Prevalencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en donadores de sangre del IMSS, Orizaba, Veracruz, México
Prevalence of antibodies against Trypanossoma cruzi in blood bank donors from the IMSS General Hospital in Onizaba, Veracruz, Mexico
Angel Ramos-Ligonio, QFB, M en C, Dr,I; Michaía Elián Ramírez-Sánchez, QFB,I; Juan Carlos González-Hernández, QFB,I; José Luis Rosales-Encina, QFB, M en C, Dr,II; Aracely López-Monteon, QFB, M en C, Dr.I
IUniversidad Veracruzana, Facultad de Ciencias Químicas, LADISER Inmunología y Biología Molecular, México
IICentro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Departamento de Patología Experimental, México
RESUMEN
OBJETIVO: Determinar la prevalencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en donadores del Hospital General Regional del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) en la ciudad de Orizaba, Veracruz.
MATERIAL Y MÉTODOS: Se examinaron muestras de donadores del banco de sangre del Hospital General Regional (HGRO) del IMSS para la búsqueda de antiT. cruzi por ELISA, Western blot e IFI, utilizando una proteína recombinante (MBP::Hsp70) y un extracto crudo de epimastigotes. Las muestras fueron obtenidas entre los meses de octubre de 2001 a enero de 2002.
RESULTADOS: Los 420 donadores de sangre analizados fueron seronegativos para HBV, HCV, BrA, VDRL y HIV. Después del tamizaje de los 420 donadores, se identificaron dos individuos seropositivos por las pruebas de ELISA, Western blot e IFI, con una seroprevalencia de 0.48%.
CONCLUSIONES: En este estudio se muestran evidencias de seropositividad para T. cruzi en donadores de sangre del HGRO, lo que sugiere la existencia de riesgo de contaminación por transfusión sanguínea. Por tal motivo, es necesario aplicar programas para el tamizaje serológico a través de técnicas inmunológicas con alta sensibilidad y especificidad.
Palabras clave: enfermedad de Chagas; proteína recombinante; serodiagnóstico; México
ABSTRACT
OBJECTIVE: To estimate the prevalence of antibodies against Trypanosoma cruzi in blood donors from Hospital General Regional (HGRO) of the Mexican Institute of Social Security (IMSS per its abbreviation in Spanish). ]]>
MATERIAL AND METHODS: Between October 2001 and January 2002, blood samples were collected from voluntary donors at the blood bank of the Hospital General Regional of IMSS in Orizaba; Veracruz, Mexico. The samples were assayed for anti-T. cruzi by ELISA, Western blot and IFI, using a recombinant protein (MBP::Hsp70), and crude extract from epimastigotes.
RESULTS: A total of 420 blood donors were studied; two of them were seropositive for ELISA, Western blot and IFI, with a seroprevalence of 0.48%.
CONCLUSIONS: Some blood donors at the HGRO hospital were seropositive for T. cruzi, showing the risk of contamination by blood transfusion. Routine serologic screening with highly sensitive and specific immunological techniques are needed.
Key words: Chagas disease; recombinant protein; serodiagnosis; Mexico
La enfermedad de Chagas, también conocida como tripanosomosis americana, es un problema de salud pública en 17 países latinoamericanos, donde es endémica. Debido a su impacto económico, a partir de 1993 el Banco Mundial la considera como la enfermedad parasitaria más grave en América.1 El agente etiológico de la enfermedad de Chagas es el protozoario parásito Trypanosoma cruzi; los vectores naturales de este parásito son chinches del género Triatoma. Al alimentarse y excretar heces infectadas, la chinche transmite al huésped mamífero este agente patógeno, lo que permite que T. cruzi penetre a través de las heridas o mucosas. La transmisión vectorial es la forma normal de infección entre los animales y es la más común en el hombre, pero se puede adquirir también mediante transfusión sanguínea o transplante de órganos de personas infectadas, así como por vía congénita y, más raramente, por la ingestión de sustancias contaminadas o por la infección accidental en el laboratorio.2 De éstas, la infección por transfusión sanguínea es el segundo mecanismo de transmisión después de la vectorial, debido al incremento de la migración de personas de las zonas rurales endémicas a zonas urbanas donde no existen los triatominos,3-5 e incluso a zonas rurales no endémicas. De manera que la tripanosomosis americana es otra de las enfermedades sociales o de la pobreza, y en México se podría considerar como un riesgo de salud emergente.6
