Infección por virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en pacientes pediátricos de México
José Guillermo Vázquez Rosales*
Fortino Solórzano Santos*
Ma. Teresa Alvarez Muñoz**
Gustavo Sanchez Huerta
Ma. Guadalupe Miranda Novales*
**Laboratorio de Virología de la Coordinación de Investigación en Salud del Instituto Mexicano del Seguro Social.
Reimpresos
Dr. José Guillermo Vázquez Rosales
Servicio de Infectología del Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social.
Av. Cuahutémoc 330. Col. Doctores. 06720. México, D.F.
Fax. (55) 5627-6949
Correo electrónico: vazguill@aol.com
A partir de 1985 con la primera descripción en México de niños infectados con el VIH-1, se han reportado casos en todos los estados de la República, afectando todos los estratos de la edad pediátrica. 1 La epidemiología de la infección ha variado durante estos años, al inicio de la epidemia un porcentaje importante de los pacientes pediátricos fueron sujetos receptores de transfusiones múltiples, como los hemofílicos, sin embargo, con la aplicación de nuevos métodos de escrutinio en donadores sanguíneos, esta proporción se ha reducido en forma notable y en los últimos 5-7 años la principal causa de infección es la transmisión vertical. 2
ETIOLOGÍA
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida es causado por el virus de inmunodeficiencia humana. Este retrovirus pertenece al género lentivirus, el cual se caracteriza por causar una patología lenta en los organismos infectados. Los lentivirus de primates (HIV y el virus de inmunodeficiencia simiana SIV) se caracterizan por su tropismo por linfocitos CD4+, lo cual no es presentado por lentivirus de otras especies. 3
La hipótesis más plausible sobre el origen del VIH es que proviene de virus simianos, dado que existe una estrecha relación genética entre el VIH-1 y el virus de la inmunodeficiencia del chimpancé (84% de homología en la secuencia genética). Posiblemente posterior a la infección de aborígenes africanos en su hábitat natural, diversos eventos sociodemográficos llevaron al virus a concentraciones urbanas, de donde quizá por el comercio de sangre y derivados se extendió a países desarrollados. Esto es apoyado por la presencia de anticuerpos contra el VIH en un suero preservado desde 1959 proveniente de Kinshasa, Uganda. 4
En 1983, poco después de la descripción del SIDA, su origen infeccioso se hizo patente al aislarse en el Instituto Pasteur un retrovirus de un cultivo de linfocitos T activados provenientes de una biopsia de ganglio linfático de un paciente homosexual con linfadenopatía. Antigénicamente este virus se encontró más relacionado con lentivirus animales que con los virus de leucemia de células T (HTLV), sin embargo, se denominó inicialmente HTLV-III. 5
Poco después diversos estudios epidemiológicos demostraron, particularmente en transmisión por productos sanguíneos, la asociación entre el VIH, el donador y el receptor.
Actualmente, según su afinidad genética, el VIH-1 se ha subdividido en dos genotipos: M y O. A su vez el grupo M tiene diferentes subtipos: A, B, C, D, E, F, G, H e I, los cuales tienen una distribución genográfica característica, así en Norte y Sudamérica predomina el genotipo B. 6,7
]]>EPIDEMIOLOGÍA
El SIDA en México afecta mayoritariamente a la población de uno y otro sexos en edad productiva (15-44 años), sin embargo, 2.4% corresponden a menores de 15 años. La infección por el VIH puede adquirirse por transmisión sexual, por transfusión de sangre o sus derivados, mediante agujas contaminadas con sangre como ocurre en adictos a drogas intravenosas o en accidentes de trabajo en personal de salud y en forma vertical de madres infectadas a sus productos, en las fases de parto o in utero . En México, la transmisión sexual ha sido la causante de 86.7% de los casos acumulados de SIDA, de los cuales 61.8% corresponden a hombres que tienen sexo con otros hombres y 38.2% heterosexuales. El 10% se originó por vía sanguínea, y 2.0% por vía perinatal, esto último como consecuencia de la infección en mujeres de edad reproductiva que en México alcanza una prevalencia menor a 1%. 8
Los primeros casos de SIDA en niños se describieron en 1982 en Estados Unidos de América 9 y desde entonces se ha incrementado en forma notable el número de casos existentes, reportándose por la ONU para el año 2002 la presencia de tres millones de casos en forma mundial. A éstos deben sumarse los casos no registrados, subdiagnosticados o con demora en su notificación.
El primer caso de SIDA pediátrico en México fue diagnosticado en 1985 en el Hospital Infantil de México y publicado en 1986. Se trató de una adolescente del sexo femenino con antecedente de transfusión en 1981 y que desarrolló inmunosupresión tres años después. 1 Para 1988 se habían reportado 1,126 casos totales de SIDA en México, de los cuales 3.8% correspondía a menores de 15 años. 10 Desde entonces el porcentaje representado por los pacientes menores de 15 años ha disminuido gradualmente, reportándose para finales del año 2002, 1.1% del total de pacientes notificados con esta infección. Para ese año el número total de pacientes pediátricos infectados en forma acumulada fue de 1,400. 8
En EUA, a finales de la década de los 90, se consideró que 80% de los pacientes menores de 13 años de edad habían sido infectados en forma vertical, mientras que el resto habían sido infectados mediante la transfusión de sangre y sus derivados. 11 Sin embargo, en México, Avila y cols. reportaron, en 1989, que de 86 menores de 15 años infectados, 50% lo habían sido por transfusión de sangre y derivados, 47% por transmisión vertical y 3% vía sexual. 12 Actualmente en una reciente revisión de casos en el Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI del IMSS, se encontró que 85% de los pacientes con infección por VIH-1 lo habían adquirido en forma vertical y 10% en forma horizontal a través de sangre y productos sanguíneos contaminados. 13 Es indudable que estos porcentajes variarán según los distintos grupos sociales estudiados, así en sectores carentes de seguridad social es probable que la transmisión sexual y por el uso de drogas endovenosas sean vías con mayor prevalencia.
