothrophy stage involves proteins CLTA1 and CgDN3, which are related with tissue necrosis at a later stage.

Key words: Anthracnose, transduction signals.

INTRODUCCIÓN

El cultivo del aguacatero y sus enfermedades. El cultivo de aguacatero (Persea americana Mill.) es una fuente económica muy importante para México, es de consumo creciente debido a su incorporación en la dieta y genera fuentes de empleo directos e indirectos en su cadena productiva. Según datos de la FAO en el 2007, México ocupó el primer lugar en la producción de aguacate a nivel mundial (FAO, 2008); el principal estado productor es Michoacán, seguido por Morelos, Nayarit, Jalisco y Guerrero. La superficie cultivada de aguacatero en el 2007 fue cercana a las 117,300 ha, que corresponde a una producción de más de un millón de toneladas (SAGARPA, 2007). La creciente demanda del fruto de aguacate en el mundo ha sido factor importante para que se incremente la superficie cultivada. El aguacatero es afectado por varias enfermedades producidas por bacterias y hongos principalmente, entre las que destacan por su prevalencia y por los daños ocasionados al cultivo la cenicilla (Oidium sp.) que ocurre en épocas secas y provoca defoliación y caída de frutos pequeños (Crane et al., 2005); la tristeza del aguacatero (Phytophthora cinnamomi Rands) que se presenta en cualquier etapa fenológica del cultivo (Gabor et al., 1990); la mancha negra o por cercospora (Cercospora purpurea Cooke) que se presenta durante el verano y causa lesiones en el fruto que sirven como punto de entrada para otras enfermedades (Crane et al., 2005); la roña (Elsinoe perseae) que infecta frutos en sus primeros estados fenológicos (Marroquín–Pimentel, 1999; Téliz y Mora, 2007); el anillamiento o pudrición del pedúnculo (Diplodia sp.) provocando caída del fruto en diversos estados de desarrollo (Salvador et al., 1999; Téliz y Mora, 2007); la pudrición por armillaria (Armillaria sp.) que infecta principalmente raíces (Darley y Zentmyer, 1957); y la antracnosis [Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. y Sacc.] (Podila et al., 1993), enfermedad con prevalencia en temporadas lluviosas o con humedad relativa alta (Jeffries et al., 1990). C. gloeosporioides es un patógeno de poscosecha del aguacatero que infecta principalmente frutos pequeños durante su crecimiento en los huertos (Yakoby et al., 2001a). El hongo produce un apresorio que penetra el fruto degradando la cutícula y produciendo una hifa subcutícular latente que no se desarrolla hasta que el fruto madura. Los cambios fisiológicos en el fruto permiten la activación del patógeno quiescente (Beno y Prusky, 2000; Freeman et al., 1995). La antracnosis ocasiona pérdidas sustanciales por decaimiento de frutos durante el almacenaje y comercialización (Freeman et al., 1995) y se manifiesta con la presencia de manchas circulares café oscuras en el pericarpio y daños por ablandamiento y pudrición de la pulpa o mesocarpo (Prusky et al., 2001; Yakoby et al., 2000). La identificación de las especies del género Colletotrichum se basan principalmente en la morfología, el rango y especialización de los hospedantes y en el modo de parasitismo (Wharton y Diéguez, 2004). De esta manera, se han descrito 38 especies, ocho de las cuales poseen un estado sexual (Sutton, 1992). Colletotrichum spp. infecta diversas especies de manera individual o en asociación. Se han identificado infecciones mezcladas de diferentes especies de Colletotrichum en fresa (Fragaria ananassa Duch.) (Ureña et al., 2002; Xiao et al., 2004), en olivo (Olea europaea L.) (Talhinhas et al., 2005), plantas forrajeras (Stylosanthes spp.) (Munaut et al., 2002) y camote (Dioscorea spp.) (Abang et al., 2002). Contrariamente, en aguacatero y almendro (Prunus dulces Mill.) no se ha establecido dicha infección mixta por especies de este género (Freeman et al., 1995, 2000). La antracnosis causada por C. gloeosporioides es una de las enfermedades principales que afecta la calidad del fruto y llega a causar pérdidas cercanas al 20%, por ello, se hace necesario conocer la interacción planta–patógeno en sus aspectos moleculares y bioquímicos que sirvan como punto de partida para plantear investigaciones básicas y aplicadas que provean nuevas perspectivas para el control de la enfermedad.

El agente causal de la antracnosis del aguacatero, C. gloeosporioides (Penz.) Penz. y Sacc. De acuerdo con el Centro Nacional de Información Biotecnológica de los Estados Unidos de América (NCBI, 2007), C. gloeosporioides pertenece al reino Fungi; phylum Ascomycota; clase Sordariomycetes; subclase Sordariomycetes incertae sedis; orden Phyllachorales; familia Phyllachoraceae; género Glomerella; especie Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld y H. Schrenk. (fase teleomórfica, sexual o perfecta) o Colletotrichum gloeosporioides (fase anamórfica, asexual o imperfecta).

