Biocontrol in vitro con Trichoderma spp. de Fusarium subglutinans (Wollenweb. y Reinking) Nelson, Toussoun y Marasas y F. oxysporum Schlecht., Agentes Causales de la "Escoba de Bruja" del Mango (Mangifera indica L.)

In vitro biocontrol of Fusarium subglutinans (Wollenweb. and Reinking) Nelson, Toussoun and Marasas and F. oxysporum Schlecht., causal agents of "Witches' broom" of mango (Mangifera indica L.) by Trichoderma ssp.

Alejandro Casimiro Michel–Aceves¹, Marco Antonio Otero–Sánchez¹, Leticia Yuridia Solano–Pascacio¹, Rafael Ariza–Flores², Aristeo Barrios–Ayala², y Andrés Rebolledo–Martínez³.

¹ Centro de Estudios Profesionales del Colegio Superior Agropecuario del Estado de Guerrero, Av. Vicente Guerrero No. 81, Col. Centro, Iguala, Guerrero, México CP 40000. Correspondencia: amichelaceves@yahoo.com.mx

² INIFAP, Campo Experimental Chilpancingo, Av. Ruffo Figueroa s/n, Col. Burócratas, Chilpancingo, Guerrero, México CP 39090.

Recibido: Octubre 17, 2008
Aceptado: Diciembre 8, 2008

Resumen

Se evaluó el efecto antagónico in vitro de cepas nativas de Trichoderma spp. sobre Fusarium subglutinans (Fs) y Fusarium oxysporum (Fo), agentes causales de la "escoba de bruja" del mango. Se aislaron 10 cepas del hongo antagonista, de las cuales se seleccionó e identificó a una a nivel de especie (T. harzianum), la cual presentó los mayores porcentajes de antagonismo contra ambos fitopatógenos, al inhibir el crecimiento micelial en 62.9% de Fo y 42.0% de Fs. En cultivos duales entre Fo y/o Fs con las cepas seleccionadas de Trichoderma, el tiempo al primer contacto para Fo fue entre 3 y 4 días, mientras que para Fs entre 2 y 3. La mayor zona de intersección (0.87 cm) se presentó en T. lignorum contra Fo, mientras que en Fs la cepa nativa Thzn–2 presentó 0.85 cm. La cepas nativas Thzn–2 y Thzcf–12 y la comecial mostraron antagonismo clase 2, logrando detener el crecimiento de ambos fitopatógenos. La cepa Thzn–2 tiene potencial como alternativa biológica para el control de Fo y Fs; sin embargo, se requiere evaluarla bajo condiciones de campo.

Palabras clave: Trichoderma harzianum, T. lignorum, antagonismo, inhibición.

Abstract. The antagonistic effect of native strains of Trichoderma spp. was evaluated in vitro against Fusarium oxysporum (Fo) and Fusarium subglutinans (Fs), causal agents of mango "witches' broom". Ten strains of the antagonistic fungus were isolated, one of which was selected and identified to the species level (T. harzianum); this species showed the highest percentage of antagonism inhibiting mycelial growth of Fo by 62.9% and 42.0% of Fs. In dual cultures between Fo and/or Fs with the selected strains of Trichoderma, the time for the first contact for Fo was between 3 and 4 days, and between 2 and 3 for Fs. The greatest intersection area (0.87 cm) was observed in T. lignorum against Fo, while the intersection area in Fs with the native strain Thzn–2 was 0.85 cm. Native strains Thzn–2 and Thzcf–12, and the commercial one showed antagonism class 2, being able to stop growth of both plant pathogens. Strain Thzn–2 is promising as an alternative for biocontrol of Fo and Fs; however, it is necessary to evaluate it under field conditions.