En países en vías de desarrollo, como el nuestro, la prevención de la transmisión de enfermedades infecciosas a través de la transfusión sanguínea es difícil debido a que las fuentes necesarias para llevar a cabo los estudios no siempre están disponibles, aun cuando existan las políticas y las estrategias adecuadas. Sin embargo, la transmisión de la infección se puede prevenir al seleccionar a los donadores de sangre a través de la aplicación de cuestionarios, y al limitar el número de transfusiones. Las enfermedades infecciosas transmitidas por transfusión pueden estimarse sobre las bases del nivel del tamizaje para cada agente infeccioso en la población donadora; para este fin se utilizan pruebas que se basan en la búsqueda de anticuerpos, lo cual representa la medida más adecuada para eliminar la sangre contaminada.7
El diagnóstico serológico de la tripanosomosis americana en su fase crónica es obligado, ya que es difícil la demostración del parásito en circulación o en los tejidos;6 de igual manera resulta difícil establecer un diagnóstico confirmativo durante las fases asintomáticas o con cuadros clínicos leves, por lo que es importante la estandarización de las pruebas serológicas para demostrar los anticuerpos contra T. cruzi.8,9
La Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización Panamericana de la Salud (OPS) recomiendan que se utilice más de un procedimiento serológico para reducir el error en el diagnóstico.10 La confirmación de un caso indeterminado de tripanosomosis americana por diagnóstico serológico se establece cuando hay al menos dos pruebas serológicas positivas.11 El reconocimiento de donadores de sangre seropositivos a T. cruzi es recomendado como una prueba de rutina en los bancos de sangre, pero el problema práctico que enfrentan los bancos de sangre en el tamizaje de individuos chagásicos es el porcentaje tan variado de muestras que presentan reactividad alrededor del valor de corte. Por tanto, para el tamizaje de donadores de sangre, se recomienda tener un valor de corte lo más bajo posible para asegurar la alta sensibilidad, y de esta forma no tener un gran número de falsos positivos. Para incrementar la eficiencia de la prueba se deben utilizar fracciones puras inmunodominantes de T. cruzi o proteínas recombinantes.12
]]> En este trabajo se estimó la prevalencia de la infección por T. cruzi en donadores del banco de sangre del Hospital General Regional (HGRO) del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) en la ciudad de Orizaba; Veracruz, utilizando como antígenos un extracto crudo de T. cruzi y la proteína recombinante MBP::Hsp70 para el tamizaje de los sueros, encontrándose la presencia de anticuerpos antiT. cruzi por las diferentes técnicas ensayadas en los sueros analizados. Los anticuerpos dirigidos contra la proteína recombinante MBP::Hsp70 reconocen una proteína nativa de 85 kDa en extracto total de amastigotes, epimastigotes y tripomastigotes provenientes de diferentes aislados de T. Cruzi; asimismo, reconocen una proteína en Crithidia luciliae, pero ésta no es compartida por los miembros del género Leishmania.13
Material y métodos
Población de estudio
Se obtuvieron sueros de 500 donadores de sangre del Banco de Sangre del HGRO del IMSS de Orizaba, Veracruz. Dentro de los criterios de selección se incluyeron personas entre 18 y 65 años de edad que presentaran una seronegatividad al virus de la hepatitis B (HBV), de la hepatitis C (HCV), al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), a la Brucella abortus (BrA), al VDRL y al virus de inmunodeficiencia aquirida (VIH).
Las muestras fueron obtenidas entre los meses de octubre de 2001 a enero de 2002; a los donadores que aceptaron participar se les aplicó un cuestionario clínico-epidemiológico sobre datos personales, hábitos y costumbres, tipos de vivienda, manifestaciones clínicas y reconocimiento de los triatominos.
Obtención de sueros
La obtención de las muestras de los donadores de sangre fue colectada de la vena periférica mediante el sistema Vacutainer. De acuerdo con las encuestas realizadas y con los estándares establecidos por el banco de sangre, de las 500 muestras sólo se obtuvieron 420 sueros de hemodonadores para la realización del estudio. El suero fue separado por centrifugación a 1 200 x g durante 10 minutos, alicuotado en tubos eppendorf y congelado a -20 ºC hasta su uso.