Etiología y epidemiología de la antracnosis del aguacatero. C. gloeosporioides es un hongo de distribución cosmopolita y con predominancia en los trópicos y subtrópicos (Xiao et al., 2004). Este hongo muestra un crecimiento lento in vitro (Sreenivasaprasad y Talhinhas, 2005), las colonias presentan coloraciones de gris claro a gris oscuro, sin embargo, en agar avena el micelio es blanco, poco algodonoso y posee masas conidiales de color naranja (Zamora et al., 2001; Ureña et al., 2002); en papa–dextrosa agar, agar agua y agar avena pueden observarse la formación de apresorios (Mercia, 1999). El hongo posee hifas septadas (Roca et al., 2000) y produce apresorios clavados, ovalados, algunas veces lobulados, melanizados de color café (Téliz y Mora, 2007), cuyas dimensiones varían de 4 a 12 μm de longitud (Sutton, 1980). Los conidios son hialinos, variables en tamaño, de forma cilíndrica y obtusos en el ápice, con medidas de 9 a 24 μm de largo y 3 a 4.5 μm de ancho (Cano et al., 2004); en medio de agar simple el 98% son uninucleados, incrementándose en medios líquidos a los binucleados, principalmente (Jeffries et al., 1990). La esporulación de C. gloeosporioides se ve favorecida cuando se cultiva en medio líquido V8 a 25°C bajo agitación constante (Cascino et al., 1990; Slade et al., 1987). El hongo puede infectar entre los 20 y 28°C, pero su temperatura óptima de crecimiento es de 27 ± 1°C (Freeman et al., 1995) en ambientes con humedad relativa de 80 a 100% (Prusky et al., 2001; Talhinhas et al., 2005; Yakoby et al., 2002). El pH óptimo de crecimiento del hongo es de 5.5 a 7 (Drori et al., 2003; Prusky et al., 2001; Villanueva–Arce et al., 2004). La antracnosis se manifiesta en diversas partes del aguacatero (Agrios, 1988); cuando ataca frutos en desarrollo se le conoce como "viruela" y al inicio se observan manchas circulares translúcidas redondas, que posteriormente cambian a café oscuro y pueden ser numerosas; cuando infecta frutos maduros se le conoce como "clavo", mostrando la presencia de lesiones negras hundidas, circulares o irregulares (Zamora et al., 2001) y masas de esporas color rosado (Morales y Ángel, 2007); en las hojas se manifiesta como manchas de color café con un halo clorótico y puede provocar defoliación si la incidencia es alta; en las flores aparece como tizón y provoca la caída o aborto de fruto; en las ramas se observan manchas circulares color café o púrpura que rápidamente se necrosan (Morales y Ángel, 2007; Téliz y Mora, 2007).