FISIOPATOGENIA
Típicamente la historia natural de la infección por VIH-1 transcurre en un lapso de 10-12 años, durante los cuales pueden establecerse arbitrariamente tres etapas: infección primaria, fase crónica asintomática y desarrollo de SIDA. En los niños infectados verticalmente estas etapas son menos evidentes y quizá más cortas que en los niños mayores o adultos infectados por las vías sexual o parenteral.
Hasta el momento no se ha reportado infección de las células sexuales humanas y se desconoce el tiempo exacto en el cual algunos productos son infectados. Sin embargo, el semen contiene leucocitos, incluyendo granulocitos, macrófagos y células CD4+ que juegan un papel importante en la transmisión del virus hacia la mujer. El mismo se ha cultivado y analizado de muestras provenientes de exudado vaginal y del cervix, haciendo posible la exposición del óvulo y del producto recién implantado a partículas virales viables. 14 La transmisión trasplacentaria pudiera ocurrir tempranamente durante la gestación en algunos casos, habiéndose detectado el virus en fetos de 13-20 semanas, incluyéndose muestras de tejido neural, células sanguíneas del cordón umbilical y otros tejidos. 9
]]> Varios estudios han mostrado factores de riesgo que facilitan la transmisión vertical del VIH-1, incluyendo maternos, obstétricos y del producto en sí. 15 En algunos se ha mencionado cuenta baja de leucocitos CD4+ maternos, niveles bajos de anti-HIV-1 p24 en la madre, niveles altos de RNA viral en el plasma materno, así como crioamnioitis y peso bajo del producto. 16 Sin embargo, se ha demostrado la carga viral materna como el factor más importante, existiendo transmisión a cualquier nivel de carga, pero incrementándose la probabilidad a medida que se incrementa la concentración viral en el plasma materno. 17 Por otra parte, en aquellas mujeres con concentraciones de RNA viral por abajo del límite de detección de los ensayos actualmente utilizados, la transmisión se reduce prácticamente a menos de 1%. 18Modelos animales de la transmisión del virus de inmunodeficiencia simiana han permitido conocer los primeros eventos en la transmisión del VIH-1. En este modelo, las células dendríticas de la lamina propria del epitelio vaginal, son el principal objetivo inicial del VIH-1. Éstas constituyen un sistema altamente eficiente y complejo de células presentadoras de antígenos, ya que en su superficie tienen una importante expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y II, lo que les proporciona la habilidad de atraer y estimular a linfocitos T inmaduros. Así, estas células juegan un papel clave tanto en la estimulación inicial de linfocitos como en el acarreo de partículas virales hacia el órgano linfático más cercano. 19 Por otra parte, el análisis de las cepas de HIV-1 en los sujetos con primoinfección ha permitido conocer que los virus macrofagotrópicos son los más frecuentemente transmitidos, hasta en 95%. Este fenómeno está en relación con el tipo de correceptores presentes en las células de Langerhans, los cuales son de tipo CCR5 y que les confiere una capacidad única de activación y reclutamiento de linfocitos T CD4+ activados y, por tanto, la diseminación de este tipo de cepas hacia los órganos linfoides. 20 Estos eventos suceden antes de la aparición de una respuesta inmune específica y efectiva, lo cual confiere ventajas al VIH-1, habiéndose encontrado replicación viral en plasma a los cinco días después del inicio de la infección.
En niños con transmisión vertical, alrededor de 70% son infectados tardíamente durante el embarazo o bien durante el parto y el RNA viral sólo es detectado en plasma posterior a la primera semana de nacimiento. Del resto, un porcentaje importante tiene una posible infección intrauterina, ya que el RNA es detectado en el plasma del producto dentro de las primeras 48 horas de vida. 21 La concentración del virus en sangre es inicialmente baja en aquellos infectados cerca del nacimiento, se eleva en los siguientes dos meses de vida y disminuye posteriormente. Esto contrasta con la caída abrupta en adultos y demuestra quizá la inmadurez del sistema inmune.
Estudios de hibridación han mostrado que en forma paralela al plasma, los ganglios linfáticos muestran numerosas células con expresión de RNA viral, lo que indica que estos órganos son los sitios primarios de infección. Durante la fase crónica de la infección este patrón de hibridación se modifica, ya que los virus son atrapados en la red de células dendríticas foliculares, coincidiendo con una caída en la concentración de partículas virales circulantes. 19 Es probable que el inicio de la respuesta inmune celular mediada por citotoxicidad y la respuesta humoral, sean responsables de esta limitación inicial de la infección por VIH-1.
Sin embargo, este éxito inicial es en mayor o menor tiempo superado por la capacidad viral para evadir al sistema inmune, habiéndose propuesto mecanismos virales e inmunológicos para explicar este fenómeno. Entre los primeros se encuentran:
1. La formación de un fondo de linfocitos T CD4+ infectados en forma latente, que contienen virus capaces de replicarse y que están fuera del alcance del sistema inmune y del tratamiento farmacológico.
2. La elevada variabilidad genética secundaria a una transcripción defectuosa del VIH-1, hace que exista una rápida mutación en epitopos reconocidos por células citotóxicas específicas, perdiendo por lo tanto efectividad a la respuesta inmune.
3. La formación de complejos inmunes con anticuerpos específicos y su adhesión a las células dendríticas que son tomados como reservorios y fuente continua de infección de linfocitos CD4+.
Además de estas características del virus en sí, existen alteraciones inmunológicas que explican la evasión del virus a su acción, como son:
a) Eliminación de clonas de linfocitos T CD4+ específicos para VIH-1, las cuales son infectadas tempranamente durante la infección primaria.
]]> b) Disminución secundaria de clonas de linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos para VIH, que requieren del estímulo de las primeras.c) Evasión de virus mutantes mediada por las mismas células citotóxicas.
d) Redistribución de células citotóxicas fuera de los ganglios linfáticos, en donde durante la primoinfección existe gran concentración viral.
e) Deficiente función en las células presentadoras de antígenos y, por lo tanto, interferencia en la respuesta de anticuerpos neutralizantes.
