Valor pronóstico del inmunofenotipo en la respuesta temprana de la leucemia aguda linfoblástica pre–B en niños
Prognostic value of pre–B immunophenotype in early treatment response among acute pediatric lymphoblast leukemia patients
Lourdes Cecilia Correa–González,ª, b* Peter B. Mandeville,c Javier Manrique–Dueñas,b Francisco Alejo–González,b Abel Salazar–Martínez,b Oscar de Jesús Pérez–Ramírez,c y Juan Francisco Hernández–Sierra.c
ª Servicio de Hematología, Instituto Mexicano del Seguro Social, San Luis Potosí, S.L.P.
b Servicio de Hematología, Hospital Central Dr. Ignacio Morones Prieto, San Luis Potosí, S.L.P.
]]> c Maestría en Ciencias en Investigación Clínica, UASLP, San Luis Potosí, S.L.P., México
*Correspondencia y solicitud de sobretiros:
Dr. Juan Francisco Hernández Sierra.
Maestría en Ciencias en Investigación Clínica, Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí.
Av. Venustiano Carranza 2405,
78210, San Luis Potosí, SLP.
Teléfono: (48) 26–23–45 ext 519, Fax: (48) 26–23–52
Recibido en su versión modificada: 16 de abril de 2005 ]]> Aceptado: 20 de mayo de 2005
Resumen
Objetivo: Determinar el valor pronóstico del inmunofenotipo pre B con sus variantes en la respuesta temprana al tratamiento de la leucemia aguda linfoblástica pediátrica, ajustando edad y cifra de leucocitos inicial.
Pacientes y método: Se realizó un estudio de casos y controles anidado en una cohorte con pacientes menores de 15 años de edad, de los dos géneros, con leucemia aguda linfoblástica pre B de diagnóstico reciente. Se utilizó un panel de anticuerpos monoclonales específicos de la estirpe B, T, monocito mielocito y megacariocítica. Se evaluó la respuesta después de 14 días de tratamiento mediante aspirado de médula ósea.
Resultados: Se incluyeron 54 pacientes. La mediana de edad fue de 7 años (2 m 14 años), la mediana de cifra de leucocitos fue 13,450/mm3 (1200–986,000/mm3). Se identificaron 29 casos con inmunofenotipo Pre B tardío, 19 casos pre B común y 6 casos de pre B precoz. Once pacientes presentaron antígenos mieloides asociados. Se encontró asociación significativa (p=0.034) entre respuesta temprana y la presencia de antígenos mieloides. No se demostró asociación entre las variantes del inmunofenotipo pre B, edad y cifra de leucocitos con la respuesta temprana (p=0.264).
Conclusiones: Es necesario estudiar directamente la respuesta tem prana al tratamiento en los niños con leucemia linfoblástica ya que en nuestra muestra de pacientes los factores clínicos y el inmunofenotipo no fueron predictivos de ésta.
Palabras clave: Leucemia aguda linfoblástica, inmunofenotipo, respuesta temprana, factor pronóstico.
Summary
]]> Objective: To determine the prognostic value of pre B immunophenotype and its variants on early treatment response among of acute pediatric lymphoblast leukemia.Patients and methods: A case control study nested in a cohort was carried out with male and female patients 15 years and younger with recently diagnosed pre B lymphoblast leukemia. A panel of B, T, monoclonal antibodies of the myelo monocytic and megakaryocytic cell type was used. Response was assessed by bone marrow aspiration 14 days post treatment.
Results: 54 patients were included. The median age was 7 years (2 months – 14 years) median leukocyte count was 13,450/mm3 (1200–986,000/mm3). We identified 29 cases with late pre B immune phenotype, 19 cases with common pre B and 6 cases with early pre B immunophenotype. Eleven patients also displayed myeloid antigens. A significant association (p=0.034) was found between early treatment response and the presence of myeloid antigens. No association was found between the pre B immunophenotype, age and leukocyte count with early treatment response (p=0.264).
Conclusions: We need to pay special emphasis on early treatment response in children with lymphoblast leukemia as our study did not corroborate the common finding that clinical factors and immune phenotype can be predictive factors.
Key words: Acute lymphoblast leukemia, immunophenotype, early response, prognostic factor.