Bioquímica y genética molecular de la infección de C. gloeosporioides en aguacatero. Fijación de los conidios en la superficie. Los conidios de C. gloeosporioides se producen dentro de acérvulos, mismos que son la fuente principal de inóculo para el desarrollo y diseminación de la enfermedad (Jeffries et al., 1990; Latunde, 2001), su dispersión puede ser por aire o salpicaduras de lluvia (Téliz y Mora, 2007); al dispersarse los conidios se adhieren al hospedero por medio de una capa mucilaginosa compuesta de polisacáridos y glucoproteínas presente en el acérvulo (Téliz y Mora, 2007), la cual se ha observado en el tubo germinativo y el apresorio de C. gloeosporioides cuando infecta mango (Mangifera indica L.) (Ruiz, 2001). En Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, las manoproteínas son las responsables de la hidrofobicidad en la superficie celular y controlan la adhesión de este patógeno al hospedero (Hazen y Hazen, 1992). Se sugiere que el mecanismo anterior también opera en Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. y Magnus) Lams.–Scrib. (O'Connell et al., 1996) y puede ser extrapolado a C. gloeosporioides. Adicionalmente, Colletotrichum trifolii Bain y Essary contiene enzimas cutinasas y esterasas que le ayudan en la adhesión y penetración del hongo (Dickman et al., 2003). Señalización y germinación de los conidios. Una vez que el conidio de C. gloeosporioides se encuentra en la superficie, éste responde a las ceras epiculares del hospedante y al etileno, coincidiendo con la maduración del fruto; para tal efecto la señal del hospedante es el incremento en la producción de etileno en concentraciones internas cercanas a 0.2 μL L^–1, requiriendo el contacto del conidio con la superficie por un período de 2 h (Kim et al., 1998, 2000b), necesarias para inducir la germinación y formación del apresorio. Ruiz–Herrera en 1993 describió que los procesos morfogenéticos o de diferenciación celular como la germinación de las esporas, pueden dividirse en cuatro etapas generales: Recepción del estímulo, transducción de la señal al núcleo, cambio en la expresión génica y finalmente, cambio en el fenotipo, forma o función, de la célula. Dentro de la transducción de la señal, la vía de las proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPK) constituye una de las rutas de señalización más conservadas en los organismos eucariotes; involucra tres proteínas modificadas por fosforilación (cinasas) que actúan en orden secuencial: La MAPK, MAPK cinasa (MEK) y MEK cinasa (MEKK), las cuales desempeñan una función importante en la detección de señales extracelulares, transduciéndolas al núcleo para controlar la expresión de los genes. En C. gloeosporioides las MAPK actúan en las etapas donde ocurren re–arreglos de actina en el citoesqueleto, tales como la división celular y la germinación, que a su vez son fenómenos asociados con la polaridad y con la diferenciación del tubo germinativo (Kim et al., 2000b; Prusky et al., 2000). En los conidios de C. gloeosporioides el contacto con la superficie induce la acumulación preferencial de F–actina en uno de los núcleos hijos y la formación del septo sirve para completar la división celular posterior a la germinación (Fig. 1). En mutantes afectadas en el gen CgMEK1, que codifica para una MEK, bajo la ausencia de nutrimentos o señales del hospedante, la distribución polarizada de F–actina y los siguientes eventos (formación del septo y división celular, diferenciación de los conidios y formación de apresorio) se ven afectados, indicando que CgMEK1 puede fosforilar a una MEKK involucrada en este proceso. En cambio, en presencia de las señales del hospedante (ceras superficiales y etileno), o la adición de nutrimentos externos (como el extracto de levadura), las mutantes afectadas en el gen CgMEK1 experimentan una división celular normal y la germinación de conidios, pero no la formación del apresorio (Kim et al., 2000a). La calmodulina y calmodulina cinasa (CaM, CaMK, respectivamente) están involucradas en señales tempranas de transducción y probablemente activan la expresión de los genes que estimulan a los conidios para responder a las señales químicas del hospedante (Dayton et al., 1997; Kim et al., 1998; Prusky et al., 2000), ya que el uso de un antagonista de CaM, compuesto 48/80, inhibe tanto la germinación de los conidios como la formación del apresorio en C. trifolii (Liu y Kolattukudy, 1999), sugiriendo que tanto el Ca²+ y la CaM están involucrados en la germinación y los eventos posteriores a ella (Kim et al., 1998). Varios de los genes implicados en la inducción de la germinación se han identificado por despliegue diferencial y se han denominado proteínas de Colletotrichum inducidas por superficie dura (chip). El gen chip1 codifica para una enzima conjugada de ubiquitinación de 147 aminoácidos denominada UBC1cg, misma que se detectó por Northern blot a las 2 h de contacto, y cuyo transcrito disminuye después de 6 h. La proteína UBC1cg probablemente se encuentra involucrada en la reprogramación de la síntesis de las proteínas necesarias para la germinación y la diferenciación del apresorio (Prusky et al., 2000). Formación del apresorio. Como se mencionó, en respuesta al etileno y la capa cerosa de la superficie del aguacate, los conidios al germinar producen un tubo germinativo que se hincha en el ápice para formar una estructura denominada apresorio, el cual se adhiere firmemente a la superficie de la planta. El apresorio maduro es una estructura asimétrica, polarizada, con un domo superior melanizado y una región basal plana que contiene un poro complejo (Latunde–Dada, 2001; O'Connell et al., 1996; Prusky et al., 1996, 2000; Sexton y Howlett, 2006). Al separar cromatográficamente las ceras epiculares, se han identificado fracciones de alcoholes alifáticos de cadena larga (de 30 a 32 carbonos) como inductores de la formación de apresor io. Sin embargo, las ceras de plantas tales como Senecio odoris (Forssk.) Delers y Crassula argentea Thunb, que tienen un contenido alto de alcoholes alifáticos, inhiben la formación del apresorio, desconociéndose al componente responsable de dicho efecto (Podila et al., 1993). Adicionalmente, en experimentos in vitro, las concentraciones menores o iguales a 1.0 μL de etileno L^–1 inducen la formación de apresorios en C. gloeosporioides y C. musae Berk y Curt en aguacate y banano (Musa spp.), respectivamente (Flaishman y Kolattukudy, 1994). Durante la formación del apresorio los conidios de C. gloeosporioides secretan la proteína CAP20 (Cheng et al., 1995); el gen cap20 sólo posee homología con el gen MPG1, involucrado en la formación del apresorio en Magnaporthe grisea [(T.T. Hebert) Yaegashi y Udagawa] Marasas. En C. gloeosporioides, cap20 se expresa únicamente durante la formación del apresorio y no durante la germinación de los conidios; mutantes afectadas en este gen producen la formación de un apresorio no funcional. Sin embargo, aparentemente la formación del apresorio en este hongo, requiere además de la expresión de otros genes tales como cap3, cap5 y cap22 (Hwang et al., 1995). El uso de inhibidores de las proteínas cinasas (MAPK y MEK) y proteínas fosfatasas, sugieren que la fosforilación de éstas proteínas está involucrada en la inducción de la formación del apresorio en C. gloeosporioides (Kim et al., 1998). La formación del apresorio en C. gloeosporioides es consecuencia de la respuesta a las señales químicas del hospedero y contacto con la superficie dura del mismo, mediante la activación de la proteína CgMEK1, la cual a su vez interactúa con la proteína MAPK1 (Kim et al., 2000a). Se sugiere la presencia de otra proteína cinasa con función redundante a CgMEK1, llamada CgMEKx, la cual se propone puede modificar a otra posible cinasa MAPKx (Fig. 1), cuya cascada de fosforilaciones está relacionada con la formación del septo y germinación en C. gloeosporioides. Los nutrimentos aparentemente activan a la proteína CgMEKx pero ésta no activa a MAPK1, que está selectivamente involucrada en la regulación de la formación del apresorio (Kim et al., 2000a). Al utilizar un inhibidor de CaMK (KN93) se afecta la melanización y formación del apresorio, cuando se utiliza un quelante (U73122) a una concentración de 64 nM para los iones de Ca²+, se inhibe completamente la germinación y por consecuencia la formación del apresorio (Kim et al., 1998; Prusky et al., 2000). Penetración del apresorio. La penetración al fruto del aguacate inicia con la aparición de la hifa de penetración a través de un poro que se encuentra en la base del apresorio y se introduce a través de la cutícula de la pared celular de la planta (O'Connell et al., 1996; Yakoby et al., 2002). En C. gloeosporioides se postula que la penetración de la hifa en la cutícula y células epidérmicas del hospedero, involucra la fuerza mecánica a través de la alta presión de turgencia así como la acción enzimática mediante la secreción de "enzimas degradadoras de la pared celular" (CWDE) (Prusky et al., 2000; Wei et al., 2002, 2004). En C. lindemuthianum, la presión de turgencia se genera al incrementarse la concentración molar de glicerol, mismo que es retenido por la célula y es impermeable a la melanina. En algunas especies hemibiotróficas de Colletotrichum, la penetración de las células epidérmicas ocurre mediante una hifa primara larga (LPH) dentro del lúmen de la célula, sin perturbar el plasmalema o al protoplasto del hospedero. La fase asintomática de la antracnosis cursa a partir de las 48 a 72 h después de la inoculación, donde el plasmalema y el tonoplasto de las células infectadas continúan funcionales; en esta fase, la LPH incrementa su volumen de 50 a 200 veces formando una vesícula que indica la adquisición acelerada de fluidos y nutrimentos del hospedero infectado