Mutaciones asociadas con resistencia a rifampicina o isoniazida en aislamientos clínicos de M. tuberculosis de Sonora, México
DNA mutations associated to rifampicin or isoniazid resistance in M. tuberculosis clinical isolates from Sonora, Mexico
Enrique Bolado-Martínez, D en CI; Ansix Pérez-Mendoza, QBCII; Francisco Monserrat Alegría-MorquechoI; María del Carmen Candia-Plata, D en CIII; María del Rosario Aguayo-Verdugo, QBIV; Gerardo Álvarez-Hernández, D en C.III
IDepartamento de Ciencias Químico Biológicas, Universidad de Sonora. Hermosillo, Sonora, México
IIMaestría en Ciencias de la Salud, Universidad de Sonora. Hermosillo, Sonora, México
IIIDepartamento de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Sonora. Hermosillo, Sonora, México
IVLaboratorio Estatal de Salud Pública. Hermosillo, Sonora, México
RESUMEN
OBJETIVO: Realizar el análisis de regiones específicas de genes asociados con resistencia a isoniazida o rifampicina.
MATERIAL Y MÉTODOS: Se estudiaron 22 cepas de M. tuberculosis, aisladas en Sonora, México. Se utilizaron iniciadores para regiones específicas de los genes rpoB, katG e inhA y la región ahpC-oxyR. Los productos de PCR se secuenciaron y analizaron.
RESULTADOS: Se identificaron mutaciones en la región promotora del gen inhA, región ahpC-oxyR, codón 315 del gen katG y codones 451 ó 456 del gen rpoB.
CONCLUSIONES: La identificación de mutaciones no descritas previamente obliga a continuar el análisis genotípico de cepas aisladas en Sonora.
Palabras clave: Mycobacterium; mutación; resistencia a medicamentos; isoniazida; rifampicina
ABSTRACT
OBJECTIVE: To perform the analysis of specific regions of the major genes associated with resistance to isoniazid or rifampin.
MATERIALS AND METHODS: Twenty two M. tuberculosis strains, isolated from human samples obtained in Sonora, Mexico. Specific primers for hotspots of the rpoB, katG, inhA genes and the ahpC-oxyR intergenic region were used. The purified PCR products were sequenced.
RESULTS: Mutations in the promoter of inhA, the ahpC-oxyR region, and codon 315 of katG and in 451 or 456 codons of rpoB, were identified.
CONCLUSIONS: Detection of mutations not previously reported requires further genotypic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates in Sonora.
Keywords: Mycobacterium; mutation; drug resistance; isoniazid; rifampin
]]> La frecuencia de mutaciones específicas en cepas de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) resistentes a isoniazida o rifampicina, varía entre regiones geográficas. Las mutaciones más frecuentes en las cepas resistentes a rifampicina se localizan en los codones 432 al 458 del gen rpoB, que codifica la subunidad beta de la enzima ARN polimerasa.1 La resistencia de M. tuberculosis a la isoniazida involucra al menos cuatro genes: katG, que codifica la enzima catalasa-peroxidasa; el gen inhA, que codifica una proteína involucrada en la extensión de ácidos grasos; el gen ahpC, que codifica la alquil-hidroperóxido reductasa C y el gen oxyR, un importante regulador del estrés oxidativo.2 En este trabajo se presentan los resultados iniciales de la caracterización genotípica de cepas clínicas de M. tuberculosis resistentes a isoniazida o rifampicina aisladas en Sonora, México.2,3
Material y métodos
Se analizaron 22 cepas clínicas de M. tuberculosis (cuadro I) aisladas e identificadas en el Laboratorio Estatal de Salud Pública (LESP) en Hermosillo, Sonora, México, de 2006 a 2009. Las cepas se mantuvieron en criopreservación a -70ºC, hasta su reactivación para este estudio y fueron seleccionadas de acuerdo con: 1) su capacidad para desarrollarse adecuadamente en el medio de cultivo sólido 2) su perfil fenotípico de resistencia a fármacos, que fue realizado en el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) de México, en 16 de las 22 cepas de acuerdo (cuadro I). Para aislar el ADN, se utilizó la matriz quelante Chelex-100 al 10% (modificado de referencia 4). Los procedimientos de PCR fueron realizados con iniciadores y procedimientos previamente descritos (cuadro II). Los productos de la amplificación se purificaron utilizando columnas GFX y se enviaron a secuenciación a Macrogen (Corea). Las secuencias obtenidas fueron alineadas con las secuencias disponibles en la base de datos GenBank, utilizando el algoritmo BLAST, disponible en NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
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Resultados
En el cuadro I se muestran los perfiles de resistencia a isoniazida (INH) y rifampicina de 16 cepas, así como las mutaciones identificadas en el presente trabajo. Se detectaron cuatro inserciones en la cepa H10507: +CCA en -12 a -14 y +A en -17 del gen ahpC. Ninguna de estas mutaciones ha sido reportada previamente, por lo que se depositaron en GenBank (cepa H21408 con acceso HM355827 y cepa H10507 con acceso HM355826). No se detectaron mutaciones en dos de las 11 cepas resistentes a INH (cuadro I, claves H8306 y H10407).
