Actividad Antifúngica del Quitosano en el Control de Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. y Mucor spp.

Antifungal activity of chitosan to control Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. and Mucor spp.

Ana Niurka Hernández-Lauzardo¹, Maricruz Hernández-Martínez¹, Miguel Gerardo Velázquez-del Valle¹, María Guadalupe Guerra-Sánchez² y Gloria Elena Melo-Giorgana³

¹ Instituto Politécnico Nacional (IPN), Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, Depto. de Interacciones Planta-Insecto, km 8.5 Carr. Yautepec-Jojutla San Isidro, Yautepec, Morelos, México CP 62730. Correspondencia: aniurka10@hotmail.com.

² IPN, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Depto. de Microbiología, Prolongación Carpio s/n Esquina Plan de Ayala, Colonia Plutarco Elías Calles, Delegación Miguel Hidalgo, México, D.F. CP 11340.

Recibido: Octubre 9, 2006
Aceptado: Marzo 2, 2007

Resumen

Las enfermedades postcosecha han sido controladas mediante el empleo de fungicidas químicos; sin embargo, diferentes alternativas naturales de control han sido desarrolladas recientemente. En esta investigación, se evaluó la actividad antifúngica del quitosano a diferentes concentraciones (0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg mL^-1) en condiciones in vitro e in situ sobre el desarrollo de Rhizopus stolonifer y Mucor spp. El crecimiento micelial y la esporulación de ambas cepas se inhibió a diferentes concentraciones de quitosano, siendo la concentración de 2 mg mL^-1 la mejor. La morfología de las esporas varió dependiendo del hongo evaluado, fueron más susceptibles las esporas de R. stolonifer porque presentaron variaciones en su área, forma y densidad óptica (2 y 1.5 mg mL^-1), mientras que Mucor spp. sólo manifestó variaciones de densidad óptica desde 1.5 mg mL^-1. Ambos fitopatógenos presentaron inhibición en la germinación de sus esporas (2.0 mg mL^-1). Los resultados in situ demostraron el potencial antifúngico del quitosano para controlar enfermedades postcosecha.

Palabras clave: Pudriciones postcosecha, características morfométricas, germinación, esporulación.

Abstract

Keywords: Postharvest rots, morphometrics characteristic, germination, esporulation.

El quitosano, polímero de naturaleza policatiónica que se obtiene mediante un proceso de desacetilación de la quitina, ha sido ampliamente utilizado con fines biotecnológicos, entre los que destacan la inmovilización enzimática y el efecto como agente floculante (Sandford, 1989). En la agricultura se ha empleado como modificador de suelos, fungicida, inductor de resistencia (Ait-Barka et al., 2004; Hoagland y Parris, 1996) y en el recubrimiento de frutos para prevenirlos de enfermedades postcosecha (Bautista-Baños et al., 2006). Estas enfermedades han sido controladas durante muchos años mediante el uso de fungicidas químicos, los cuales debido a su intensa utilización han generado problemas de contaminación en el medio ambiente, complicaciones en la salud de los seres humanos y resistencia en los microorganismos que se tratan de controlar (Triphathi y Dubey, 2004). El quitosano figura dentro de las alternativas naturales más importantes para controlar las pudriciones postcosecha de los productos hortofrutícolas causadas por diferentes hongos fitopatógenos. Estudios previos han sido realizados en Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. Se ha observado que el efecto del quitosano depende de varios factores: grado de acetilación, polimerización, concentración y su forma de aplicación (Bautista-Baños et al., 2004; El Ghaouth et al., 1992 a, b; Savard et al., 2002). Sin embargo, no se encontraron reportes previos en la literatura del empleo de quitosano en el control de Mucor spp. El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antifúngica del quitosano sobre el crecimiento micelial, esporulación, características morfométricas y germinación de R. stolonifer y Mucor spp. en medio papa-dextrosa-agar (PDA). Así mismo, se evaluó el efecto de la utilización de este polímero en la prevención del desarrollo de la pudrición blanda en frutos de jitomate (Lycopersicon esculentum Mill.).