antes de ser necrosado (Latunde–Dada, 2001). En esta fase biotrófica del hongo se sintetiza la glicoproteína CIH1, cuya expresión se reprime cuando se inicia el desarrollo necrotrófico (Hahn y Mendgen, 2001; Mendgen y Hahn, 2002), mientras que el gen CgDN3 expresado durante la fase temprana del crecimiento biotrófico, es indispensable para el desarrollo intracelular del hongo y evadir la respuesta de hipersensibilidad en Stylosanthes guianensis (Aubl.) Sw. (Stephenson et al., 2000). CgDN3 no está directamente implicado en la patogenicidad, pero si lo está en la aparición de lesiones necrotróficas en el hospedante después de la inoculación del hongo mediante punción de la superficie del fruto (Hahn y Mendgen, 2001). Posteriormente la LPH se ramifica originando una hifa delgada secundaria asociada al cambio del crecimiento biotrófico a la infección necrótrofa del hongo (Latunde–Dada, 2001; Wei et al., 2004). Después de 48 h de la penetración inicial en C. lindemuthianum y de 96 h en C. destuctivum O'Hara, C. truncatum (Schwein.) Andrus y W.D. Moore y C. linicola Pethybr. y Laff (Latunde–Dada, 2001) se desarrollan hifas secundarias necrotróficas que degradan las paredes celulares cercanas al sitio de la infección (O'Connell et al., 1996). El cambio a la fase necrotrófica involucra cambios nutrimentales de modo que la habilidad para que el patógeno utilice los constituyentes de la planta, se hace más eficiente mediante la activación de las rutas catabólicas, tal es el caso del gen CLTA1 que codifica para la proteína GAL4, involucrado en el cambio entre la condición biotrófica y la necrotrófica durante el proceso de infección (Dufresne et al., 2000). En C. lindemuthianum se estudiaron los componentes de la superficie de los conidios, el tubo de germinación, el apresorio y la hifa intracelular, utilizando rodamina y fluoresceína conjugada con lectinas para identificar la constitución de los carbohidratos y anticuerpos monoclonales para determinar proteínas y carbohidratos. Al realizar los análisis con las lectinas, los resultados mostraron que la matriz extracelular del tubo de germinación es muy similar a la del apresorio en la composición de carbohidratos y glucoproteínas, ya que están presentes galactosa, manosa y N–acetilglucosamina; sin embargo difiere de la hifa intracelular que no posee galactosa. Con los anticuerpos monoclonales utilizados no se identificaron proteínas en la superficie del conidio, por otro lado se evidenció que la presencia de carbohidratos es mayor con respecto a los otros componentes analizados. El tubo de germinación, el apresorio y la hifa intracelular presentaron cantidades similares de proteínas, sin embargo, las proteínas identificadas en la hifa intracelular son diferentes de las detectadas en el tubo de germinación y el apresorio. Finalmente, la hifa intracelular es la estructura que presenta la menor cantidad de carbohidratos. Las características propias de la hifa intracelular sugieren cierta especialización del hongo durante la fase biotrófica (O'Connell et al., 1996). Las fuentes de nitrógeno necesarias para el crecimiento inicial del patógeno probablemente resultan de la actividad de las proteasas del hongo que rompen las estructuras de las glicoproteínas de la pared celular vegetal (Drori et al., 2003); las CWDE en C. gloeosporioides son la poligalacturonasa (PG), pectina liasa, pectin metil–esterasa y la pectato liasa (PL) (Drori et al., 2003; Prusky et al., 2001). El cambio gradual del pH (5.0 a 5.8) en el área de infección provoca la secreción de PG (Yakoby et al., 2000), mientras que la secreción de PL requiere un pH superior a 6.0, la cual está determinada por la transcripción del gen pelB, que responde a cambios de pH en el hospedante (Drori et al., 2003; Wattad et al., 1994), así como la expresión del gen pac1 [homólogo al gen pacC en Aspergillus nidulans (Eidam) G. Wint.]; pac1 participa en rutas de señalización y en la regulación de la transcripción de genes dependientes del pH. Los dominios de "dedos de zinc" y la función central que desempeña en la vía dependiente de pH, convierten al homólogo de pacC de C. gloeosporioides en el primer candidato para participar activamente en la regulación del proceso de secreción enzimática en este hongo. La patogenicidad de C. gloeosporioides depende de su habilidad para secretar PL y no para expresar pelB (Prusky et al., 2001). Cuando el amonio se acumula, el pH aumenta, por consiguiente la virulencia de C. gloeosporioides se ve incrementada (Prusky et al., 2001). De los genes implicados en la inducción de la germinación que se identificaron por despliegue diferencial, CHIP2 es un gen que codifica para una proteína de probable unión al DNA y de localización nuclear, mientras que el producto génico de CHIP3 contiene nueve dominios transmembranales. La interrupción de ambos genes en C. gloeosporioides no muestran diferencias morfológicas y patogénicas en aguacate en comparación con cepas silvestres, por tanto, las proteínas CHIP2 y CHIP3 no son esenciales para la patogenicidad como se había planteado y se sugieren dos posibilidades, una de ellas es que son genes con función "redundante" y otra es que son proteínas implicadas en otros procesos celulares (Kim et al., 2000b). Mecanismo de defensa del aguacate. La mayoría de la resistencia a patógenos poscosecha en frutas y vegetales puede describirse como una "incompatibilidad dinámica" (Prusky et al., 2000; Wharton y Diéguez, 2004). La respuesta del hospedante hacia el patógeno para activar sus genes de avirulencia, previene o retarda el crecimiento del patógeno bajo condiciones fisiológicas específicas (Wharton y Diéguez, 2004). El estado fisiológico en el hospedero varía por diversos factores, entre ellos la maduración, el almacenaje, el daño mecánico, las temperaturas extremas y la anoxia. Cuando los cambios fisiológicos en el hospedero inhiben sus propios mecanismos de defensa en respuesta a las actividades del patógeno, la interacción patógeno–hospedante es compatible. La resistencia del fruto inmaduro de aguacate al ataque de Colletroctrichum se ha asociado con la presencia de compuestos preformados en la cáscara o pericarpio (Podila et al., 1993). Con frecuencia este hongo infecta frutos inmaduros y permanece latente hasta que disminuyen las concentraciones de compuestos antifúngicos a niveles no tóxicos, lo que en aguacate coincide con la maduración del fruto (Beno y Prusky, 2000; Wharton y Diéguez, 2004; Yakoby et al., 2001b). El pericarpio del aguacate contiene monoenos (1–acetoxi–2,4–dihidroxi–n–heptadeca–16–eno) y dienos y (1–acetoxi–2–hidroxi–4–oxo–heneicosa–12,16–dieno). Los niveles de estos compuestos disminuyen durante la maduración del fruto y esto permite la susceptibilidad al ataque de hongos (Morrissey y Osbourn, 1999). Se han sugerido cuatro factores que proporcionan resistencia al fruto inmaduro de aguacate al ataque de hongos: Escasez de los nutrimentos requeridos por el patógeno, compuestos antifúngicos preformados, compuestos antifúngicos inducidos y la ausencia de activación que proporcionan los factores de patogenicidad del hongo (Yakoby et al., 2001a,b; 2002). El incremento en la concentración del dieno es paralelo a la activación transcripcional de los genes involucrados en la biosíntesis de la epicatequina. Este efecto no ocurre durante la maduración del fruto (Beno y Prusky, 2000). Los niveles de dieno dependen de la síntesis y el metabolismo de varios compuestos, incluyendo la activación de las enzimas 9 desaturasa, 12 desaturasa y el ácido graso elongasa. La activación transcripcional de genes codificantes de proteínas de la síntesis de epicatequina en la ruta fenilpropanoide, tales como la fenilalanina amonio liasa (PAL), causa el incremento en la síntesis del dieno y la correspondiente resistencia del fruto a la antracnosis (Yakoby et al., 2002). Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se incrementan significativamente en el fruto de aguacate con la inoculación de co nidios de C. gloeosporioides. Lo anterior sugiere que la infección quiescente ocurre por la producción local de ROS con lo que se activa la ruta fenilpropanoide, y subsecuentemente se incrementan los niveles del dieno antifúngico que inhiben el ataque del hongo (Yakoby et al., 2002). En el pericarpio del aguacate, de manera similar a otros órganos de la planta, se reconoce a los patógenos o los elicitores de la pared celular en etapas tempranas del proceso de infección, mediante la generación rápida de ROS. La síntesis de ROS ocurre en la superficie extracelular de la membrana plasmática por la reducción de un electrón del oxígeno molecular. La transferencia de electrones del donador citosólico (NADPH oxidasa) al aceptor en la superficie extracelular de la membrana plasmática conduce a la acidificación del citosol, la alcalinización del medio extracelular y la disminución del potencial de la membrana plasmática (Beno y Prusky, 2000; Yakoby et al., 2002). Estos cambios inducidos por la antracnosis provocan diversos eventos celulares tempranos que incluyen la depolarización de la membrana y cambios en su permeabilidad en la misma para los iones de Ca+², protones, iones de Cl^–1 y K+¹, contribuyendo en la transducción y amplificación de las señales de la ruta fenilpropanoide. De esta forma se regulan los niveles de dieno antifúngico y se inhibe el desarrollo del hongo, produciendo su latencia (Flaishman y Kolattukudy, 1994). Sin embargo, los inhibores de proteínas cinasas y fosfatasas, reducen significativamente la producción de ROS en cultivos celulares de aguacate inducidos con paredes celulares de Colletotrichum. Entonces se puede deducir que diferentes procesos de fosforilación y defosforilación pueden regular positivamente la inducción de ROS en tejidos de aguacate (Beno y Prusky, 2000).