Expresión y purificación de la proteína MBP::Hsp70
El fragmento TcHsp70 fue obtenido de la siguiente manera: a partir de una biblioteca de cDNA de amastigotes de T. cruzi en el vector lambda gt11 se obtuvo la clona TcHsp70 mediante el tamizaje con un pool de sueros de pacientes chagásicos.5 Para la obtención de la proteína recombinante MBP::Hsp70 se clonó el fragmento de cDNA TcHsp70 en el sitio Eco RI del vector de expresión pMAL-C2 (New England BioLabs) dando lugar al plásmido pMAL-Hsp70. Este plásmido se utilizó para transformar bacterias E. coli de la cepa DH5-a. Finalmente, la proteína recombinante MBP::Hsp70 (125 kDa) fue inducida y purificada de acuerdo con las instrucciones del proveedor.14
]]> Preparación del extracto crudo de T. CruziLos parásitos (epimastigotes) de la cepa Y de T. cruzi se cultivaron y propagaron en un medio (LIT), suplementado con 10% de suero fetal bovino (GIBCO). Los parásitos en fase logarítmica fueron colectados por centrifugación, la pastilla obtenida se resuspendió en PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM y KH2PO4 1.4 mM, pH 7.4) y fueron sometidos a ciclos de congelación-descongelación para lisar a los parásitos. La concentración de proteína fue determinada por el método de Bradford.
Tamizaje de sueros
Se determinó la presencia de anticuerpos anti-T cruzi en las 420 muestras de suero empleando como prueba tamiz la técnica de ELISA y utilizando como antígeno la proteína recombinante MBP::Hsp70. Se utilizaron placas de fondo plano (Costar) las cuales se recubrieron con la proteína MBP::Hsp70 a una concentración de 2 µg/ml en amortiguador de carbonatos 0.1 M, pH 9.6, y se incubaron durante toda la noche a 4 ºC. Se descartó el antígeno no unido y se bloquearon las placas con 200 µl de PBS las cuales contenían 5% de leche descremada y fueron incubadas durante dos horas a 37 ºC.
Posteriormente se incubaron las placas con 50 µl de cada uno de los sueros de los hemodonadores a una dilución final de 1:50 por triplicado. Se lavaron cuatro veces con PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM y KH2PO4 1.4 mM, pH 7.4), que contenía 0.05% de Tween 20 (PBST). Después de los lavados, se agregó a cada uno de los pozos 50 µl de un anticuerpo cabra antihumano (Zymed) acoplado a peroxidasa a una dilución de 1:1 000 en PBST y fue incubado durante una hora a temperatura ambiente. Después de ocho lavados y uno adicional únicamente con PBS se adicionaron 100 µl de la solución sustrato (citrato de sodio 100 mM pH 4.2, H2O2 0.03%, que contenía 1mg/ml de ABTS [2, 2,-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid] (Zymed); después de 10 minutos, las placas fueron leídas a 415 nm en un lector de ELISA (Multyscan Lab System). Los sueros positivos fueron sometidos a un segundo tamizaje utilizando como antígenos un extracto crudo de epimastigotes de T. cruzi (ECE) y la proteína MBP::Hsp70. El valor de corte (vc) para este ensayo se estableció mediante la media obtenida de una muestra de 25 sueros de sujetos sanos más cuatro desviaciones estándar. Para el caso de la proteína MBP::Hsp70, el valor de corte se fijó en 0.230 U de densidad óptica (DO), mientras que para el ECE, en 0.215 U de DO. Los sueros que arrojaron resultados positivos mediante la prueba ELISA, fueron procesados para la determinación de anticuerpos contra T. cruzi empleando otras dos pruebas serológicas diferentes (WB y IFI).
Western blot con sueros de hemodonadores (WB)
200 µg de la proteína MBP::Hsp70 y de ECE de T. cruzi (cepa Y) fueron separados electroforéticamente en geles de poliacrilamida-SDS al 10% en presencia de un amortiguador de muestra (Glicerol 2%, SDS 4%, Tris-HCl 50 mM pH 6.8, b-ME 200 mM, azul de Bromofenol 0.2%),15 y transferidos a papel de nitrocelulosa (BIO-RAD) para su inmunodetección.16,17 Los sueros de cada individuo fueron utilizados como anticuerpos primarios a una dilución de 1:100 en TBS-T (NaCl 150 mM, Tween 20 0.05 %, leche descremada 2%, y Tris-HCl 10 mM pH 7.4). Los anticuerpos unidos a la membrana fueron detectados utilizando un segundo anticuerpo IgG cabra antihumano conjugado a fosfatasa alcalina (Pierce) a una dilución de 1:5 000 y luego revelado con NBT (nitroazul de tetrazolium) y BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato) (sigma).