La producción de mango (Mangifera indica L.) en México enfrenta una serie de limitantes en su cadena productiva, entre los que destacan: altos costos de producción, deficiencias en la comercialización y el manejo de postcosecha, incidencia de plagas, enfermedades y períodos cortos de cosecha, entre otros; lo que trae como consecuencia bajos rendimientos por unidad de superficie y en general una baja rentabilidad. De las diferentes enfermedades que disminuyen la producción y la calidad del fruto, entre las más importantes destaca la "escoba de bruja" que se encuentra distribuida en todos los estados productores de la República Mexicana y puede reducir el 60% o más del rendimiento (Chávez–Contreras et al., 2001). La mayor severidad de la enfermedad se ha detectado a alturas comprendidas entre los 200 y 750 msnm (Mora, 2000); en casos de infecciones severas, el daño puede considerarse del 100%, debido a que los árboles no producen fruta o es abortada prematuramente. El Estado de Guerrero ocupa el tercer lugar a nivel nacional en la producción de mango, siendo las regiones productoras: Costa grande, Costa chica, Tierra caliente y Norte; ésta última es una de las regiones más afectadas por la enfermedad, donde es de mayor importancia económica, principalmente en los municipios de Iguala, Tuxpan, Huitzuco, Tonalapa del Río y Tepecoacuilco. Los cultivares Haden y Criollo son los más susceptibles y se alcanzan pérdidas mayores al 60% de la producción (Noriega–Cantú et al., 1999). Entre las causas de la enfermedad se han considerado virus, ácaros, desbalances fisiológicos y hongos; sin embargo, las investigaciones señalan consistentemente a los hongos Fusarium subglutinans (Wonllenweb. y Reinking) Nelson, Toussoun y Marasas comb. Nov. (Freeman et al., 1999; 2000; Ploetz, 1994; Ploetz y Gregory, 1993) y Fusarium oxysporum Schlecht. (Bhatnagar y Beniwal, 1977) como agentes causales de la enfermedad. Asimismo, se ha encontrado que el ácaro de las yemas de mango Aceria mangiferae Sayed transporta a las esporas sobre su cuerpo y favorece la penetración del hongo (Gamlies et al., 2007). No existe ningún método eficiente que por sí solo disminuya significativamente la enfermedad; se han realizado grandes esfuerzos por controlarla y actualmente se realiza un manejo integrado en el que se incluyen la poda fitosanitaria, fertilización al suelo, aspersiones de fungicidas, acaricidas, reguladores de crecimiento y otros compuestos químicos (Kumar et al., 1993). Éstos últimos son utilizados con mayor frecuencia; sin embargo, su uso indiscriminado provoca problemas de contaminación ambiental y en general desequilibrio ecológico, situación que puede ocasionar muchas desventajas para los seres vivos. Aún falta integrar un método biológico para el control de la enfermedad, de esta manera el abuso de los productos químicos disminuiría y el control sería más eficiente (Michel–Aceves et al., 2001). El control biológico (CB) se presenta como una alternativa eficaz, económica y libre de riesgo frente a los numerosos y crecientes problemas derivados del uso indiscriminado de agroquímicos. En el CB de enfermedades se utilizan microorganismos antagonistas en el sitio de infección (Agrios, 2002), antes o después de que se presenten los fitopatógenos que interfieren en su supervivencia. Se busca además del control, lograr la seguridad alimentaria de adquirir alimentos libres de tóxicos y llevar una vida sana. Para esto, es necesario conocer a los organismos benéficos, aprender de sus hábitos e identificar la función que tienen para regular las poblaciones dañinas y reducir así el uso de plaguicidas. Lo anterior obliga a realizar esfuerzos para desarrollar cada vez más productos a base de organismos antagonistas, que actúan contra patógenos de enfermedades foliares. Es en este sentido, se han obtenido resultados satisfactorios de control biológico de fitopatógenos con especies del género Trichoderma spp. en un rango amplio de enfermedades del follaje, aún siendo éstas explosivas (Nelson, 1991), porque tiene una gran capacidad de parasitar, competir por nutrientes o producir compuestos que resultan antagónicos para una gran variedad de hongos fitopatógenos de los géneros Rhizoctonia spp., Fusarium spp., Pythium spp., entre muchos otros. El uso de Trichoderma como agente de biocontrol representa una alternativa viable, dadas las características de ser eficaz contra fitopatógenos foliares y del suelo en algunos cultivos. Asimismo, se requiere detectar la presencia y diversidad de cepas nativas, con el propósito de evaluarlas como agentes potenciales de control biológico (Papavizas, 1985). Existen reportes de cepas nativas de Trichoderma eficientes en el control in vitro de las dos especies de Fusarium asociadas con la "escoba de bruja" del mango (Michel–Aceves et al., 2001; 2005a). Sin embargo, actualmente no se tiene información en la región Norte del Estado de Guerrero del efecto que puedan ejercer cepas nativas sobre los hongos fitopatógenos, por lo que es necesario generar información básica que proporcione elementos para incorporar al CB en un programa de manejo de la enfermedad. Con base en lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la eficiencia antagónica de cepas nativas de Trichoderma spp. para controlar in vitro a los hongos causantes de la "escoba de bruja" del mango.