En los estadios terminales de la enfermedad existe una gran alteración en el sistema inmune, la cual es evidenciada por las alteraciones presentes en los ganglios linfáticos como: involución folicular, hipervascularidad y fibrosis con desaparición de células dendríticas foliculares. La habilidad para establecer una respuesta inmune contra nuevos antígenos, así como una respuesta de memoria están severamente alteradas en ausencia de una red de células dendríticas foliculares. Esta pérdida de la capacidad para iniciar y mantener una respuesta inmune lleva a una inadecuada supresión de la replicación viral y a un incremento en la susceptibilidad de infecciones oportunistas. 22
DIAGNÓSTICO
No es posible establecer el diagnóstico de infección por VIH-1 con base en parámetros clínicos únicamente, sin embargo, la identificación temprana de ciertos factores de riesgo puede hacer sospechar la presencia de esta infección en niños pequeños. Los principales factores de riesgo encontrados en la edad pediátrica son:
1. Transfusión con sangre o productos sanguíneos, principalmente si ésta se efectuó antes de la década de los 90.
2. Madre infectada por VIH-1, con antecedentes de promiscuidad, prostitución o uso de drogas endovenosas.
]]> 3. Madres con parejas sexuales usuarios de drogas endovenosas, bisexuales.4. Abuso sexual.
Sin embargo es común que no se encuentren en forma inicial ninguno de estos antecedentes. 11
Si bien el diagnóstico de infección por VIH-1 está basado en criterios de laboratorio, la OMS ha creado un algoritmo clínico de diagnóstico de infección por VIH, que se basa en la identificación de dos signos mayores y al menos dos signos menores de los siguientes para la sospecha diagnóstica: 23
Signos mayores
a) Pérdida ponderal o falla para crecer.
b) Diarrea crónica mayor de un mes.
c) Fiebre prolongada mayor de un mes.
]]> Signos menores
a) Adenomegalia generalizada mayor de 0.5 cm en dos o más sitios, considerándose linfadenopatía bilateral como un solo sitio.
b) Candidiasis orofaríngea.
c) Infecciones comunes repetidas.
d) Tos persistente durante más de un mes.
e) Dermatitis generalizada.
f) Infección materna confirmada por VIH.
Desde 1994 el Centro para el Control de Enfermedades de Atlanta estableció un sistema de estadificación clínico-inmunológico. 24 La situación clínica se expresa en letras: N, A, B, C, que representan estadios de menor a mayor severidad (Cuadro 1). La situación inmunológica basada en el porcentaje de células CD4+ se expresa mediante números: 1, 2, 3, que representan estadios de deterioro de la función inmune de menor a mayor (Cuadro 2).
A menor número de células CD4+ se considera que la infección por VIH progresa y el pronóstico es menos favorable que en pacientes con un número normal de estas células. El estadio más favorable sería aquellos pacientes que están asintomáticos y sin deterioro del sistema inmune (N1), como se señala en el cuadro 3.
El espectro de enfermedad en la infección por VIH-1 es amplio, variando desde la infección asintomática hasta infecciones graves por microorganismos habituales o por oportunistas.
]]> La edad a la cual la mayoría de los pacientes en nuestro país son atendidos en unidades hospitalarias es posterior a los dos años, sin embargo, en los últimos cinco años el promedio de edad en nuestro hospital fue de cuatro meses, lo que de alguna manera indica la sensibilidad de los médicos para el diagnóstico. 2,13 Aproximadamente 50% de los pacientes en este momento se encuentran en categorías B y C, presentando de 30-40% hepatomegalia, 25% esplenomegalia y entre 25-30% adenomegalia. El grado de desnutrición al momento del diagnóstico es variable, sin embargo, en México se ha reportado hasta 66% de desnutrición con un déficit ponderal mayor de 25%. 2,12,25 De las infecciones oportunistas más frecuentes se encuentran: candidiasis orofaríngea, tuberculosis pulmonar y neumonía por P. carinii . La neumonitis intersticial linfoidea es común en niños pequeños y se ha reportado hasta en 40% de los pacientes pediátricos. Se presenta como una enfermedad intersticial crónica, en la cual los niños desarrollan un infiltrado reticulonodular bilateral difuso y progresivo. Histológicamente se observan agregados nodulares peribronquiales, algunos con centros germinativos, así como infiltrado linfoplasmocitario en los tabiques alveolares y peribronquiales. Clínicamente, se manifiesta por taquipnea, tos, sibilancias e hipoxemia. El diagnóstico debe realizarse mediante la búsqueda del microorganismo en aspirado bronquial o por biopsia pulmonar. 26
Ensayos de laboratorio para el diagnóstico de infección
Al contrario de lo que sucede en pacientes adultos, en donde la sola determinación de anticuerpos apoya el diagnóstico de infección por VIH-1, en niños hijos de madres infectadas, es necesaria la búsqueda del virus, antígenos o del material genético del mismo. Sin embargo, los marcadores subrogados para el monitoreo del tratamiento son los mismos que los utilizados en los pacientes adultos.
Serología
A principios de los años 80, el aislamiento del VIH-1 permitió su crecimiento en cultivos celulares, así como el uso de lisados de células infectadas como base de sistemas de detección de anticuerpos en plasma por el método de ELISA. Esta denominada primera generación de ELISA demostró su utilidad en el escrutinio de muestras sanguíneas provenientes de bancos de sangre en EUA, sin embargo, su especificidad era sólo de 80-90%, lo que llevaba a una importante reducción de unidades sanguíneas disponibles y a problemas emocionales en los individuos con resultados falsos positivos.
Una segunda generación de ELISA fue diseñada utilizando diferentes moléculas recombinantes del VIH-1, que variaron su sensibilidad según el periodo de infección en el cual se aplicaban, pero que en general su especificidad mejoró notablemente. 27
La tasa de pruebas falsas positivas por el método de ELISA en poblaciones con una baja prevalencia de infección es de 1/135,000 o 0.0007%. La frecuencia de resultados falsos negativos en una población de alto riesgo (uso de drogas endovenosas con una seroprevalencia de 30%) es de 0.3% y en poblaciones con bajo riesgo (donadores sanguíneos) de aproximadamente 0.001%.