Introducción
La leucemia aguda linfoblástica (LAL) es la neoplasia maligna más frecuente en la infancia.1,2 Fajardo y colaboradores informan que en México la leucemia aguda ocupa el primer lugar y corresponde a 34.4% del total de neoplasias, de éstas la LAL es la más frecuente (83.3%).1
En los últimos años han existido avances notables en su tratamiento, con supervivencia libre de eventos a cinco años de 70–80% en pacientes tratados con quimioterapia múltiple efectiva combinada;3–5 sin embargo, existe un grupo de pacientes donde el resultado no es exitoso y mueren por actividad leucémica a pesar del uso sistemático de esquemas de tratamiento similares a los de los pacientes curados.4–6 Estas diferencias han llevado al reconocimiento de ciertos factores pronósticos independientes: son de buen pronóstico la edad de 1 a 10 años y leucocitos menores de 10,000/mm3; el índice de ADN > 1.16 (relación del contenido de ADN en las células leucémicas en fase Go/G1 y del contenido de ADN de las células normales en Go/G1), SNC sin infiltración al momento del diagnóstico, género femenino, ausencia de t (9;22) o t (1;19).6–13
El análisis inmunofenotípico tiene como objetivo asignar el linaje a la proliferación blástica una vez definido el diagnóstico morfológico y es útil para predecir el comportamiento de las poblaciones linfocitarias.14–17 El fenotipo B común (CD10+) se asocia a mejor pronóstico que el pre B precoz o T. Las LAL B (SIg+ ) tienen un comportamiento más agresivo y se manejan como un grupo aparte.18–21 Se ha establecido también como un grupo agresivo de leucemias, las que expresan antígenos de diferenciación mieloide asociados: CD13, CD33.22–30
]]> Una forma de evaluación, la respuesta temprana al tratamiento, medida por la velocidad de desaparición de blastos en sangre periférica (SP) y en médula ósea (MO), se ha involucrado como un factor pronóstico muy importante.31–35Existen informes que indican que el inmunofenotipo no tiene valor para predecir el pronóstico cuando se aplican tratamientos agresivos a pacientes de diagnóstico reciente y que la intensidad del tratamiento recibido es el factor pronóstico más importante;36–38 sin embargo tanto el Pediatric Oncology Group (POG) como el Dana Farber Cancer Institute consideran como factor de riesgo el inmunofenotipo leucémico.12 El POG, en sus protocolos AlinC 14 y T3 demostró que el inmunofenotipo de células T es un marcador de pobre pronóstico comparado con la LAL de precursor B, con supervivencia libre de eventos a cuatro años de 50 a 60% para el inmunofenotipo T. Por otra parte, el protocolo DFCI 85–01 del Dana Farber Cancer Institute no mostró diferencias en la evolución de los pacientes con inmunofenotipo T comparado con inmunofenotipo no T, aunque los pacientes con LAL "T" fueron asignados para recibir tratamientos de riesgo alto.12
Por lo anterior el objetivo del presente trabajo fue determinar si existe asociación independiente entre el inmunofenotipo pre B y la respuesta temprana al tratamiento de LAL, evaluada por el porcentaje de blastos en MO al día 14 del tratamiento, cuando se ajusta por edad y cifra de leucocitos.
Pacientes y métodos
El presente trabajo se realizó en el Hospital General de Zona 1 con Medicina Familiar del IMSS y el Hospital Central Dr. Ignacio Morones Prieto de segundo y tercer nivel de atención, con aprobación de los Comités de Ética e Investigación.
Se realizó un estudio de casos y controles anidados en una cohorte39 de pacientes de uno y otro géneros, menores de 15 años de edad que ingresaron por primera vez con diagnóstico de LAL y reporte inmunológico de estirpe Precursores B y cuyos padres aceptaron participar en el estudio y firmaron hoja de consentimiento. Fueron considerados como casos aquellos pacientes que no cumplieron el criterio de remisión medular a los 14 días del tratamiento de inducción a la remisión y como controles aquéllos con remisión medular en el mismo período. Se excluyeron a los pacientes con síndrome de Down y LAL con inmunofenotipo B o T.
Se consideró como LAL a la infiltración medular por linfoblastos en un porcentaje > 25%, según la clasificación de la FAB. 40–42clínico se consideró como de buen pronóstico edad de 2 a 10 años, cifra de leucocitos en SP < 50,000/ mm3, sin masa mediastinal y sin infiltración inicial al sistema nervioso central (SNC) y como riesgo alto o de mal pronóstico se consideró a los pacientes menores de dos años de edad o mayores de 10 años, con > 50,000 leucocitos /mm3 en SP.12
La respuesta al tratamiento al día 14: se determinó con base en el porcentaje de blastos en MO a este tiempo: respuesta completa < 5% blastos (M1), respuesta parcial con 5–25% de blastos (M2) y sin respuesta > 25% de blastos (M3).