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico. Las cepas de Rhizopus stolonifer y Mucor spp. se obtuvieron de frutos de jitomate de la variedad Saladette con un estado de madurez ¾ sazón, provenientes del mercado Centenario del municipio de Yautepec, Morelos, México. Se mantuvieron en cámaras húmedas a temperatura ambiente (25°C) para permitir el desarrollo de los hongos fitopatógenos estudiados. Posteriormente, se tomaron fragmentos del micelio y se sembraron en cajas Petri con PDA a 25°C durante 96 h. Después de la aparición de las estructuras de reproducción se procedió al aislamiento e identificación de los hongos (Barnett y Hunter, 1972; Hernández-Lauzardo et al., 2006; Schipper, 1984).

Preparación del quitosano: Se utilizó quitosano de bajo peso molecular (Sigma-Chemical Co. St. Louis, MI, USA). Se preparó una solución de quitosano de 10 mg mL^-1, disuelto en ácido acético. Se esterilizó en autoclave y posteriormente se tomaron las alícuotas correspondientes para adicionarse al medio PDA estéril y obtener concentraciones finales de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg mL^-1.

Evaluaciones in vitro. Para cada uno de los hongos se emplearon cinco tratamientos que consistieron en: un testigo sin quitosano (PDA) y la aplicación de quitosano en placas de PDA en concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg mL^-1, respectivamente. Se tomaron fragmentos de 5 mm de inóculo (R. stolonifer o Mucor spp. crecidos en PDA), se sembraron individualmente en el centro de las cajas Petri conteniendo los tratamientos mencionados anteriormente y se incubaron durante 72 h a 25°C. Se establecieron tres réplicas por tratamiento y el experimento se repitió dos veces.

Crecimiento micelial. Consistió en medir el diámetro de las colonias con ayuda de un Vernier digital, cuando el micelio del tratamiento testigo cubrió la caja Petri (48 h).

Características morfométricas de las esporas. Se tomaron alícuotas de 10 µL de la suspensión de esporas de los tratamientos referidos anteriormente, las cuales se colocaron en portaobjetos y se analizaron empleando un microscopio óptico (40x) acoplado a una cámara de video (DL 330 DAGE-MTI). Mediante un sistema de análisis de imágenes (Meta imaging series para Microsoft Windows versión 4.0, Universal Imaging Corporation, USA) se realizaron mediciones de área total (µm2), ancho (µm), largo (µm), altura (µm), densidad óptica y factor de forma elíptica.

Germinación de las esporas. La germinación se analizó en soluciones de quitosano y en discos de PDA. Alícuotas de 50 µL de una suspensión de 1 x 10⁵ esporas mL^-1 se colocaron en tubos eppendorf (0.5 mL) y en discos de PDA (20 mm) con los tratamientos estudiados. Se incubaron durante 10 (R. stolonifer) y 16 h (Mucor spp.) a 25°C. El conteo de la germinación de 100 esporas por muestra se realizó en un microscopio óptico (40X) con un contador manual. Las esporas se consideraron germinadas cuando el largo del tubo germinal fue igual o excedió la longitud de la espora (El Ghaouth et al., 1992b).

Evaluaciones in situ. Se emplearon frutos de jitomate de la variedad Saladette con un estado de madurez ¾ sazón provenientes de la central de abastos de Cuautla, Morelos. Se seleccionaron los frutos sanos que no presentaban síntomas de enfermedad o daños mecánicos, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 15 min, se lavaron con agua destilada estéril y se dejaron secar a temperatura ambiente sobre papel absorbente. Se establecieron los siguientes tratamientos: testigo, diclorán, los restantes con diferentes concentraciones de quitosano de bajo peso molecular (0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg mL^-1). En la campana de flujo laminar a cada fruto se le hizo heridas de 1 cm de largo con un bisturí estéril y se asperjaron con una suspensión de esporas (1 x 10⁵ esporas mL^-1) de R. stolonifer o Mucor spp., posteriormente se sumergieron en los tratamientos correspondientes, se dejaron secar y se mantuvieron en charolas de unicel sobre papel absorbente a 25°C durante 120 h.

Porcentaje de infección e índice de severidad. Al término del período de almacenamiento de 5 días, se contaron los frutos que presentaban síntomas de pudrición blanda en cada tratamiento, el número total de frutos se consideró como el 100%. El índice de severidad se determinó sobre la superficie de los frutos con cinco grados de daño en base a una escala establecida con las siguientes categorías 1 = 0, 2 = 1-25, 3 = 26-50, 4 = 51-75 y 5 = 76-100 % de daño visual por fruto. El índice se estableció mediante la ecuación descrita por Pérez et al. (1995), Índice de severidad = Xi (1) + Xi (2) + Xi (3) + Xi (4) + Xi (5)/N donde: Xi = número de frutos enfermos por cada grado de daño; 1, 2, 3, 4 y 5 = grado de daño en la escala utilizada y N = número total de frutos por unidad experimental.