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

El incremento mundial de la población y la disminución de superficie de suelo cultivable, obliga a un mejor aprovechamiento de los recursos genéticos disponibles haciendo indispensable la protección de los cultivos a enfermedades, por consecuencia una mejora sustancial a la producción agrícola. El uso de fungicidas para el control de enfermedades ha mostrado ser exitoso por un tiempo, pero su uso continuo provoca severos daños a la salud y al ambiente. C. gloeosporioides causa pérdidas económicas considerables en el cultivo del aguacatero, por lo que resulta indispensable conocer la biología y la genética del patógeno, así como la interacción en el patosistema hongo–hospedante. Como sucede con otros hongos utilizados como modelo de estudio para el análisis de la patogénesis, en C. gloeosporioides falta conocer con precisión los mecanismos que operan durante las diferentes etapas del proceso infectivo, particularmente en aguacate. Las evidencias mostradas indican que es necesario indagar aún más sobre aspectos bioquímicos y moleculares para un mayor entendimiento del proceso en estudio. Conforme se ha desarrollado el estudio de la patogénesis en hongos, se ha evidenciado que los actores y el escenario en el cual se lleva a cabo no son muy diversos, esto puede deberse a que el grado de conservación es considerable en este grupo de organismos eucariotes, y gracias a ello, los estudios realizados en especies diferentes de un mismo género, de una misma clase (ascomicetos, basidiomicetos, etc.), o en aquellos organismos que presentan una manera de vida similar, nos proveen de información para tener un acercamiento, para tratar de inferir y entender lo que ocurre en el modelo de estudio seleccionado; sin embargo, no se puede pasar inadvertido que como individuos que son, incluso a nivel de especie, los hongos también poseen características que los hacen únicos y pueden tener actores protagónicos específicos en el complejo proceso de la patogénesis. Tomando en cuenta lo anterior, existen diferentes estrategias para aumentar el conocimiento en esta área, desde verificar si los genes o proteínas evidenciados en otros hongos por su participación en alguna de las diferentes etapas generales de la patogénesis, como la recepción del estímulo, las vías de transducción de señales y los cambios en la expresión génica, están presentes y poseen la misma función en C. gloeosporioides, hasta el establecimiento de técnicas para la búsqueda de participantes anónimos en dicho proceso. El hecho de que C. gloeosporioides posea un sistema de transformación genética, hace factible el estudio de cualquier gen mediante la elaboración de mutantes nulas, y así poder comprobar su participación, o la de una vía de transducción de señales, en un proceso celular dado. Aunado a lo anterior, se pueden implementar métodos de análisis global para determinar los perfiles de expresión génica en el patógeno o su interacción con el hospedero utilizando condiciones contrastantes de patogénesis, estos métodos pueden ser el despliegue diferencial, la creación de bibliotecas sustractivas, entre otras. En este mismo sentido, y acorde a la actualidad, es imperante la aplicación de estrategias genómicas como la secuenciación y anotación del genoma de C. gloeosporioides y su comparación con otros genomas fúngicos ya conocidos, para poder establecer el nivel de sintenia entre ellos, además de los análisis de expresión del genoma como los microarreglos, la proteómica y la metabolómica, con la finalidad de determinar la presencia de genes ortólogos, o específicos del hongo, que estén involucrados en patogénesis, mediante el empleo de herramientas bioinformáticas y la genómica comparativa. El uso de técnicas basadas en marcadores moleculares pueden indicar el impacto de la diversidad biogeográfica con base en la distribución de las poblaciones del patógeno, o posibles variantes alélicas asociadas directamente a la patogenicidad y agresividad específicos para C. gloeosporioides, como en el caso del locus OPC–5 identificado por medio de RAPD en fresa (Xiao et al., 2004), así como la posibilidad de la identificación y uso de nuevas variedades de aguacatero con resistencia genética a patógenos, puesto que C. gloeosporioides ha demostrado ser capaz de adaptarse a nuevos hospedantes (Latunde–Dada, 2001; Mercia, 1999).