La principal causa de pruebas falsas negativas es la ausencia de anticuerpos o niveles muy bajos de los mismos en sujetos que se encuentran en el periodo entre la infección y la seroconversión, que tiene una duración aproximada de 10-12 días. Otras causas descritas son agamaglobulinemia o infección por virus con determinantes antigénicos diferentes, como el VIH-2 o el genotipo O del VIH-1. 7
]]> El criterio diagnóstico de infección por VIH-1 incluye una reacción positiva de ELISA y su confirmación mediante Western Blot (WB).Esta última prueba está basada en una separación de proteínas proveniente de lisados de cultivos celulares infectados con VIH-1 y el análisis de diferentes anticuerpos específicos para algunos de estos componentes.
En general, al romperse las células infectadas, existe liberación de virus y componentes virales que al purificarse son sometidos a electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida, que permite una separación de acuerdo con el peso molecular de las diferentes proteínas. Así las proteínas más pequeñas como p17 y p24 migran a mayor distancia, mientras que las grandes (gp160/120) permanecen cerca del origen. Posteriormente dichas proteínas son transferidas a papeles de nitrocelulosa, que son cortados en pequeñas tiras que al ponerse en contacto con anticuerpos específicos del suero permiten su unión. Dicha unión es posteriormente revelada por anticuerpos anti-IgG humana marcados con una enzima que produce coloración de las bandas.
Los criterios de interpretación del ensayo en cuanto al número de bandas dependen del fabricante, sin embargo, se considera en general que deben existir anticuerpos contra proteínas provenientes de los tres principales genes : gag, pol y env . Así la Cruz Roja Americana define como una reacción positiva la presencia de anti-p24, anti-gp41 o anti-gp160 y anti-p31, una reacción indeterminada es aquella en la cual sólo se encuentra una banda o más, pero que no llenan el criterio anterior. En este caso está indicado el realizar repeticiones cada 2-3 meses.
La sensibilidad reportada por el Centro para el Control de Enfermedades en EUA, es de 99.3% y especificidad de 99.7%.
El reporte más común de una prueba indeterminada consiste en una prueba de ELISA positiva y una sola banda detectada en el WB. Esto puede ser debido al proceso de seroconversión. Las personas de bajo riesgo con un resultado indeterminado prácticamente nunca resultan con infección. Cuando persiste un resultado indeterminado y es necesaria su definición, se deberá proceder a una cuantificación del material genético de VIH en plasma. 28 Los pacientes pediátricos que reciben anticuerpos maternos durante la gestación, pero que no resultan infectados, los pierden en el transcurso de los primeros 18 meses de vida, encontrándose pruebas serológicas indeterminadas, hasta hacerse negativas después del año de vida.
Otras técnicas de laboratorio han sido descritas para determinar la presencia de una respuesta inmune a la infección por VIH-1, sin embargo carecen de aplicación práctica en clínica excepto por la reacción de inmunoadhesión (dot-blot immunobinding) recombinante, que muestra una sensibilidad de 87-99%, especificidad de 97-99%, con la ventaja de un corto tiempo de realización (30 minutos) y con el uso de un mínimo de equipo de laboratorio. Requiere confirmación con WB.
Antigenemia
El antígeno p24 puede ser detectado en el suero o plasma durante la fase aguda de la primoinfección por VIH-1, así como en las fases tardías sintomáticas de la infección. Solamente 4% de los pacientes asintomáticos tienen niveles detectables de p24, en contraste con 70% en aquellos sujetos con SIDA avanzado.La detección de antigenemia p24 fue utilizada inicialmente para el diagnóstico de infección en niños hijos de madre seropositivas, en los cuales la sensibilidad para infección varía de 50-75% y la especificidad es mayor de 95%. La sensibilidad del ensayo disminuye en niños asintomáticos, así como en niños menores de seis meses de edad y es solamente de 0-20% durante el primer mes de vida.
]]> La determinación del antígeno p24 es efectuada mediante el método de ELISA, utilizando una fase sólida constituida por anticuerpos contra este antígeno. Los ensayos disponibles pueden detectar concentraciones mayores de 10 pg/mL de p24, sin embargo, actualmente la cuantificación de p24 ha sido sustituida por los ensayos cuantitativos de RT-PCR para RNA de VIH-1 en plasma. El uso más común de la determinación de p24 es para detectar la replicación viral en sobrenadante de cultivos celulares. 29
Aislamiento viral
El aislamiento viral es la técnica más específica para el diagnóstico de la infección por VIH-1, resultando particularmente útil en el diagnóstico de infección en pacientes menores de 18 meses de edad, en donde se considera que la presencia de anticuerpos específicos puede ser de origen materno. El cultivo viral también ha sido utilizado ampliamente en estudios de variabilidad genética y en pruebas de sensibilidad fenotípica a diferentes fármacos.
En los individuos infectados con VIH-1, la probabilidad de aislamiento viral está directamente relacionada con el número de células mononucleares infectadas presentes en un momento dado en la muestra sanguínea. Así sujetos en estadios tempranos de la infección, asintomáticos, con nivel de células CD4+ > 500 cel /uL y donde sólo uno de cada 10 4 -10 5 células están infectadas, la probabilidad de aislamiento es baja. En sujetos con SIDA donde uno de cada 10-100 células están infectadas, la probabilidad de aislamiento es de 90% o más.
A pesar de que el cultivo puede ser realizado también a partir de virus presentes en el plasma, el cocultivo de células mononucleares es el más utilizado actualmente. Se utilizan muestras anticoaguladas con EDTA o citrato de sodio, procediéndose a la separación de células mononucleares mediante gradiente de Ficoll-Hypaque. Una vez aisladas, las células son cocultivadas con mononucleares provenientes de un donador sano, las cuales han sido cultivadas en medio RPMI y estimuladas con fitohemaglutinina. La fitohemaglutinina estimula proliferación celular y la expresión de receptores de interleuquina-2 en la superficie celular. Dicha interleucina es añadida al cocultivo celular, el cual se mantiene en medio RPMI y es renovado con nuevas células del donador dos veces por semana.