Las muestras fueron consideradas positivas cuando se observó por lo menos una banda de reconocimiento diferente a la del control de segundo anticuerpo (2º Ab).
Ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Los sueros que arrojaron resultados positivos mediante la prueba de ELISA fueron procesados por IFI de acuerdo con lo descrito por Ramos-Echevarría y colaboradores.18 Brevemente, se colocó en un portaobjetos una suspensión de epimastigotes de la cepa, se fijaron los parásitos, y los sueros de los donadores y los controles fueron diluidos 1:50 en PBS e incubados por 30 minutos en cámara húmeda. Posteriormente, los portaobjetos fueron lavados e incubados con el segundo anticuerpo anti-IgG humano conjugado a fluoresceína a una dilución de 1:20 durante 30 minutos a 37ºC. Después de la incubación, los portaobjetos fueron observados en un microscopio de epifluorescencia. La presencia de una fluorescencia verde sobre los parásitos fue considerada como prueba positiva. Las muestras positivas se marcaron con una +/+++ de acuerdo con el grado de fluorescencia observado, utilizando como punto de referencia un control positivo.
]]> En todos los ensayos serológicos se utilizó como control positivo un pool de sueros de pacientes chagásicos y como control negativo sueros de humanos normales.
Resultados
La población estudiada tuvo las siguientes características: 420 donadores voluntarios en edad reproductiva (entre 18 y 65 años), de los cuales 402 (95.7%) eran hombres y 18 (4.3%) mujeres, con una edad promedio de 35.4 años, y con un promedio de 20.3 años de residencia. 173 (41.3%) provenían de la ciudad de Orizaba, 62 (14.8%) de Ixtaczoquitlán, 62 (14.8%) de Río Blanco, 37 (8.8%) de Ciudad Mendoza, 31 (7.4%) de Córdoba, 31 (7.4%) de Nogales, 12 (2.8%) de Tezonapa, 6 (1.4%) de Ixhuatlancillo y 6 (1.4%) de Amatlán de los Reyes, Veracruz. 25.5% (107) eran empleados, 13.6% (57) obreros, 11.2% (47) profesionistas, 9.5% (40) se dedicaba al comercio, 7.6% (32) al campo, 6.9% (29) eran estudiantes, 4.3% (18) se dedicaba a labores del hogar y 21.4% (90) a otras actividades. 89% (374) habitaba en viviendas con pared de ladrillos y 11% (46) en casas con paredes de lámina. 70.4% (296) habitaba en viviendas con techo de lámina de asbesto, 6.6% (28) en casas con techo de teja y 23% (96) de concreto; 100% habitó en viviendas con piso de cemento. 42% (177) convivió con animales domésticos (perros y gatos) y sólo 7.1% (30) reconoció a los triatominos.
Detección de anticuerpos por ELISA
Los 500 sueros que se obtuvieron de los donadores de sangre se probaron de forma rutinaria para la presencia de anticuerpos contra HBV (1.6%), HCV (0.2%), BrA (2.6%), VDRL (0.2%) y VIH (0), de los cuales 80 sueros resultaron positivos para la presencia de estos antígenos y, por lo tanto, fueron eliminados, por lo que quedaron únicamente 420 sueros (cuadro I). El tamizaje de los 420 sueros de los hemodonadores se llevó a cabo mediante ensayos de ELISA, y se utilizó como antígeno la proteína recombinante MBP::Hsp70. El tamizaje se realizó por triplicado de acuerdo con lo descrito en Materiales y métodos. Los sueros que resultaron discordantes en sus lecturas se procesaron nuevamente para determinar el resultado definitivo. Con el valor de corte obtenido para la proteína MBP::Hsp70 se descartaron 384 sueros (dato no mostrado) por lo que quedaron solamente 36 muestras, a las cuales se les realizó un segundo tamizaje por el método de ELISA, para el que se utilizaron las diluciones de 1:50, 1:100 y 1:200 de cada uno de los sueros problema.