AGRADECIMIENTOS

E.S. Rodríguez–López agradece el apoyo económico del CONACYT y del Instituto Politécnico Nacional para la realización de sus estudios de maestría en el Centro de Biotecnología Genómica. J.M. González–Prieto y N. Mayek–Pérez son becarios del SNI y EDI y COFAA–IPN.

LITERATURA CITADA

Abang, M.M., Winter, S., Green, K.R., Hoffmann, P., Mignouna, H.D., and Wolf, G.A. 2002. Molecular identification of Colletotrichum gloeosporioides causing yam anthracnose in Nigeria. Plant Pathology 51:63–71.         [ Links ]

Agrios, G.N. 1988. Plant Pathology. Third Edition. Academic Press, Inc. San Diego, California, USA. 803 p.         [ Links ]

Beno, D.B., and Prusky, D. 2000. Early events during quiescent infection development by Colletotrichum gloeosporioides in unripe avocado fruits. Phytopathology 90:553–559.         [ Links ]

Cascino, J.J., Harris, R.F., Smith, C.S., and Andrews, J.H. 1990. Spore yield and microcycle conidiation of Colletotrichum gloeosporioides in liquid culture. Applied and Environmental Microbiology 56:2303–2310.         [ Links ]

Cano, J., Guarro, J., and Gené, J. 2004. Molecular and morphological identification of Colletotrichum species of clinical interest. Journal of Clinical Microbiology 42:2450–2454.         [ Links ]

Cheng, H., Flaishman, M., and Kolattukudy, P. 1995. Cloning of a gene expressed during appressorium formation by Colletotrichum gloeosporioides and a marked decrease in virulence by disruption of this gene. The Plant Cell 7:183–193.         [ Links ]

Crane, J., Belerdi, C., and Maguire, I. 2005. Avocado growing in the Florida Home landscape. Institute of Food and Agricultural Sciences. University of Florida. Homestead, Florida, USA. 16 p.         [ Links ]

Darley, E.F., and Zentmyer, G.A. 1957. Oak root fungus in avocados. California Avocado Society 41:80–81.         [ Links ]

Dayton, J., Sumi, M., Nanthakumar, N., and Means, A. 1997 Expression of a constitutively active Ca²⁺/Calmodulin–dependent kinase in Aspergillus nidulans spores prevents germination and entry into the cell cycle. The Journal of Biological Chemistry 272:3223–3230.         [ Links ]

Dickman, M.B., Ha, Y.S., Adams, B., and Huang, C. 2003. A protein kinase from Colletotrichum trifolii is induced by plant cutin and is required for appressorium formation. Molecular Plant–Microbe Interactions 16:411–421.         [ Links ]

Drori, N., Kramer, H., Haimovch, Rollins, J., Dinoor, A., Ocoton Y., Pines, O., and Prusky, D. 2003. External pH and nitrogen source affect secretion of pectate lyase by Colletotrichum gloeosporioides. Applied and Enviromental Microbiology 69:3258–3262.         [ Links ]

Dufresne, M., Perfect, S., Pellier, A.L., Bailey, J.A., and Langin, T. 2000. A GAL4–like protein is involved in the switch between biotrophic and necrotrophic phases of the infection process of Colletotrichum lindemuthianum on common bean. The Plant Cell 12:1579–1589.         [ Links ]

Flaishman, M., and Kolattukudy, P. 1994. Timing of fungal invasion using host's ripening hormone as a signal. Plant Biology 91:6579–6583.         [ Links ]

Freeman, S., Katan, T., and Shabi, E. 1995. Characterization of Colletotrichum gloeosporioides isolates from avocado and almond fruits with molecular and pathogenicity test. Applied and Enviromental Microbiology 62:1014–1020.         [ Links ]

Freeman, S., Minz, D., Jurkevitch, E., Maymon, M., and Shabi, E. 2000. Molecular analyses of Colletotrichum species from almond and other fruits. Biochemistry and Cell Biology 90:608–614.         [ Links ]

Gabor, B.K., Guillement, F.B., and Coffey, M.D. 1990. Comparison of field resistance to Phytophthora cinnamomi in twelve avocado rootstocks. Hortscience 25:1655–1659.         [ Links ]