MATERIALES Y MÉTODOS

Localización del área de trabajo. Los bioensayos se realizaron en el Laboratorio de Fitopatología del Centro de Estudios Profesionales (CEP–CSAEGRO), ubicado en el km 14.5 de la Carr. Iguala–Cocula, coordenadas 18° 15' 16" Latitud Norte y 99° 39''46" Longitud Oeste, a una altura de 640 msnm. El clima predominante para esta zona, de acuerdo a la clasificación de Kõpen modificado por García (1998), corresponde a Awo (w) (y) g, al más seco de los cálidos subhúmedo con lluvias en verano, con una temperatura media anual de 26.4°C y una precipitación promedio anual de 767 mm.

Muestreo. Para obtener las diferentes cepas nativas de Trichoderma spp. se colectó una muestra de suelo representativa de una huerta de mango en Tuxpan, Guerrero, ubicada geográficamente entre los paralelos 18° 13' y 18° 27' Latitud Norte y entre los 99° 29' y 99° 42' Longitud Oeste; a una altura de 731 msnm, el clima es cálido seco con lluvias torrenciales, con una temperatura media anual de 37°C de abril a septiembre y temperatura promedio fría de 23°C y una precipitación promedio de 960 mm. Se consideraron a los árboles de mango que presentaban los síntomas típicos de la enfermedad "escoba de bruja", y se colectaron 5 submuestras de alrededor 1 kg de suelo bajo los lineamientos del método cinco de oros (en las cuatro orillas y el centro de la parcela), las cuales se mezclaron y se homogenizaron, tomándose 1 kg como muestra representativa del lugar; se muestreó en los primeros 20 cm de profundidad eliminando la materia orgánica superficial en la zona de goteo del árbol.

Aislamiento de cepas nativas de Trichoderma spp. En el laboratorio, los aislamientos de Trichoderma spp. se realizaron por el método de dilución en placa, pesando 1 g del suelo colectado y colocándolo en un tubo de ensaye con 10 mL de agua destilada esterilizada, el cual se agitó manualmente durante 10 seg, luego se tomó una alícuota de 1 mL y se depositó en otro tubo de ensaye con 9 mL de agua destilada esterizada (10^–1) repitiendo el procedimiento; de una segunda dilución (10^–2) se tomó una alícuota de 0.5 mL dispersando uniformemente el inóculo sobre la superficie de una caja Petri con medio de cultivo papa–dextrosa–agar (PDA) –(Difco laboratorios, Detroit, MI), adicionado con 500 mg L^–1 de cloranfenicol. El aislamiento se realizó en la cámara de flujo laminar en condiciones asépticas. Las cajas sembradas se incubaron a 28°C ± 2°C durante 5–7 días. Las colonias de Trichoderma spp. se identificaron por la forma de crecimiento característico de cojines verdes de conidios, siguiendo las claves de Barnett y Hunter (1972); posteriormente se purificaron y observaron al microscopio compuesto las características del género, como es el desarrollo de un conidióforo hialino, muy ramificado, no verticilado, con fiálides individuales o en grupos, fialeconidios hialinos unicelulares, ovoides formados en pequeños racimos terminales, y las cepas axénicas se mantuvieron a temperatura ambiente en tubos inclinados con PDA y se etiquetaron para su conservación, hasta su posterior uso.

Procedencia de las cepas de los agentes causales de la "escoba de bruja" del mango. F. oxysporum (Fo), cepa GUE–AL001 y F. subglutinans (Fs), cepa GUE–AL002, fueron proporcionadas por el Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados en Montecillo, Edo. de México, mismas que se aislaron de plantas de mango enfermas, en el estado de Guerrero.