]]> Dado que con todas estas diluciones se tenía el mismo resultado, se decidió trabajar con la dilución de 1:200 (dato no mostrado). Los 36 sueros seleccionados en el primer tamizaje fueron sometidos a un segundo tamizaje, para el que se utilizaron como antígenos un ECE y la proteína MBP::Hsp70. Los sueros fueron diluidos 1:200; se incluyó además un control de segundo anticuerpo (antihumano-peroxidasa), la lectura obtenida con este control se restó al valor obtenido para cada una de las 36 muestras de suero, en donde sólo 16 (3.8%) de los 420 sueros resultaron positivos contra ECE (figura 1A) y 11 (2.62%) contra la proteína MBP::Hsp70 (figura 1B), ya que estos sueros dieron valores por arriba del valor de corte. Cuando se utilizó la proteína recombinante se observó la presencia de cinco falsos positivos, ya que los sueros 3 (donador 32), 4 (donador 78), 7 (donador 105), 19 (donador 209) y 26 (donador 238) reaccionaron contra ECE pero no contra la proteína MBP::Hsp70 (cuadro II).
Los sueros que resultaron positivos (valores de DO arriba del valor de corte) por la prueba de ELISA fueron sometidos a la prueba de Western blot e IFI para confirmar la presencia de anticuerpos antiT.cruzi.
Western blot con sueros de hemodonadores
Para confirmar la positividad de 36 de las 420 muestras ensayadas por el método de ELISA, se realizaron pruebas de Western Blot; se utilizaron como antígenos la proteína recombinante MBP::Hsp70 purificada (figura 2A ) y ECE (figura 2B ) de una cepa de referencia de T. cruzi, los cuales se separaron electroforéticamente y se transfirieron a papel de nitrocelulosa; de acuerdo con lo descrito en los Materiales y métodos, se utilizó una dilución de 1:100 de los sueros de los hemodonadores y de los controles positivos y negativos.
En la figura 2, se observa el reconocimiento de los sueros, en donde los sueros 32 (carril 3), 78 (carril 4), 80 (carril 5), 105 (carril 7), 138 (carril 16), 196 (carril 18), 209 (carril 19), 223 (carril 24), 232 (carril 25), 238 (carril 26) y 362 (carril 33) reconocen bandas en el ECE que son diferentes a las bandas observadas en el control de segundo anticuerpo (2º Ab), mientras que los sueros de los carriles 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 20 no pueden considerarse positivos ya que reconocen las mismas bandas que el control de 2º Ab (figura 2B); el patrón de reconocimiento de los sueros por las proteínas fue muy variado y reconocen de 1-15 bandas en el ECE. Sin embargo, de todos estos sueros únicamente el suero 196 (carril 18) reconoce a la proteína MBP::Hsp70; por lo tanto, sólo 11 (2.62%) de los 420 sueros reconocen por lo menos una banda en ECE (figura 2B) y sólo 1 (0.24%) reconoce a la proteína MBP::Hsp70 (figura 2A).
]]> Inmunofluorescencia indirecta con sueros de hemodonadoresDebido a las discrepancias observadas en el reconocimiento de los sueros en los ensayos de ELISA y WB, se decidió realizar una tercera prueba serológica recomendada por la OMS y por la OPS. Los 36 sueros de los donadores que resultaron positivos mediante ELISA fueron utilizados para confirmar la presencia de anticuerpos antiT. cruzi por ensayos de IFI, de los cuales solamente dos sueros resultaron positivos (donadores 127 y 196) por la técnica de IFI, lo cual resulta en una prevalencia final de 0.48% (cuadro II).