El cocultivo de mononucleares del paciente con mononucleares de donantes sanos es el método más eficaz para el aislamiento del virus, el cual puede lograrse también mediante cocultivo en líneas celulares inmortalizadas. Este método no requiere adición de interleucina-2, sin embargo, tiene una menor sensibilidad.
La detección de partículas virales o antígenos en el sobrenadante del cultivo es realizado por diferentes métodos: cuantificación del antígeno p24, determinación de la actividad de la TR u observación del efecto citopático viral. Un cultivo positivo es definido como aquel en que se detecta una producción sostenida de antígeno p24. La mayoría de los cultivos de pacientes infectados que no han recibido tratamiento, manifiestan positividad dentro de las primeras tres semanas de incubación. Algunos factores pueden aumentar el tiempo para una determinación positiva del cultivo, entre ellos una carga viral baja ya sea por ser un progresor lento o como resultado del tratamiento antirretroviral, un reducido número en el inóculo inicial de mononucleares, o bien problemas en la calidad de los reactivos o en la realización de la técnica. 30
El cultivo de células mononucleares periféricas es altamente sensible; sin embargo, consume gran cantidad de tiempo y recursos. Algunos estudios han mostrado equivalencia entre el cultivo y la determinación de DNA viral mediante PCR, para el diagnóstico de infección por VIH-1 en lactantes nacidos de madres seropositivas.
]]> Detección y cuantificación de ácidos nucleicos
Las pruebas directas que investigan la presencia del genoma viral deberían ser las principales herramientas diagnósticas; sin embargo, las técnicas de hibridación directa (hibridación in situ ) tan útiles para detectar la viremia por otros agentes, han resultado insensibles en la infección por VIH-1. Ello probablemente debido a un bajo número de células infectadas, principalmente en sujetos asintomáticos.
Este problema ha sido resuelto mediante el desarrollo de técnicas que permiten obtener un elevado número de copias de una secuencia genómica concreta. Estas técnicas basadas en la amplificación enzimática selectiva han revolucionado la biología molecular en los últimos años.
La reacción de polimerasa en cadena (PCR) es una técnica que incluye tres etapas: disociación de las cadenas de DNA (desnaturalización), hibridación de los cebadores con el ácido nucleico analizado y, por último, copia de los nuevos fragmentos. Esta secuencia de reacciones se realiza en forma cíclica por un número determinado de veces, generando millones de copias de un único fragmento original, lo que facilita su detección.
La detección de material genético puede ser realizada para los dos tipos de material genético (DNA o RNA) dando cada una de ellas información diferente. 31 Al detectarse RNA debe realizarse una transcripción reversa con enzima TR, previa a la amplificación por PCR (RT-PCR).
Detección de DNA proviral
Este ensayo detecta el DNA provírico presente en los linfocitos T infectados, que mayoritariamente constituyen las células diana del virus. Normalmente se realiza a partir de leucocitos mononucleares periféricos, aislados de sangre completa del paciente y de los cuales es extraído el DNA al efectuarse un lisado leucocitario. Posteriormente se procede a la amplificación mediante PCR de un segmento corto del gen gag y a su detección, reportándose como positivo o negativo. La sensibilidad del ensayo para detectar una infección establecida por HIV-1 es mayor a 95% y la especificidad mayor de 98%, sin embargo, en niños menores de dos años la sensibilidad varía de 75 a 97%. Entre las causas de resultados falsos negativos deben considerarse errores en la identificación o en el manejo de la muestra o bien durante el proceso, como serían variación en la secuencia del sitio donde se adhiere el cebador o un número muy bajo de copias de DNA proviral en la muestra.
Detección cuantitativa de RNA de VIH-1 en plasma
]]> La determinación de la concentración de material genético viral en el suero de los pacientes (carga viral) ha resultado el índice de mayor utilidad para observar la respuesta al tratamiento. Ésta, denominada usualmente carga viral, puede realizarse por varias técnicas, la más utilizada es la amplificación del RNA del VIH-1 mediante la trascripción reversa, asociada a la reacción en cadena de la polimerasa o RT-PCR (Amplicor Monitor, Roche Molecular Systems). El límite de detección depende del equipo utilizado, siendo de 400 copias/mL de plasma en el denominado estándar y de 50 copias/mL en el ultransensible.Otra técnica está basada en la amplificación isotérmica del material genético (NASBA, Organon Technika), en la cual mediante dos reacciones de TR se obtiene DNA de doble cadena. Uno de los cebadores con los que se realizan estas reacciones contiene la zona promotora necesaria para que actúe una enzima capaz de sintetizar RNA a partir de DNA de doble hebra denominada RNA polimerasa T7, la cual actuaría una y otra vez produciendo gran número de copias de RNA. 32
La tercera técnica está basada no en la amplificación del material genético, sino en la amplificación de la señal unida a dicho material. Se inicia con la extracción del material genético viral, el cual se añade a una microplaca donde existen sondas específicas a las cuales se une dicho material. A este complejo sonda-RNA se añade otra sonda de DNA que tiene 15 ramificaciones, las cuales actúan como un sistema de amplificación de la señal, que se obtiene mediante quimioluminiscencia. 33
En todos ellos el resultado es expresado en el logaritmo base 10 del número de copias de RNA del virus/mL de plasma del paciente.