Selección e identificación de las cepas nativas de Trichoderma. De las cepas aisladas se seleccionaron las que presentaron la mayor capacidad antagónica in vitro, al inhibir o retardar el crecimiento micelial de Fs y Fo. Se utilizó el método del papel celofán (Dennis y Webster, 1971), que consistió en cortar el papel en círculos de 9.0 cm de diámetro, los cuales se esterilizaron previamente y se colocaron cada uno bajo condiciones asépticas dentro de la caja Petri sobre el medio de cultivo PDA; luego se inoculó cada placa de agar, depositando en la parte central del papel un fragmento micelial de 5 mm de diámetro, de cada uno de los diferentes aislados de Trichoderma spp. de cultivos de 8 días de crecimiento, incubándose durante 2 días a 28°C ± 2°C. Después de este período se retiró el papel transfiriéndolo cuidadosamente para evitar que alguna espora del hongo se diseminara y germinara en el medio de cultivo, y se inoculó en el centro de esa misma caja Petri, un disco de 5 mm de diámetro de las especies Fs y/ o Fo, según el caso. Se midió diariamente el diámetro del crecimiento micelial del hongo hasta que el testigo cubrió completamente la caja, aproximadamente a los 12 días. Para cada especie se tuvieron 11 tratamientos, que correspondieron a las 10 cepas nativas de Trichoderma y el testigo que según el caso, Fs y/o Fo, distribuidos en un diseño experimental completamente al azar, con 4 repeticiones. Para determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de los fitopatógenos, se calculó con base a la siguiente formula: % de inhibición = [(D1–D2)/D1x100] (Worasatit et al., 1994); donde: D1 = diámetro de la colonia de Fusarium creciendo en cajas con PDA libre de inhibidores y D2 = diámetro de la colonia fungosa de Fusarium creciendo en cajas con PDA, donde anteriormente creció Trichoderma spp. sobre el papel celofán, impregnando al medio de cultivo de enzimas y metabolitos secundarios producidos por este hongo inhibidor. La cepa seleccionada se identificó a nivel de especie en base las características morfológicas con las claves de Rifai (1969) y Bisset (1991). Adicionalmente se envió al Dr. Gary J. Samuels, Taxónomo del laboratorio de Botánica Sistemática y Micología del USDA–ARS, en Beltsville, Maryland, EUA, para corroborar la identificación previa.

Análisis estadístico. Los datos obtenidos para cada uno de los ensayos se sometieron a un análisis de varianza y una prueba de comparación de medias de Tukey (p < 0.05), con el paquete estadístico SAS (1999). En el caso de los datos en porcentajes, antes de someterlos al análisis de varianza y prueba de Tukey, se transformaron mediante la fórmula: raíz de x+0.5.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento de cepas nativas de Trichoderma spp. Se aislaron diez cepas de Trichoderma del suelo colectado en otoño de la huerta de mango en Tuxpan. Estos resultados superan el número de cepas obtenidas por Michel–Aceves et al. (2001), de suelo colectado durante el invierno del 2001 en 2 huertas del mismo lugar obteniendo 2 y 5 cepas, y también a los obtenidos por Hernández (2005) en Tlaxmalac y Huitzuco, Guerrero (poblaciones de la misma zona Norte de Guerrero), quien aisló durante la primavera en 15 parcelas donde se cultiva cacahuate (Arachis hypogaea L.), 10 y 2 cepas, respectivamente. Arzate–Vega et al. (2006), aislaron 25 cepas en 15 huertas de plátano (Musa spp.) en la región de Costa Grande, Guerrero, particularmente en la zona platanera de Tenexpa. Es importante resaltar que la estación del año puede influir en la densidad de población de Trichoderma; Windden y Abitbol (1980), encontraron poblaciones altas en primavera y verano, comparado con otoño e invierno de zonas templadas en suelos forestales. Al respecto, Harman (2002) complementó lo anterior y especificó que la temperatura y la humedad son considerados como parámetros de importancia en la distribución natural de este antagonista en el suelo; además, también influye el manejo de las huertas mediante el uso excesivo de productos químicos que pueden influir en la dinámica poblacional, tal es el caso del fungicida Benomil (Ahmad y Baker, 1987) y la aplicación de citrolina (aceite agrícola), o bien, por la alta presencia de saprófitos que compiten por espacio y alimento, considerando que Trichoderma es un competidor agresivo (Papavizas, 1981).