Discusión
La transfusión sanguínea es una de las formas de transmisión de la enfermedad de Chagas y es considerada como la segunda vía de adquisición de la infección.19 La infección por T. cruzi no es autolimitante, y todo individuo infectado representa un reservorio potencial del parásito. De esta forma, la alta prevalencia de la infección en áreas que experimentan altos índices de migración representa un riesgo en la diseminación del parásito, y justifica de forma importante la realización de estudios adicionales sobre el riesgo que representa la transmisión de T. cruzi por transfusión sanguínea en México.20
El diagnóstico etiológico de la tripanosomosis americana está basado en la presencia de anticuerpos contra el parásito protozoario T. cruzi en el suero de individuos infectados. Estos anticuerpos se han detectado principalmente empleando diferentes pruebas serológicas; de estas pruebas convencionales, las más ampliamente utilizadas son las de HAI, IFI y ELISA, debido a su simplicidad, bajo costo y a los buenos resultados que arrojan en términos tanto de especificidad como de sensibilidad. Todas estas técnicas se basan en el empleo de fracciones antigénicas semipurificadas o totales de epimastigotes de T. cruzi. La inclusión de antígenos recombinantes y péptidos sintéticos para el diagnóstico serológico de la infección por T. cruzi ha mostrado avances en términos de la especificidad, además tiene la ventaja de que pueden purificarse fácilmente y en cantidades considerables con un alto grado de pureza.21 Los antígenos recombinantes son más específicos que los extractos del parásito, ya que estos últimos pueden presentar una reacción cruzada con sueros de pacientes con otras enfermedades tales como la leishmaniasis22 o la infección con Trypanosoma rangeli.23 En este estudio se utilizaron la proteína recombinante MBP::Hsp70, anteriormente llamada pMalE635 y tres pruebas serológicas diferentes (ELISA, WB e IFI) para determinar anticuerpos antiT. cruzi en 420 muestras séricas de hemodonadores. A todas las muestras se les detectaron primero anticuerpos contra T. cruzi con la prueba tamiz de ELISA, debido a que presenta una alta sensibilidad. La proteína MBP::Hsp70 se utilizó para el diagnóstico, ya que no presenta reacción cruzada contra otros tripanosomátidos y además se encuentra expresada en todos los estadios de T. cruzi,13 así como un extracto crudo de epimastigote (ECE). Con esta técnica se obtuvieron 16 positivos de 420 (16/420) cuando se utilizó como antígeno ECE, mientras que con MBP::Hsp70, solamente 11 positivos (11/420), en donde los sueros 32, 78, 105, 121 y 238 tienen valores cercanos al valor de corte (cuadro II). Los resultados obtenidos con la prueba tamiz pueden indicar que la detección de casos con títulos muy bajos de anticuerpos y cercanos al límite de detección de la prueba resulta un problema, ya que al ajustarlas a alta sensibilidad se incrementa el riesgo de falsos positivos, como informan Sosa-Jurado y colaboradores,6 pues las muestras discordantes se ubicaron en valores cercanos al límite de detección de la prueba. Por esta razón, las muestras fueron sometidas a análisis mediante Western blot contra ambos antígenos. Esta técnica ha sido empleada también por otros investigadores;5,24,25 aunque esta prueba no se utiliza de rutina, representa una buena prueba secundaria, pues es rápida y fácil de realizar, además de que no se necesita equipo especial y los datos pueden ser leídos visualmente o por densitometría. No se considera como un sustituto para la serología convencional, pero se puede utilizar como una prueba alternativa y complementaria para la confirmación de la tripanosomosis americana.24
Mediante esta técnica se obtuvieron 11 positivos de 420 cuando se utilizó como antígeno el ECE y solamente un positivo contra la proteína MBP::Hsp70 (donador 196); sin embargo, las muestras positivas por ELISA no fueron las mismas que se detectaron por la técnica de WB. Estas diferencias pueden deberse al tipo de anticuerpo detectado, puesto que en la prueba de ELISA se reconocen generalmente anticuerpos dirigidos contra conformación (epitopos conformacionales), mientras que en los ensayos de WB se reconocen anticuerpos dirigidos contra secuencia (epitopos lineales) puesto que el antígeno se encuentra desnaturalizado.26,27Aunado a esto, Schechter y Nogueira informaron que pueden exisitir variaciones en el perfil de antígenos de superficie de T. cruzi cuando los extractos se preparan por diferentes metodologías.28 La variación en la composición antigénica de los parásitos asociados a la respuesta inmune de cada individuo puede dar como resultado la activación de diferentes clonas de linfocitos y por lo tanto la producción de anticuerpos con diferentes especificidades.29 Debido a estas diferencias, se realizó una tercera prueba serológica distinta pero de igual sensibilidad que la prueba de ELISA, como es el caso de la prueba de IFI, en donde únicamente los sueros 127 y 196 resultaron positivos, ambos de sexo masculino. La muestra 127 proviene de un individuo que vive en Ixhuatlancillo y la muestra 196 de un individuo proveniente de Ixtaczoquitlán; en este último municipio se ha registrado la presencia del vector (T. dimidiata).30 La edad promedio de los casos positivos fue de 43.5 años y ninguno de ellos reconoció a los triatominos.