Pérdida de peso. Los frutos de cada tratamiento se pesaron diariamente hasta el término del período de almacenamiento. La pérdida de peso se evaluó en base a la siguiente fórmula: pérdida de peso = (peso inicial-peso final/peso inicial) x 100 (Hernández-López, 2002).

Análisis estadístico. Los experimentos se desarrollaron mediante un diseño experimental completamente al azar en arreglo simple. Los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA) con el programa Sigma Stat versión 2.0. La comparación de medias se realizó con la prueba de rangos múltiples de Tukey (p ≤ 0.05) y la prueba de Dunn, según correspondiera.

RESULTADOS

Efecto del quitosano sobre el crecimiento micelial y esporulación de R. stolonifer y Mucor spp. En el Cuadro 1 se muestran los resultados del crecimiento micelial de R. stolonifer y del porcentaje de inhibición del mismo. Se observaron diferencias entre los tratamientos. El crecimiento micelial se redujo en comparación con el testigo que invadió la caja a las 48 h de incubación (86 mm). El menor crecimiento micelial se presentó con la concentración de 2.0 mg mL^-1 (32.9 mm), se obtuvo un porcentaje de inhibición del 61.7%. En el caso de Mucor spp., las diferencias en el crecimiento con relación al tratamiento testigo se observaron a partir de la aplicación de 1.0 mg mL^-1 de quitosano; el menor crecimiento micelial se obtuvo con la concentración de 2.0 mg mL^-1 (23.2 mm) la cual presentó un 52.1% de inhibición. La inhibición en la esporulación de R. stolonifer se reflejó a partir del tratamiento de 1.0 mg mL^-1 del biopolímero. El menor número de esporas se presentó con la concentración de 2.0 mg mL^-1 (0.4 x 10⁵ esporas mL^-1). En Mucor spp. se observó una respuesta inhibitoria desde la concentración de 1 mg mL^-1, con el menor valor de esporulación (0.3 x 10⁶ esporas mL^-1) con la aplicación de 2.0 mg mL^-1 de quitosano.

Características morfométricas de las esporas de R. stolonifer y Mucor spp. R. stolonifer mostró una disminución del área (201 µm²) de sus esporas y del factor de forma elíptica (1.1) cuando se empleó la concentración de 2.0 mg mL^-1. La densidad óptica de sus esporas presentó cambios sólo con la aplicación de 1.5 mg mL^-1 (Cuadro 2). En el caso de Mucor spp. el área de las esporas (72 µm²) y el factor de forma elíptica (1.3) no presentaron diferencias entre los tratamientos. La densidad óptica (0.29) de las mismas disminuyó en las concentraciones de 1.5 y 2.0 mg mL^-1.

Germinación de las esporas de R. stolonifer y Mucor spp. La germinación de las esporas de R. stolonifer (Cuadro 3) se inhibió tanto en soluciones de quitosano como en discos de PDA, a partir de una concentración de 1.0 mg mL^-1. El menor porcentaje de germinación se observó en la concentración de 2.0 mg mL^-1 (54.5). De forma similar, Mucor spp. presentó el menor valor de germinación tanto en soluciones de quitosano como en discos de PDA en la concentración de 2.0 mg mL^-1 (31.5), se obtuvo un efecto inhibitorio con todas las concentraciones de quitosano aplicadas.

Evaluación de la aplicación de quitosano en frutos de jitomate. En el Cuadro 4 se muestra que el experimento inoculado con R. stolonifer presentó el mayor porcentaje de infección (99.5%), el menor valor se encontró al tratar los frutos con 2.0 mg mL^-1 (20.5%) de quitosano y una respuesta intermedia se obtuvo cuando se aplicó diclorán (60.9%). El menor índice de severidad se alcanzó cuando se aplicaron 2.0 mg mL^-1 de quitosano (0.7) y la menor pérdida de peso se observó con el tratamiento de 1.5 mg mL^-1 (4.7%). Con la cepa de Mucor spp. se evidenció un menor porcentaje de infección (40.4 %) e índice de severidad (1.3) cuando se trataron los frutos con diclorán. Sin embargo, la pérdida de peso no presentó diferencias entre los tratamientos.