La magnitud de la denominada carga viral se ha relacionado directamente con el riesgo de progresión de la enfermedad, así como del riesgo de muerte y su determinación debe idealmente realizarse antes de iniciar el tratamiento y posteriormente cada mes hasta alcanzar el nadir. De ser efectivo el tratamiento, la carga viral debe reducirse en 1 o 2 logaritmos (10-100 veces) entre las 2-4 semanas de haberse iniciado y hacerse indetectable (< 50 copias/mL) entre los 3-6 meses. En niños la disminución de la concentración viral es más lenta comparado con los adultos, ya que en los lactantes la carga viral usualmente es muy alta en el momento del diagnóstico. 34,35
En la actualidad el diagnóstico de la infección por VIH en niños puede realizarse en los primeros meses de vida, utilizando estudios virológicos y cultivos. Una prueba virológica positiva indica una posible infección por VIH y se puede confirmar con repetir una segunda muestra lo más pronto posible después de tener el resultado de la primera. La determinación del DNA proviral del VIH-1 en leucocitos es una prueba virológica para el diagnóstico de VIH durante la niñez, encontrándose una sensibilidad de 90% para el diagnóstico durante el periodo neonatal. Estudios que detectan RNA del VIH-1 en plasma también son útiles para el diagnóstico de infección perinatal, y han demostrado ser más sensibles que la PCR para DNA para el diagnóstico temprano de infección de VIH en niños expuestos. 36 La búsqueda del material genético del VIH-1 es recomendada a las 48 horas de vida, debido a que cerca de 40% de los niños infectados pueden ser identificados en este periodo. Los niños que tienen una prueba virológica positiva antes o a las 48 horas de vida se consideran como infectados tempranamente o intraútero. 21 Los estudios de diagnóstico se deben repetir a los 14 días de vida en niños con pruebas negativas al nacimiento, debido a que incrementa la sensibilidad de los estudios virológicos a las dos semanas de vida y la identificación temprana puede permitir la modificación de terapia antirretroviral de la estándar de seis semanas con AZT a una terapia más agresiva. Los niños con pruebas virológicas negativas al nacimiento deben ser reevaluados al 1o. y 2o. meses de vida, posteriormente de seguir negativas, se reevalúan a los tres y seis meses. Los niños con pruebas virológicas negativas antes de la primera semana de vida, con subsecuentes pruebas positivas, son considerados como infectados tardíamente o perinatalmente. La infección por VIH se diagnostica por dos pruebas virológicas (cultivo, PCR DNA o RT-PCR) positivas en diferentes muestras de sangre. Se debe tomar en cuenta que, dos o más determinaciones de inmunoglobulinas para VIH negativas en mayores de seis meses en intervalos de un mes cada una, pueden ser utilizadas para excluir la infección por VIH entre niños sin evidencia de infección por VIH-1, sin embargo, su seguimiento debe ser durante 18 meses. 37
TERAPÉUTICA
En la replicación del VIH-1 se incluyen varios pasos, dentro de los cuales se encuentran:
a) La adhesión del virus a los receptores y correceptores celulares.
]]> b) Su desnudamiento intracelular, transcripción reversa (RNA a DNA), integración al genoma celular y rompimiento de una poliproteína inicial, mediante proteasas, que permiten la producción de unidades proteicas estructurales y funcionales que formarán los futuros viriones. En teoría, cada uno de estos pasos es susceptible de ser bloqueado y detener la replicación viral; sin embargo, hasta el momento sólo dos de ellos han sido bloqueados exitosamente mediante fármacos.Los medicamentos que inhiben la enzima transcriptasa reversa (TR) fueron los primeros en ser utilizados y su acción puede ser en forma competitiva con las bases nitrogenadas (ITRAN) o en forma directa bloqueando a la enzima TR (ITRNN). 38
Zidovudina (AZT), didanosina (ddI), zalcitabina (ddC), lamivudina (3TC), stavudina (D4T) y otros, son análogos de nucleósidos y actúan en forma competitiva, resultando un bloqueo en la elongación de la nueva cadena de DNA. Nevirapina, efavirenz y delavirdina actúan en forma no competitiva uniéndose a la molécula de TR y produciendo cambios estructurales e inhibición del sitio activo. 39
Desde 1996 han surgido medicamentos que actúan inhibiendo las enzimas virales denominadas proteasas (IP), produciendo virus inmaduros o defectivos, incapaces de infectar células. Saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir y amprenavir, son los fármacos que han mostrado utilidad clínica y han modificado el pronóstico de vida y morbilidad en los pacientes infectados con el VIH-1. 40,41
En el cuadro 4 se ilustran los fármacos utilizados en pediatría, dosis, posología y principales efectos colaterales que en un momento dado pueden llegar a ser tan importantes que ameriten suspensión o cambio de tratamiento. 37
Tratamiento combinado
La monoterapia con AZT fue el único tratamiento disponible por varios años al inicio de la pandemia por VIH. Su efecto resultó, en la mayoría de los casos, en una reducción moderada de la carga viral con duración entre uno y dos años. 42 Esto se tradujo clínicamente en una reducción en la progresión del SIDA si bien limitada por la emergencia secuencial de mutaciones inductoras de resistencia en la molécula de TR. 43
La combinación de AZT con ddI, ddC o 3TC mostró, sin embargo, un efecto mayor y más prolongado sobre la carga viral y reducción de la progresión de la enfermedad. Este efecto fue más evidente en aquellos sujetos vírgenes de tratamiento antirretroviral. Sin embargo, al igual que con la monoterapia el surgimiento de resistencia a uno o a los dos fármacos e inclusive el surgimiento de resistencia cruzada y múltiple, redujo el efecto de este tipo de terapia combinada. 39,44
En los pacientes tratados con monoterapia con inhibidores de proteasa se produjo una supresión más importante y prolongada de la replicación viral que con la terapia doble. 45 Más aún, con la combinación de uno o dos IP y dos inhibidores de TR ha surgido la denominada terapia altamente efectiva, la cual tiene por objeto:
]]> 1. Llevar a la carga viral por abajo del límite de detección rápidamente.En el seguimiento de una cohorte en el Hospital de Pediatría del CMN Siglo XXI, se demostró una mejor respuesta al tratamiento combinado con dos ITRAN y dos IP, en pacientes previamente trata-dos con terapia triple. Más de la mitad de estos pacientes alcanzaron niveles de CV por abajo de 50 copias/mL. 52 Una revisión posterior en el mismo hospital demostró que en aquellos pacientes vírgenes al tratamiento, un esquema cuádruple, incluyendo dos ITRAN y dos IP, disminuía la CV en forma más rápida que un esquema con sólo un IP. Estas diferencias significativas se encontraron al 3° y 6° meses de seguimiento, sin embargo, a los 12, 18 y 24 me-ses no existió diferencia estadística. El inconveniente principal del esquema con cuatro drogas es el mayor número de efectos colaterales, siendo la mayoría de ellos durante el primer mes de tratamiento y referidos principalmente al tubo digestivo, como náusea, vómito, diarrea y dolor abdominal. 13