Selección e identificación de especies nativas. El porcentaje de inhibición varió de forma significativa desde 5.3 a 42.0% en Fs y de 41.9 a 62.9% en Fo (Cuadro 1). El criterio para seleccionar las mejores cepas fue considerando el mayor porcentaje de inhibición; en Fs de 42.0% y para Fo 62.9%, de tal manera que la cepa 2 se seleccionó para los siguientes ensayos, puesto que inhibió de forma significativa a los dos fitopatógenos. En un trabajo similar Arzate–Vega et al. (2006), al evaluar a Trichoderma spp. sobre Mycosphaerella fijiensis Morelet, seleccionaron 6 de 25 cepas que inhibieron al menos el 45% el crecimiento del micelio del fitopatógeno. Los porcentajes obtenidos en la presente investigación para ambos fitopatógenos son menores a los reportados por Michel–Aceves et al. (2005a), quienes al evaluar el efecto antagónico de cepas nativas de Trichoderma spp. sobre el crecimiento del micelio y el potencial reproductivo, los valores máximos de inhibición fueron de 73.0% en Fs y de 69.5% para Fo. Asimismo, Michel–Aceves et al. (2005b), en otra investigación, reporta un porcentaje de inhibición de 77.8%, para F. oxysporum Schlechtend.:Fr. f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder y Hansen. Estas diferencias pueden deberse entre otras cosas, a las especie de Trichoderma, al sitio de procedencia y al potencial antagónico que es diferente en cada una de ellas en cuanto a la producción de quitinasas y glucanasas, inclusive en cepas de la misma especie (Harman, 2002). En otros trabajos similares pero con otros hongos fitopatógenos de partes aéreas se han reportado altos porcentajes de inhibición; Michereff et al. (1995), al evaluar sobre una enfermedad foliar causada por Curvularia eragrostidis (Henn.) J.A. Meyer en el cultivo del camote (Dioscorea spp.), indican una inhibición del 62 a 89%, Arzate–Vega et al. (2006), sobre Mycosphaerella fijiensis causante de la sigatoka del plátano de 62 a 73%. De igual manera, Sousa Rocha y Oliveira (1998) reportan valores de 100% de inhibición sobre Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. y Sacc. causante de la antracnosis en el cultivo de la fruta de la pasión (Pasiflora spp.). El Dr. Gary J. Samuels (USDA–ARS) corroboró la identificación de la cepa seleccionada la cual corresponde a la especie T. harzianum Rifai. Se identificó con base en las claves de Rifai (1969) y Bisset (1991) observándose al microscopio compuesto las siguientes características: Conidióforo dispuesto en pústulas planas, hialino, ramificado, no verticilado, conidios unicelulares globosos a subglobosos u ovoides, menor que 3.5 m x 2.5 μη formados en pequeños racimos terminales. Se incluyó en el cepario con la simbología Thzn–2