DISCUSIÓN

En general, en los experimentos in vitro se demostró la actividad antifúngica del quitosano; el crecimiento micelial y la esporulación de los hongos R. stolonifer y Mucor spp. variaron de acuerdo a la concentración de quitosano aplicada, se obtuvo una respuesta diferente dependiendo del género. R. stolonifer mostró mayor susceptibilidad ante la aplicación de este polímero, al presentar mayores valores de inhibición del crecimiento micelial. Se observó que a mayores concentraciones de este polímero, el efecto de inhibición es mayor, coincidiendo con estudios reportados anteriormente (Bautista-Baños et al., 2004, 2005; El Ghaouth et al., 1992 b). La esporulación de R. stolonifer y Mucor spp. disminuyó al incrementarse las concentraciones de quitosano, concordando con los resultados obtenidos por Bautista-Cerón (2004), quién observó una disminución proporcional en la esporulación de Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. y Sacc. El área, la forma y la densidad de las esporangiosporas de R. stolonifer sólo se modificaron con la aplicación de altas concentraciones de quitosano. Sin embargo, en estudios previos no se observaron cambios en la forma de las esporas de R. stolonifer por adición de quitosano (Hernández-López, 2002). En Mucor spp. no se observaron cambios en la morfología de las esporas, excepto en los valores de densidad óptica que reflejaron variaciones con las concentraciones de 1.5 y 2.0 mg mL^-1. Por otra parte, la germinación de las esporas de R. stolonifer y Mucor spp. se inhibió con cualquiera de las formas de aplicación del quitosano; en otras investigaciones realizadas con C. gloeosporioides, se encontró que la respuesta fue diferente dependiendo de la incubación en soluciones de quitosano y se relacionó con el efecto fungicida o fungistático del mismo (Bautista-Baños et al., 2005); este estudio evidencia que es muy importante el género y/o especie estudiada y la concentración de este polímero con actividad antifúngica. El quitosano mostró potencial antifúngico in situ, variando de acuerdo al género estudiado; a una misma concentración del polímero (2 mg mL^-1), R. stolonifer mostró mayor susceptibilidad que Mucor spp. en cuanto a infección e índice de severidad se refiere. El efecto del quitosano sobre frutos no ha sido del todo dilucidado, son varias las hipótesis que contribuyen a esclarecerlo, entre las que se encuentran, la reducción de las enzimas pectinolíticas (Reddy et al., 2000), el incremento de hidrolasas antifúngicas (Zhang y Quantick, 1998) y la inducción de cambios ultraestructurales y citoquímicos en las hifas invasoras (El Ghaouth et al., 1997). Por otra parte, también se ha demostrado que el efecto del quitosano varía dependiendo del momento en que se aplique (Zhang et al., 2005). El uso del quitosano en el control de las enfermedades postcosecha es una alternativa de conservación de los productos hortícolas durante el almacenamiento, sin riesgos ecológicos, no obstante, es necesario continuar profundizando en los diferentes aspectos básicos que contribuyen a explicar el efecto de la aplicación de este polímero en los frutos.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el apoyo financiero de la Secretaría de Investigación y Posgrado del Instituto Politécnico Nacional.

LITERATURA CITADA

Ait-Barka, E., Eullaffroy, P., Clément, C., and Vernet, G. 2004. Chitosan improves development and protects Vitis vinifera L. against Botrytis cinerea. Plant Cell Report 22:608-614.         [ Links ]

Barnett, H.L., and Hunter, B.B. 1972. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Burgess Publishing Co. Minneapolis, MN, USA. 241 p.         [ Links ]

Bautista-Baños, S., Hernández-Lauzardo, A.N., Velázquez-del Valle, M.G., Hernández-López, M., Ait-Barka, E., Bosquez-Molina, E., and Wilson, C.L. 2006. Chitosan as a potencial natural compounds to control pre and postharvest diseases of horticultural commodities. Crop Protection 25:108-118.         [ Links ]

Bautista-Baños, S., Hernández-López, M., and Bosquez-Molina, E. 2004. Growth inhibition of selected fungi by chitosan and plant extracts. Revista Mexicana de Fitopatología 22:178-186.         [ Links ]