Otros de los efectos secundarios de la terapia antirretroviral y principalmente con el uso de IP, es la alteración a nivel de lípidos sanguíneos. En los pacientes atendidos en nuestro Hospital, se encontró hipercolesterolemia en 60% e hipertrigliceridemia en 63% de los pacientes con tratamiento cuádruple. Aproximadamente una tercera parte de estos pacientes desarrollaron ambas alteraciones durante el tratamiento. Cabe señalar que los niveles máximos de triglicéridos varían con la edad y debe ajustarse para cada grupo etario. Hasta el momento la dieta con poco contenido lipídico y la actividad física son las medidas recomendadas para estas alteraciones dentro del grupo pediátrico.13,53
Inicio de tratamiento
En la actualidad se considera que la terapia antirretroviral en pacientes pediátricos infectados debe iniciarse en cuanto el diagnóstico sea confirmado, sin importar el nivel de la carga viral ni el número de células CD4+. 37
]]>Exámenes de laboratorio necesarios para seguimiento del tratamiento
La determinación de la concentración de material genético viral en el suero de los pacientes ha resultado el índice de mayor utilidad para observar la respuesta al tratamiento. De ser efectivo, la carga viral debe reducirse en uno o dos logaritmos (10-100 veces) entre las 2-4 semanas de haberse iniciado y hacerse indetectable (< 50 copias/mL) entre los 3-6 meses. 54
La cuenta de células linfáticas T CD4+, es otro parámetro utilizado en el tratamiento con antirretrovirales y refleja la extensión del daño que el VIH ha causado al sistema inmune. Su número en la sangre del paciente está inversamente relacionado con el riesgo de presentar infecciones oportunistas, progresión de la enfermedad o riesgo de muerte. Idealmente debe tenerse una cuenta basal antes de iniciar el tratamiento y posteriormente cada 3-4 meses. Su elevación con el tratamiento antirretroviral es más lenta que la carga viral y aún no está claro si las células recuperadas tienen la misma equivalencia funcional que un número similar previo al tratamiento. 55
Se considera que existe falla al tratamiento y que deben hacerse modificaciones al mismo cuando:
1. Exista reducción de la carga viral a las 8-12 semanas de tratamiento, menor a una décima parte de la carga original (< 1 Log10).
2. Niveles aún detectables de RNA después de 4-6 meses de tratamiento.
3. Determinación positiva de carga viral posterior a una determinación negativa.
4. En aquellos pacientes con carga viral baja, un incremento > 0.7 Log 10, después de iniciado el tratamiento. 5. Cambio en la clasificación inmunológica.
6. Deterioro neurológico progresivo. ]]>
7. Progresión de la enfermedad con avance en la categoría clínica. 37
PREVENCIÓN DE LA TRANSMISIÓN PERINATAL DE VIH-1
Aunque al nacer todos los recién nacidos de madres VIH-1 positivas son seropositivos, los que realmente no están infectados pierden progresivamente esos anticuerpos que fueron transmitidos de la madre al hijo a través de la placenta, sin embargo, entre 13 y 40% de los niños nacidos de madres infectadas contraen la infección por VIH-1. 56 Este riesgo logra disminuirse con la utilización del tratamiento antirretroviral durante el embarazo. Una experiencia multicéntrica demostró que la administración de la zidovudina a las mujeres durante los dos últimos trimestres del embarazo, durante el parto y posteriormente al producto durante seis semanas, disminuye en dos tercios la tasa de transmisión del VIH-1. La dosis de zidovudina al neonato es de 2 mg/kg cada 6 horas. 57 Otras modalidades terapéuticas como la administración de zidovudina o nevirapina durante el parto han mostrado, asimismo, disminución de la transmisión vertical. Actualmente se recomienda continuar el tratamiento antirretroviral en mujeres infectadas por VIH-1 que se embaracen o bien iniciar tratamiento combinado después del segundo trimestre en aquellas que aún no lo toman. 58-60
Es importante la búsqueda de anticuerpos contra VIH-1 en mujeres embarazadas aun sin factores de riesgo, ya que el conocimiento de la infección materna durante el periodo preparto permite:
1. Dar una adecuada terapia antirretroviral a mujeres embarazadas infectadas con VIH y profilaxis contra infecciones oportunistas. 61
2. Proporcionar una quimioprofilaxis antirretroviral con zidovudina durante el embarazo, durante el parto y al nacer, para reducir el riesgo de transmisión.
3. Concientizar a la mujer infectada acerca del riesgo de transmisión a través de la leche materna. 62
4. Iniciar la profilaxis contra Pneumocystis carinii en todos los niños expuestos al VIH iniciando trimetroprim-sulfametoxazol entre la 4a. a 6a. semanas de edad.
5. Diagnóstico temprano de niños expuestos a VIH para permitir de forma temprana el inicio del tratamiento. 63
]]>Resistencia a la terapéutica antiviral
La enzima TR del VIH-1 es una enzima altamente susceptible de cometer errores en su función de transcripción reversa, introduciendo bases nitrogenadas en forma errática en el cADN y, por lo tanto, modificando la secuencia de aminoácidos en las moléculas traducidas.
Por otra parte, tanto los fármacos inhibidores de TR como los inhibidores de la proteasa ejercen una presión selectiva sobre el conjunto de virus existente en un momento dado en el plasma de un sujeto infectado, seleccionando aquellos que presentan mutaciones a nivel de su genoma que los hacen más aptos a las nuevas condiciones existentes en el medio. Estos fenómenos llevan a la producción de virus defectivos pero también a la emergencia de virus con mutaciones en sitios particulares que les brindan resistencia a los fármacos utilizados. 64
Así, aun en individuos vírgenes de tratamiento pueden existir virus que portan las mutaciones inductoras de resistencia, resultando que al iniciarse la terapéutica se logre la supresión de los virus susceptibles y que los resistentes lentamente substituyan a la población viral original. 65
La probabilidad de emergencia de virus resistentes es variable según el fármaco utilizado, pero en general es mayor si se utiliza monoterapia y menor si se utilizan varios fármacos con diferentes sitios de acción. 66
Para algunos medicamentos como son lamivudina y ciertos inhibidores de transcriptasa reversa no nucleósidos, una sola mutación puede conferir alto nivel de resistencia. Cuando esas drogas son administradas en combinación, pero alcanzando sólo una supresión parcial de la replicación viral, las mutantes resistentes llegan a predominar en semanas. Para algunos otros medicamentos, como son zidovudina y ciertos inhibidores de proteasa, el alto nivel de resistencia requiere de la acumulación de tres o más mutaciones inductoras de la misma en el genoma viral. Por lo tanto, esas quasiespecies altamente resistentes emergen más lentamente, requiriendo de meses para predominar en la población viral. 68
Existen diversos métodos para determinar la sensibilidad de HIV-1 a diferentes fármacos: los fenotípicos y los genotípicos.