Los resultados obtenidos mediante los análisis de ELISA, Western blot e IFI muestran una seropositividad para T. cruzi de 0.48% (2/420).Estos resultados concuerdan con los datos obtenidos en 1999 por el grupo de Monteón-Padilla y colaboradores,5 en donde emplearon el mismo antígeno recombinante MBP::Hsp70 (pMal-E63). Dicho estudio obtuvo una seropositividad de 0.30% en pacientes del banco de sangre del Instituto Nacional de Cardiología en la ciudad de México, más alta aún que para VIH, VDRL, hepatitis B y C. Existen informes que expresan la necesidad de llevar a cabo una evaluación de la distribución y la prevalencia de esta infección en México.4,19,31 De igual manera, en un estudio realizado con 65 000 donadores de sangre provenientes de 18 centros de transfusión gubernamental se mostró una prevalencia de anticuerpos antiT. cruzi de 1.5%, en donde la mayor prevalencia se encontró en la Huasteca y en el sureste de México.4 Sánchez-Guillén y colaboradores32 registraron una prevalencia de anticuerpos antiT. cruzi de 8.5% y de 9% con las técnicas de IHA y ELISA, en bancos de sangre de las clínicas y hospitales del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) en la ciudad de Puebla.32 En todos estos estudios se propone la realización rutinaria del tamizaje serológico de donadores de sangre por medio de técnicas inmunológicas con alta sensibilidad y especificidad para reducir el riesgo de contaminación por transfusión sanguínea. En los últimos años, en México se ha aprobado una ley para el tamizaje de muestras que permite determinar la presencia de anticuerpos antiT. cruzi, así como programas de vigilancia epidemiológica en diversas partes del país; sin embargo, en algunas entidades todavía no se llevan a cabo.
Si bien la ciudad de Orizaba, Veracruz, no es un punto crítico de interés económico para el país, experimenta una tasa de migración alta debido a la cercanía de zonas rurales tales como Zongolica, Tequila, Tuxpanguillo, La Perla y Jalapilla, entre otras 11 localidades, además de ser el paso obligado de inmigrantes de Centro y Sudamérica hacia el norte del país, quienes al igual que la población estudiantil que arriba a esta ciudad desde diferentes puntos del estado de Veracruz, constituyen un flujo de migración importante. Los resultados que arroja este trabajo indican que la infección está presente y sugieren que existe un riesgo de contaminación por transfusión sanguínea; asimismo, reiteran a ésta como una vía para la transmisión de la enfermedad de Chagas. Además, recientemente, a través de campañas de control vectorial realizadas por la VII Jurisdicción Sanitaria, se han capturado ejemplares de Triatomas en domicilios de la región (Ixtaczoquitlán, Ayojapa I y II, Chicomapa, San Vicente, El Palmar, Mochichino, Tuxpanguillo, Tezonapa, Ixhuatlancillo, etc.) con infección natural, lo cual indica la posibilidad de la transmisión vectorial del parásito. Con base en estos hallazgos y en la amplia heterogeneidad de los estudios realizados en México, está claramente demostrado que la enfermedad de Chagas está presente en varias áreas del país, por lo cual es necesario contar con mayor información sobre la biología y epidemiología de la infección, así como de los reservorios identificados, y por otra parte identificar si los reservorios pueden influenciar en la virulencia del parásito y de su transmisión en la región, para que permitan un mejor desarrollo de estrategias que aseguren la disminución del riesgo de infección y garanticen la calidad de vida de los habitantes de esta región.
Finalmente, el empleo de varias técnicas serológicas asegura la confiabilidad de los resultados; se recomienda la inclusión de antígenos recombinantes para el diagnóstico de la infección por T. cruzi si se realiza en paralelo con una prueba convencional, como es el caso de la prueba de ELISA y de IFI, con lo que se puede obtener la especificidad deseada con el antígeno recombinante y la sensibilidad requerida empleando un extracto crudo del parásito.21
]]> AgradecimientosAl personal del Banco de Sangre del Hospital General Regional de Orizaba del IMSS por su asistencia técnica para la obtención de las muestras empleadas en este trabajo. A la Dra. Elena Rustrían Portilla por la revisión crítica de la propuesta, y a la Biol. Lidia Baylón Pacheco por su ayuda en la realización de las inmunofluorescencias.
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Fecha de recibido: 9 de diciembre de 2004
Fecha de aprobado: 28 de octubre de 2005
Solicitud de sobretiros: Dra. Aracely López Monteon. Universidad Veracruzana, Facultad de Ciencias Químicas, LADISER Inmunología y Biología Molecular. Prolongación Oriente 6, No. 1009, Col. Rafael Alvarado, Orizaba, Veracruz, México. Correo electrónico: aralopez@uv.mx
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