Se determinó la consistencia interobservador del diagnóstico morfológico y de la evaluación de la respuesta al tratamiento, mediante la lectura de los aspirados de MO por dos hematólogos en forma ciega con el cálculo de kappa ponderada,43 que fue de 90%. El tamaño de la muestra se calculó con base en la respuesta al tratamiento por porcentaje de blastos en MO al día 14 (variable dependiente), y 3 covariables: edad, número de leucocitos e inmunofenotipo. Se incluyeron al menos 50 repeticiones.44
]]> El inmunofenotipo se realizó en SP y MO por citometría de flujo. Se utilizaron anticuerpos monoclonales murinos, de la compañía Beckton Dickinson o CoulterR. Las muestras de MO se ajustaron a una concentración celular de 10,000 000/mL, las muestras de SP se tomaron directamente y se hicieron alícuotas de 100 microlitros a las que se agregaron anticuerpos monoclonales conocidos marcados con fluoresceína o ficoeritrina, utilizando un panel que incluyó CD2, CD3, CD4, CD8, CD10, CD13, CD14, CD19, CD20, CD33, CD34, CD41, CD45, Anti IgC, Anti IgS, Anti HLA–DR, antimieloperoxidasa, anti–tdt y anti CD22. Se llevaron a cabo tinciones dobles con CD34–CD20, CD34–CD13, CD34–CD33. Se determinó porcentaje e intensidad media de fluorescencia para cada anticuerpo monoclonal. Las gráficas obtenidas de las poblaciones sospechosas se interpretaron por un inmunólogo quien estableció el inmunofenotipo y estado de diferenciación (Cuadro I). Se consideró una leucemia bifenotípica cuando además de los antígenos linfoides probados, se demostró expresión de antígenos mieloides CD13 y/o CD33 con positividad para mieloperoxidasa.50,51
El esquema de quimioterapia de inducción a la remisión con cuatro fármacos se administró independientemente del inmunofenotipo a todos los pacientes, una vez que se tomaron las muestras programadas. Los pacientes iniciaron tratamiento de inducción a la remisión basado en el protocolo Total XI37 con Vincristina 1.5 mg/m2 semanal (días 1, 8,15, 22), daunorrubicina u otra antraciclina equivalente 25 mg/m2 (día 2, día 15), prednisona 40 mg/m2 diariamente del día 1 al 21 en que se inició descenso de dosis y se suspendió el día 28 del tratamiento, de acuerdo con resultados del aspirado de MO. También se les administró L–asparaginasa 10,000 U/m2 S.C. tres veces por semana (9 dosis totales) y quimioprofilaxis al SNC con triple fármaco intratecal (metotrexato, hidrocortisona, ara–C) en dosis según la edad, los días 2 y 22.37 El día 14 y 28 del tratamiento se repitió la MO en forma ciega a los factores clínicos e inmunofenotipo. Se tomó citometría hemática completa de control los días 7, 14, 21 y 28 del tratamiento. A los pacientes que no mostraron respuesta en la evaluación del día 14 del tratamiento se consideraron de riesgo alto, independientemente de la evaluación de riesgo inicial y se les modificó el tratamiento de inducción a la remisión y el programado de consolidación y mantenimiento. El resto del grupo de pacientes de alto riesgo y riesgo estándar continuó el tratamiento de inducción–consolidación y mantenimiento basado en el esquema del protocolo pediátrico Total XI de acuerdo al riesgo.37
Se mantuvo contacto con todos los pacientes incluidos en el estudio por lo menos los primeros 14 días de tratamiento y no se registraron pérdidas de pacientes.
Resultados
Se incluyeron 54 pacientes con LAL pre B de nuevo diagnóstico entre mayo de 2000 y diciembre del 2002 que cumplieron con los criterios de selección. Treinta pacientes fueron del género femenino y 24 del género masculino; la mediana de edad fue de 7 años, límites de 0.2 a 14 años
El diagnóstico morfológico más frecuente fue L1 con 97.5%, seguido de L2 en 2.5% de los casos. No hubo pacientes con LAL L3. Hubo tres muertes en inducción, al día l5, 18 y 20 de tratamiento; dos por sepsis y uno por probable hemorragia intracraneal.