Los ensayos fenotípicos proveen de una información definitiva en cuanto a la resistencia a diversas drogas y son útiles aun para investigar patrones complejos, que pudieran surgir en algunos sujetos durante tratamientos combinados. Sin embargo, los ensayos fenotípicos convencionales están basados en el aislamiento y cultivo viral y, por lo tanto, son laboriosos, de alto costo y largo tiempo para obtención de un resultado, no siendo adecuados totalmente para el seguimiento clínico y la decisión del cambio terapéutico. 69
Un nuevo ensayo fenotípico rápido ha sido descrito recientemente y está basado en la susceptibilidad de la actividad enzimática de transcriptasa reversa a diversos fármacos. 70 Esto se logra comparando inhibición de la actividad enzimática perteneciente a la carga viral que se encuentra en el plasma del paciente, al ponerse en contacto in vitro con los fármacos a probar. Actualmente se ha descrito su utilidad para 3TC y nevirapina. Lamentablemente solamente es de utilidad en el caso de los inhibidores de RT. 67
]]> Otro ensayo fenotípico basado en la tecnología de recombinación de DNA ha surgido en los últimos años y a pesar de aún no estar disponible comercialmente, su utilidad ya ha sido evidente. Una ventaja de este ensayo es el uso del plasma del paciente como material de inicio del mismo, evitando la multiplicación del virus en cultivo de células mononucleares. En él, el RNA correspondiente a los genes de las enzimas RT y proteasa es extraído y amplificado mediante PCR. Dicho material es introducido en clones de VIH que carecen de uno o ambos genes, obteniéndose un virus completo, capaz de ser probado en cultivo celular en la presencia de diferentes fármacos. A pesar de no ser tan rápido como el ensayo anteriormente descrito, tiene la ventaja de ser de utilidad en el caso de inhibidores de proteasas. 71,72La determinación genotípica de resistencia de la transcriptasa reversa del HIV-1 puede ser determinada por medio de diferentes métodos de biología molecular: Southern bloting, PCR primer específico, reacción para la detección ligasa de PCR, pruebas de mutación puntual, hibridación contra sondas marcadas, y la de LiPA. Sin embargo, a pesar de la aparente sencillez y rapidez de algunos de ellos, sólo detectan mutaciones previamente conocidas y no pueden estimar un efecto sinérgico o por el contrario antagónico de un patrón dado de mutaciones del genoma de un virus. A pesar de estos inconvenientes en la actualidad son los métodos más utilizados para la investigación de resistencia y asistencia en la selección de fármacos en pacientes infectados con VIH-1 que han sido multitratados. En algunos trabajos prospectivos, comparando la efectividad de un tratamiento escogido con base en las mutaciones predominantes en la población viral versus un tratamiento empírico, se ha demostrado la utilidad de estos métodos. 74
En la actualidad dos son los métodos genotípicos más utilizados: secuenciación de nucleótidos correspondientes a los genes de la polimerasa y la proteasa del genoma del VIH-1 y la hibridación reversa.
El principio de esta última (INNO-LiPA Murex Innogenetics) está basado en la realización de una RT-PCR seguida de hibridación reversa de los productos obtenidos. El material DNA biotinilado es hidrolizado e inmovilizado con sondas de oligonucleótidos específicos dirigidos contra partes relevantes de la HIV-RT las cuales se observan como líneas paralelas sobre una tira. Éstas pueden ser detectadas por medio del acoplamiento con biotina estreptavidin a través de un sistema colorimétrico. La ventaja de esta técnica sobre otras pruebas genéticas es la rapidez con la cual los resultados son obtenidos. 75
Además de la secuencia de los genes de la polimerasa y proteasa mediante iniciadores específicos diseñados en diferentes publicaciones, es posible realizar secuenciación del gen gag-pol , por medio de un equipo comercial. La longitud del segmento secuenciado en esta última es de 1.8 kb e incluye la realización de una PCR inicial. Posteriormente se utilizan siete cebadores a diferentes niveles de la molécula, produciéndose seis segmentos de secuencia, los cuales son analizados por un sistema de software que identifica áreas de interés con base en la falta de correspondencia con una secuencia patrón. La cantidad mínima de material genético presente en plasma para la realización de la técnica es de 1,000 copias de RNA/mL. 76
La utilidad de todas las técnicas descritas ha sido validada ampliamente en sujetos adultos, sin embargo, en niños infectados con VIH-1 aún no están bien establecidos parámetros de utilidad y seguimiento.
En el Hospital de Pediatría del CMN Siglo XXI se estudiaron pacientes con falla al tratamiento con AZT, ddI y SQV, identificándose por secuenciación y LiPA diversas mutaciones inductoras de resistencia. Al inicio de la terapia HAART ocho de 10 pacientes mostraron mutaciones asociadas a resistencia a ITRAN y sólo uno a IP. Al momento del fallo a la terapia triple sólo uno de ellos no mostró mutaciones inductoras de resistencia a ITRAN y seis mostraron mutaciones relacionadas a IP (Cuadro 5).
En un futuro con el perfeccionamiento de estas técnicas, así como en su interpretación, será posible establecer terapéuticas en forma selectiva, pero siempre tomando en cuenta la condición clínica del paciente, su medio social y por supuesto sin olvidar el aspecto humano de su enfermedad.
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