En el gen rpoB, también se detectaron dos mutaciones que no han sido descritas previamente, por lo que fueron depositadas en GenBank (cepa H13407 con acceso HM355829 y cepa H8309 con acceso HM355828). En dos cepas multidrogorresistentes (H8206 y H8708) sólo se identificaron mutaciones asociadas con resistencia a INH.
De las seis cepas que no se analizaron en el InDRE (cuadro I; claves H1709, H3109, H3409, H3509, H9709 y H2409) dos de ellas (H2409 y H1709) presentaron mutaciones asociadas con resistencia a isoniazida o rifampicina, respectivamente.
Discusión
De las 16 cepas con resultados previos de drogorresistencia, seis mostraron resistencia exclusiva a isoniazida, siete fueron multidrogorresistentes (resistentes a isoniazida y rifampicina) y tres fueron susceptibles a ambos fármacos. La mutación S315T se presentó en 27.3% de las cepas, un porcentaje cercano al reportado por Guo y colaboradores (36.3%) en aislamientos de EUA.10 La frecuencia de esta mutación varía entre regiones geográficas desde 54.7% en Corea,11 hasta 91.7% en San Petersburgo (Rusia).3 En Monterrey, México, esta mutación se observó en 67.6% de 25 aislamientos clínicos resistentes a INH,12 mientras que en el Sureste de México se demostró que 52% de 17 aislamientos presentaban esta mutación.13 En el mismo codón (katG 315) se detectó una mutación poco frecuente en el nucleótido 945, que produjo la sustitución S315R. Esta mutación sólo se ha observado en una cepa recuperada de un paciente en China.14 Otras dos mutaciones no reportadas previamente fueron observadas en la región intergénica ahpC-oxyR.
En la región promotora del gen inhA, la mutación más frecuente (-15C> T),12 con prevalencia de 23.7% en Brasil 7 a 66% en EUA,5,10 se detectó en cinco (38.46%) de las cepas resistentes a INH. No se observaron mutaciones del gen inhA en la región de los residuos 13 al 379, que son poco frecuentes.1,15 En dos de las cepas con resistencia fenotípica a INH no se demostraron mutaciones en los segmentos evaluados; es probable que estas cepas presenten mutaciones en regiones de los genes que no fueron analizados, como kasA o ndh.3,7
]]> En el gen rpoB se detectaron dos mutaciones; 50% de las ocho cepas resistentes a rifampicina tuvieron una mutación S456L, un porcentaje menor al reportado por Heep y colaboradores (65%) en aislamientos clínicos de Alemania.16 La mutación H451Y del gen rpoB, no descrita previamente, fue detectada en dos cepas. Dos cepas resistentes a rifampicina (H8206 y H8708) no mostraron mutaciones en las regiones estudiadas del gen, lo que podría deberse a que sólo se estudiaron los sitios "calientes" o con mayores tasas de mutación del gen rpoB. Considerando que en este estudio preliminar se detectaron nuevas mutaciones, es recomendable realizar la caracterización genotípica sistemática de todas las cepas clínicas de M. tuberculosis que presenten resistencia a cualquier fármaco antituberculoso, en Sonora, México.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, mediante apoyo CONACYT 110377/95337: "Apoyos complementarios para la consolidación institucional de grupos de investigación; modalidad: retención".
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Autor de correspondencia:
Declaración de conflicto de intereses: Los autores declararon no tener conflicto de intereses.
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