Bautista-Baños, S., Hernández-López, M., Hernández-Lauzardo, A.N., Bautista-Cerón, M., and Melo-Giorgana, G.E. 2005. Effect of chitosan on in vitro development and morphology of two isolates of Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. and Sacc. Revista Mexicana de Fitopatología 23:62-67.         [ Links ]

Bautista-Cerón, M.K. 2004. Efecto del quitosano en el desarrollo in vitro y morfología de dos cepas del hongo Colletotrichum gloeosporioides. Tesis de licenciatura. Instituto Politécnico Nacional, CEPROBI. Yautepec, Morelos. México. 87 p.         [ Links ]

El Ghaouth, A., Arul, J., and Asselin, A. 1992a. Potential use of chitosan in postharvest preservation of fruits and vegetables. pp. 440-452. In: C.J. Brines, P.A. Sandfors, and J.P. Zikakis (eds.) Advances in Chitin and Chitosan. Elsevier Applied Science. New York, USA. 835 p.         [ Links ]

El Ghaouth, A., Arul, J., Grenier, J., and Asselin, A. 1992b. Antifungal activity of chitosan on two postharvest pathogens of strawberry fruits. Phytopathology 82:398-402.         [ Links ]

El Ghaouth, A., Arul, J., Wilson, C., and Benhamou, N. 1997. Biochemical and cytochemical aspects of the interactions of chitosan and Botrytis cinerea in bell pepper fruit. Postharvest Biology and Technology 12:183-194.         [ Links ]

Hernández- López, M. 2002. Uso potencial del quitosano y extractos vegetales en el control de Colletotrichum gloeosporioides, Rhizopus stolonifer, Penicillium digitatum y Fusarium oxysporum de la papaya (Carica papaya). Tesis de Maestría. Instituto Politécnico Nacional, CEPROBI. Yautepec, Morelos, México 101 p.         [ Links ]

Hernández-Lauzardo, A.N., Bautista-Baños, S., Velázquez-del Valle, M.G. y Trejo-Espino, J.L. 2006. Identification of Rhizopus stolonifer (Ehrenb.: Fr.) Vuill., causal agent of Rhizopus rot disease of fruits and vegetables. Revista Mexicana de Fitopatología 24:65-69.         [ Links ]

Hoagland, P.D., and Parris, N. 1996. Chitosan/pectin laminated films. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44:1915-1919.         [ Links ]

Pérez, M.N., Flores, P. J., García, V.L. y Lozano, V.C. 1995. Factores genéticos y ambientales relacionados con la dinámica temporal y efecto de las enfermedades en frijol (Phaseolus vulgaris L.) en Marín, Nuevo León, México. Revista Mexicana de Fitopatología 13:1-9.         [ Links ]

Reddy, B.M.V., Angers, P., Castaigne, F., and Arul, J. 2000. Chitosan effects on black mold rot and pathogenic factors produced by Alternaria alternata in postharvest tomatoes. Journal of the American Society for Horticultural Science 125:742-747.         [ Links ]

Sandford, P. 1989. Chitosan: Commercial uses and potential applications. pp. 51-69. In: G. Skjak-Braek, T. Anthosen, and P. Standford (eds.). Chitin and Chitosan. Sources, Chemistry, Biochemistry. Physical Properties and Applications. Elsevier Applied Science. New York, USA. 835 p.         [ Links ]

Savard, T., Beaulieu, C., Boucher, I., and Champagne, C.P. 2002. Antimicrobial activity of hydrolyzed chitosan against spoilage yeasts and litic acid bacteria of fermented vegetables. Journal of Food Protection 65:828-833.         [ Links ]

Schipper, M.A.1984. A Revision of the Genus Rhizopus. Studies in Mycology. Serie No. 25. Centraalbureau voor Schimmelcultures. Baarn, The Netherlands, 34 p.         [ Links ]

Triphathi, P., and Dubey, N.K. 2004. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology 32:235-245.         [ Links ]

Zhang, D., and Quantick, P. 1998. Antifungal effects of chitosan coating on fresh strawberries and raspberries during storage. Journal of Horticultural Science and Biotechnology 73:763-767.         [ Links ]

Zhang, H., Zheng, X., Fu, C., and Xi, Y. 2005. Postharvest biological control of gray mold rot of pear with Cryptococcus laurentii. Postharvest Biology and Technology 35:79-86.         [ Links ]