La cuenta de leucocitos al momento del diagnóstico tuvo una mediana de 13,450 leucocitos / mm3, con límites de 1,200 a 986,000/mm3. El inmunofenotipo más frecuente fue "precursor de B–CD10+, CD20+" en 29 casos (53.7%), "Pre B Común CD10+" 19 casos (35.2%) y 6 casos fueron pre B precoz HLA–DR, CD19 (11.1%).14,15 En relación con el inmunofenotipo y la respuesta al día 14 de tratamiento se encontró en el análisis bivariado que los casos con antígeno CD10 positivo tuvieron respuesta al tratamiento (total o parcial) en el 93.6% de los casos en tanto que los CD10 negativos tuvieron respuesta sólo en 77.7% (Cuadro II). Se reportaron 11 casos (20.3%) con antígeno mieloide positivo, de ellos 4 LAL pre–B común y 7 LAL pre–B tardío; en 10 de ellos se obtuvo respuesta total al día 14 de tratamiento y sólo en un caso respuesta parcial.
]]>
El análisis estadístico fue efectuado a 95% del nivel de confianza con el programa estadístico R versión 1.6.2.45 La variable de respuesta (porcentaje de blastos al día 14) mostró distribución con sesgo positivo, por lo que se utilizó el procedimiento de Box Cox que indicó una transformación con logaritmo natural para conseguir normalidad de ésta. El requisito de normalidad de los residuos se probó entonces con Shapiro Wilk (p=0.0060)46 y el requisito de homogeneidad de las varianzas de los residuos con Brown–Forsythe (p=0.48).47 Se descartó colinearidad mediante una tabla de coeficientes de determinación (r2) (Cuadro III).
Se efectuó una regresión escalonada en una y otra direcciones48 del porcentaje de blastos al día 14 de tratamiento con respecto a edad, leucocitos, inmunofenotipo Pre B precoz, pre B común, Pre B tardío, antígeno CD10 positivo y antígenos mieloides positivos. Se encontraron 14 modelos equivalentes49 con menos de 2 unidades de diferencia por AIC (Cuadro IV); sin embargo el mejor modelo por razón de parsimonia fue ln (porcentaje de blastos al día 14) ~ antígeno mieloide positivo, lo que significa que la presencia de antígenos mieloides positivos y el logaritmo natural del porcentaje de blastos al día 14 del tratamiento se asocian a cualquier nivel de edad y número de leucocitos (p=0.034). Cuando se analizó la relación de la variable de respuesta al día 14 con respecto a los predictores: leucocitos, edad e inmunofenotipo y sus interacciones, no se encontró asociación significativa (p= 0.264).55
Discusión
]]> El tratamiento de la LAL dirigido al riesgo, evaluado en el momento del diagnóstico, ha mejorado los porcentajes de supervivencia libre de eventos a cinco años en los niños con esta enfermedad.36–38En la mayoría de los ensayos clínicos la clasificación del riesgo se basa en la edad, cuenta de leucocitos al momento del diagnóstico, anormalidades genéticas, inmunofenotipo y en algunos estudios el género masculino se considera un factor adverso y una indicación para prolongar el tratamiento de mantenimiento;9–13 sin embargo, la evaluación del riesgo basado en esos factores pudiera ser inadecuado debido a la diferente intensidad de los tratamientos.Desde principios de los ochenta la respuesta temprana (al día 14) al tratamiento de inducción a la remisión se reconoció como un factor de pronóstico de supervivencia a largo plazo independiente, debido a que esta respuesta refleja la sensibilidad de las células leucémicas a la quimioterapia y la farmacodinamia del huésped. El examen morfológico de la SP y la MO después de 7 y 14 días de tratamiento, es el método más ampliamente usado.32–35
En la evaluación entre los factores clínicos "edad y leucocitos" y la respuesta temprana a la inducción, no se demostró asociación, sin embargo, el poder alcanzado con nuestra población estudiada es muy bajo (0.11). Para demostrar la diferencia real (poder 0.90) se necesita de l,800 casos analizados. Los grandes grupos colaborativos en los EUA y Europa han demostrado, mediante análisis multivariado la influencia dominante sobre la duración de la supervivencia libre de enfermedad a largo plazo de la edad y la cifra de leucocitos inicial, siendo este último el predictor más significativo de la evolución.4–7,11,36–38 Tampoco el inmunofenotipo pre B con sus variantes y la positividad al antígeno CD10 influyeron en la respuesta temprana en nuestros pacientes. En relación con el antígeno CD10 positivo y la respuesta al tratamiento al día 14 notamos una tendencia clínica favorable en los pacientes con el antígeno positivo, que no se demostró en el análisis estadístico.