Hahn, M., and Mendgen, K. 2001. Signal and nutrient exchange at biotrophic plant–fungus interfaces. Plant Biology 4:322–327.         [ Links ]

Hazen, K.C., and Hazen, B.W. 1992. Hydrophobic surface protein masking by the opportunistic fungal pathogen Candida albicans. Infection and Immunity 60:1499–1508.         [ Links ]

Hwang, C.S., Flaishman, M.A., and Kolattukudy, P.E. 1995. Cloning of a gene expressed during appressorium formation by Colletotrichum gloeosporioides and a marked decrease in virulence by disrution of this gene. The Plant Cell 7:183–193.         [ Links ]

Jeffries, P., Dodd, J.C., Jeger, M.J., and Plumbley, R.A. 1990. The biology and control of Colletotrichum species on tropical fruit crops. Plant Pathology 39:343–366.         [ Links ]

Kim, Y.K., Kawano, T., Li, D., and Kolattukudy, P.E. 1998. Induction of Ca²⁺–Calmodulin signaling by hard–surface contact primes Colletotrichum gloeosporioides conidia to germinate and form appresoria. Journal of Bacteriology 180:5144–5150.         [ Links ]

Kim, Y.K., Kawano, T., Li, D., and Kolattukudy, P.E. 2000a. Mitogen–activated protein kinase required for induction of cytokinesis and appressorium formation by host signals in the conidia of Colletotrichum gloeosporioides. The Plant Cell 12:1331–1343.         [ Links ]

Kim, Y.K., Kawano, T., Li, D., and Kolattukudy, P.E. 2000b. Two novel genes induced by hard–surface contact of Colletotrichum gloeosporioides conidia. Journal of Bacteriology 182:4688–4695.         [ Links ]

Latunde–Dada, A.O. 2001. Colletotrichum: tales of forcible entry, stealth, transient confinement and breakout. Molecular Plant Pathology 4:187–198.         [ Links ]

Liu, M., and Kolattukudy, P., 1999. Early Expression of the Calmodulin gene, which precedes appressorium formation in Magnaporthe grisea, is inhibited by self–inhibitors and requires surface attachment. Journal of Bacteriology 181:3571–3577.         [ Links ]

Marroquín–Pimentel, F.J. 1999. Factores que favorecen la incidencia de roña (Sphaceloma perseae Jenk.) en el cultivo de aguacate (Persea americana Mill.) "Hass" en tres regiones agroclimáticas de Michoacán, México. Revista Chapingo serie Horticultura 5:309–312.         [ Links ]

Mendgen, K., and Hahn, M. 2002. Plant infection and the establishment of fungal biotrophy. Trends in Plant Science 7:352–356.         [ Links ]

Mercia, S.G. 1999. Comparative study of Colletrotichum gloeosporioides from avocado and mango. Tesis de Doctorado. Universidad de Pretoria. Pretoria, Sudáfrica. 200 p.         [ Links ]

Morales, G.J.L. y Ángel, P.M. E. 2007. Hongos Fitopatógenos de Importancia Agrícola. Editorial Facultad de Agrobiología "Presidente Juárez" de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Uruapan, Michoacán, México. 265 p.         [ Links ]

Morrissey, J.P., and Osbourn, A.E. 1999. Fungal resistance to plant antibiotics as a mechanism of pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63:708–724.         [ Links ]

Munaut, F., Hamaide, N., and Maraite, H. 2002. Genomic and pathogenic diversity in Colletotrichum gloeosporioides from wild native Mexican Stylosanthes spp., and taxonomic implications. Mycological Research 106:579–593.         [ Links ]

National Center for Biotechnology Information (NCBI). 2007. Colletotrichum gloeosporioides, TaxBrowser. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Fecha de consulta: Marzo 4, 2007.         [ Links ]

O'Connell, R.J., Pain, N.A., Hutchison, K.A., Jones, G.L., and Green, J.R. 1996. Ultrastucture and composition of the cell surfaces of infection structures formed by the fungal plant pathogen Colletotrichum lindemuthianum. Journal of Microscopy 181:204–212.         [ Links ]

Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO). FAOSTAT–Agriculture. 2008. Disponible en: http://faostat.fao.org/site/567/default.aspx#ancor. Fecha de consulta: diciembre 4, 2008.         [ Links ]

Podila, G.K., Rogers, L.M., and Kolatukudy, P.E. 1993. Chemical signal from avocado surface wax trigger germination and appresorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology 103:267–272.         [ Links ]

Prusky, D., Wattad, C., and Kobiler, I. 1996. Effect of ethylene on activation of lesion development from quiescent infections of Colletotrichum gloeosporioides in avocado fruits. Molecular Plant–Microbe Interactions 9:864–868.         [ Links ]

Prusky, D., Freeman, S., and Dickman, M. 2000. Colletotrichum. Host Specificity, Pathology, and Host–Pathogen Interaction. APS Press. St. Paul, Minnesota, USA. 393 p.         [ Links ]

Prusky, D., McEvoy, J., Leverentz, R., and Conway, W. 2001. Local modulation of host pH by Colletotrichum species as a mechanism to increase virulence. Phytopathology 9:1105–1113.         [ Links ]

Roca, M.M.G., Ongarelli, M.G., Davide, L.C., and Mendes, C.M.C. 2000. Ultrastructural aspects in perithecia hyphae septal pores of Glomerella cingulata f. sp. phaseoli. Brazilian Journal of Microbiology 31:223–225.         [ Links ]

Ruiz–Herrera, J. 1993. Dimorphism in Mucor species. pp. 257-265. In: B.H. Vanden, F.C. Odds, and D. Kerridge (eds.). Dimorphic Fungi in Biology and Medicine. Springer. New York, USA. 440 p.         [ Links ]

Ruiz, P.E. 2001. Histopatología de frutos de mango (Mangifera indica L.) cv. Haden infectados por Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. y Sacc. Tesis de Maestría. Colegio de Posgraduados. Montecillo, Edo. de México. 78 p.         [ Links ]