Actividad antagónica de Trichoderma spp. sobre F. oxysporum. Las hifas de Fusarium tuvieron contacto con las hifas de Trichoderma en diferentes tiempos; ambas especies de Fusarium, a pesar de que se les dieron tres días de ventaja por su crecimiento lento, se observó que Trichoderma se comportó como agresivo. El tiempo al primer contacto mostró diferencias significativas; los valores oscilaron entre 2 y 3 días en el caso de Fs y entre 3 y 4 para Fo. Entre menor sea el tiempo de contacto mayor es la agresividad del hongo antagónico (Michel–Aceves et al., 2005a); por lo tanto, las cepas Thzn–2 (nativa seleccionada) y Thzcf–12 en F. oxysporum son más agresivas en comparación con T. lignorum (Cuadro 2); sin embargo, es diferente en Fs pues las que presentaron mayor agresividad fueron Thzcf–12 y T. lignorum en comparación con la cepa nativa Thzn–2. Estos datos superan lo reportado por Michel–Aceves et al. (2005a), quienes indican valores entre 3.67 y 6.67 días y en particular para Thzcf–12 (4.67 días). De la misma manera Michel–Aceves et al., (2005b), reportaron 5 y 7 días para el contacto de T. harzianum contra F. oxysporum f. sp. lycopersici. En este sentido, Arzate–Vega et al. (2006) reportaron contacto a las 24 h después de la inoculación de ocho cepas de Trichoderma spp. a pesar de haber dado 16 días de ventaja a M. fijiensis por su crecimiento lento. Asimismo, Yates et al. (1999) en una cepa aislada de T. virens Millar reportaron seis días para el contacto entre hifas con F. moniliforme Sheld. Es importante observar la zona de intersección, pues entre mayor sea el área de contacto, mayor es la agresividad por parte del hongo antagónico (Michel–Aceves et al., 2005a). Esta variable fue visible para las diferentes cepas de Trichoderma las cuales sobrecrecieron en diferente medida al fitopatógeno. La mayor zona de intersección se presentó en T. lignorum (0.87 cm) contra Fo y la cepa Thzcf–12 tuvo 0.77 cm, mientras que en Fs la cepa nativa Thzn–2 tuvo 0.85 cm a comparación con T. lignorum el cual presentó la menor zona con 0.67 cm. En un trabajo similar Michel–Aceves et al. (2005a), reportaron valores para la cepa Thzcf–12 de 4.02 y 2.61 cm para Fs y Fo, respectivamente, mientras que en otra investigación con esta misma cepa contra F. oxysporum f. sp. lycopersici fue de 1.2 cm (Michel–Aceves et al., 2005b), todos estos mayores a los obtenidos en la presente investigación. En otro estudio contra el hongo Colletotrichum gloeosporioides, Sousa Rocha y Oliveira (1998), reportaron entre 1.93 y 4.5 cm de la zona de intersección de las diferentes especies de Trichoderma sobrecreciendo al fitopatógeno. Asimismo, Santamaría (2003) al comparar la zona de intersección de Trichoderma contra Alternaria solani Sorauer y Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, obtuvo valores entre 0.53 a 0.54 y de 0.55 a 2.47 cm, respectivamente. La colonización del área compitiendo por espacio y nutrientes es una manera de ejercer biocontrol, al reducir o detener completamente el desarrollo del micelio (Dennis y Webster, 1971). De acuerdo a la clasificación de antagonismo de Bell et al. (1982), todas las cepas de Trichoderma mostraron clase 2, al cubrir el 75% de la caja Petri y detener el crecimiento de los fitopatógenos. Michel–Aceves et al. (2005a), reportaron contra Fs y Fo clases de antagonismo 1, 2 y 3; en Fs obtuvieron menor número de cepas con antagonismo 1, comparado con lo encontrado con Fo. Reportaron que la cepa Thzcf–12 presentó clase 1 para ambos fitopatógenos, el cual es superior al clasificado en este trabajo. Se han obtenido diferentes clases de antagonismo contra diferentes patógenos, Michel–Aceves et al. (2005b), clasificó el antagonismo de 20 cepas de Trichoderma contra Fo y todas resultaron clase 1, mientras que con Sclerotium rolfsii Sacc., sólo 3 fueron clase 1 y 2, y en las demás cepas, el fitopatógeno fue más agresivo. Sousa Rocha y Oliveira (1998), reportaron clasificación antagónica de 1, 2 y 3 contra C. gloeosporioides en el cual se manifiesta con mayor número de cepas clase 2; mientras tanto, Hernández (2005), reportó antagonismo clases 2, 3, 4 y 5 de 6 cepas aisladas de Trichoderma contra S. rolfsii.

CONCLUSIONES

La cepa nativa Thzn–2 de la especie Trichoderma harzianum tiene potencial de biocontrol por la inhibición y antagonismo clase 2 sobre Fusarium subglutinans y F. oxysporum, y se sugiere continuar con las evaluaciones de campo para validar dicha eficacia.

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