En nuestro grupo de pacientes la frecuencia de antígenos mieloides asociados (CD13 y CD33) a la LAL fue de 20.3%. Este fue el único factor significativo que influyó sobre la respuesta al día 14 del tratamiento. La media en el porcentaje de blastos al día 14 de tratamiento fue menor para el grupo de pacientes con antígenos mieloides positivos (0.933%) lo que indica mejor respuesta al tratamiento intensivo inicial que el grupo con antígenos mieloides negativos (4.049%) (p=0.034).
Este resultado se hizo evidente en el análisis exploratorio como un hallazgo que surgió durante el estudio, por lo que su interpretación adecuada requerirá de un trabajo diseñado para evaluar su influencia sobre el pronóstico de nuestros pacientes. Sin embargo, lo anterior concuerda con los reportes del grupo CCG y Pui y cols.22,52,53 entre otros, que relacionan la expresión de los antígenos mieloides asociados, con características clínicas favorables y buena respuesta al tratamiento. En el grupo de Pui y cols. la supervivencia libre de eventos a tres años de seguimiento mostró 85 ± 6% para pacientes con antígeno mieloide positivo comparado con 75 ± 3% para los negativos (p=0.58). En contraste, Wiersma y colaboradores demostraron después de 40 meses de seguimiento una supervivencia libre de eventos para los pacientes con antígenos mieloides positivos de 39 ± 13% comparado con 78 ± 5% para los pacientes sin tal expresión (p=0.0001 ).25 De la misma forma, Urbano Ispizua y colaboradores demostraron en un grupo de pacientes adultos con LAL y antígenos mieloides positivos un porcentaje de respuesta completa significativamente más bajo (p=0.05) y supervivencia más corta (p=0.001) comparado con los pacientes con antígenos mieloides negativos, siendo este hecho independiente de otras variables (edad y elevada cuenta de leucocitos), sin embargo el pequeño número de pacientes pediátricos en su serie, no les permitió analizar el significado pronóstico.54
Es importante reconocer que aplicar tratamientos combinados altamente efectivos elimina la fuerza pronóstica de la mayoría de las características biológicas y que recibir tratamientos contemporáneos intensos es el factor pronóstico más importante al reducir rápidamente la masa de células leucémicas y evitar la adquisición de mutaciones y resistencia a fármacos en forma temprana.37 Este fue el motivo por el cual a todos los pacientes, independientemente del riesgo evaluado con parámetros clínicos iniciales, se les administró el mismo tratamiento intenso durante la inducción a la remisión, basado en protocolos de tratamiento pediátricos.22,23,36–38
Conocer que la respuesta temprana al tratamiento no está determinada por ninguno de los factores clínicos analizados nos obliga a evaluar en todos nuestros pacientes la respuesta temprana al tratamiento mediante un aspirado de médula ósea al día 14, por lo menos. Aquellos que por parámetros clínicos fueron catalogados como de riesgo habitual pero que no tienen respuesta temprana al tratamiento deberán reconsiderarse y entrar a esquemas de quimioterapia intensos, como los pacientes de riesgo alto.
Nosotros analizamos las variables clínicas que influyen en otra variable predictora de la evolución, posiblemente la de más peso, que es la respuesta temprana al tratamiento. La evolución a largo plazo será evaluada en nuestro grupo de pacientes que serán seguidos durante la duración del tratamiento que aún no termina en toda la cohorte.
Se observó una tendencia clínica a mejor respuesta cuando el antígeno CD10 está presente, pero no se demostró significancia estadística con esta variable.
Se concluye que el inmunofenotipo pre B con su variante precoz, común y tardío no influye en la respuesta temprana a la quimioterapia en nuestra muestra de pacientes. Sin embargo, por ser una muestra pequeña es necesario conjuntar esfuerzos e integrar un grupo multicéntrico en nuestro país que asegure un número suficiente de pacientes para probar estas variables.
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