Salvador, L., Miranda, S.P., Aragón, N. y Lara, V. 1999. Recubrimiento de quitosán en aguacate. Revista de la Sociedad Química de México 43:18–23.         [ Links ]

Slade, S.J., Harris, R.F., Smith, C.S., Andrews, J.H., and Nordheim, E.V. 1987. Microplate assay for Colletotrichum spore production. Applied and Environmental Microbiology 53:627–632.         [ Links ]

Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA). Reportes Agrícolas de Aguacate. 2007. Disponible en: http://reporte.siap.gob.mx/Agricola_siap/ResumenProducto.do. Fecha de consulta: diciembre 14 de 2008.         [ Links ]

Sreenivasaprasad, S., and Talhinhas, P. 2005. Genotypic and phenotypic diversity in Colletotrichum acutatum, a cosmopolitan pathogen causing anthracnose on a wide range of host. Molecular Plant Pathology 6:361–378.         [ Links ]

Sexton, A.C., and Howlett, B.J. 2006. Parallels in fungal patogenesis on plant and animal host. Eukaryotic Cell 5:1941–1949.         [ Links ]

Stephenson, S.A., Hatfield, J., Maclean, D.J., and Manners, J. 2000. CgDN3: An essential pathogenicity gene of Colletotrichum gloeosporioides necessary to avert a hypersensitive–like response in the host Stylosanthes guianensis. Plant Pathology 13:929–941.         [ Links ]

Sutton, B.C. 1980. The coleomycetes: the fungi imperfecti with pycnidia, acervuli and estromata. Commonwealth Mycological Institute. Kew Surrey, England. 661 p.         [ Links ]

Sutton, B.C. 1992. The genus Glomerella and its anamorph Colletotrichum. pp. 1–26. In: J. A. Bailey, and M.J. Jeger (eds.). Colletotrichum, Biology, Pathology and Control. CAB International. Wallinford, Connecticut, USA. 402 p.         [ Links ]

Talhinhas, P., Sreenivasaprasad, S., Neves, J., and Oliveira, H. 2005. Molecular and phenotypic analyses reveal association of diverse Colletotrichum acutatum groups and a low level of C. gloeosporioides with olive anthracnose. Applied and Enviromental Microbiology 71:2987–2998.         [ Links ]

Téliz, D. y Mora, A. 2007. El Aguacate y su Manejo Integrado. Segunda Edición. Grupo Mundi–Prensa. México, D.F. 321 p.         [ Links ]

Ureña, P.A.R., MacKenzie, S.J., Bowen, B.W., and Legard, D.E. 2002. Etiology and population genetics of Colletotrichum spp. causing crown and fruit rot of strawberry. Phytopathology 92:1245–1252.         [ Links ]

Villanueva–Arce, R., Cárdenas–Soriano, E., Hernández–Anguiano, M. y Téliz–Ortíz, D. 2004. Patogénesis de la antracnosis (Colletotrichum fragariae) en frutos de chirimoya. Agrociencia 40:773–782.         [ Links ]

Wattad, D., Dinoor, A., and Prusky, D. 1994. Purification of pectate lyase produced by Colletotrichum gloeosporioides and its inhibition by epicatechin: a possible factor involved in the resistance of unripe avocado fruits to anthracnose. Molecular Plant–Microbe Interactions 7:293–297.         [ Links ]

Wharton, P., and Diéguez, J. 2004. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid 61:3–22.         [ Links ]

Wei, Y., Shih, J., Li, J., and Goodwin, P. 2002. Two pectin lyase genes, phl–1 and pnl–2, from Colletotrichum gloeosporioides f. sp. malvae differ in a cellulose–binding domain and in their expression during infection of Malva pusilla. Microbiology 148:2149–2157.         [ Links ]

Wei, Y., Shen, W., Dauk, M., Wang, F., Selvaraj, G., and Zou, J. 2004. Targeted gene disruption of glycerol–3–phosphate dehydrogenase in Colletotrichum gloeosporioides reveals evidence that glycerol is a significant transferred nutrient from host plant to fungal pathogen. The Journal of Biological Chemistry 279:429–435.         [ Links ]

Xiao, C.L., MacKenzie, S.J., and Legard, D.E. 2004. Genetic and pathogenic analyses of Colletotrichum gloeosporioides isolates from strawberry and noncultivated host. Phytopathology 94:446–453.         [ Links ]

Yakoby, N., Kobiler, I., Dinoor, A., and Prusky, D. 2000. pH regulation of pectate lyase secretion modulates the attack of Colletotrichum gloeosporioides on avocado fruits. Applied and Enviromental Microbiology 66:1026–1030.         [ Links ]

Yakoby, N., Zhou, R., Kobiler, I., Dinoor, A., and Prusky, D. 2001a. Development of Colletotrichum gloeosporioides restriction enzyme–mediated integration mutant as biocontrol agents against anthracnose disease in avocado fruits. Phytopathology 91:143–148.         [ Links ]

Yakoby, N., Beno, D., Keen, N., Dinoor, A., Pines, A., and Prusky, D. 2001b. Colletotrichum gloeosporioides pelB is an important virulence factor in avocado fruit–fungus interaction. Molecular Plant–Microbe Interactions 14:988–995.         [ Links ]

Yakoby, N., Beno, D., Kobiler, I., and Prusky, D. 2002. The analysis of fruit protection mechanism provided by reduced–pathogenicity mutants of Colletotrichum gloeosporioides obtained by restriction enzyme mediated integration. Phytopathology 92:1196–1201.         [ Links ]

Zamora, M.T., Cárdenas, S.E., Cajuste, B.J.F. y Colinas, L.M.T. 2001. Anatomía del daño por rozamiento y por Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. y Sacc. en frutos de aguacate "Hass". Agrociencia 35:237–244.         [ Links ]