Actividad diferencial de fagocitosis e inducción de apoptosis in vitro por serotipos capsulares 5 y 8 de Staphylococcus aureus en neutrófilos de bovinos

Differential phagocytic activity and in vitro induction of apoptosis by Staphylococcus aureus capsular types 5 and 8 in bovine neutrophils

Nancy Montoya García^a, Claudia Giovanna Peñuela Rivas^a, Jorge Pablo Acosta Dibarrat^a, Valente Velázquez Ordoñez^a

^a Centro de investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, autopista Toluca-Atlacomulco Km 15.5. C.P. 50200. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de México. México. vvo@uaemex.mx. Correspondencia al último autor.

Resumen

Se evaluó la actividad de fagocitosis y apoptosis in vitro en leucocitos polimorfonucleares (PMN) de bovinos lecheros frente a Staphylococcus aureus tipos capsulares 5 y 8. Los neutrófilos se obtuvieron de vacas clínicamente sanas. La actividad de fagocitosis de neutrófilos se determinó a partir de la capacidad e índice de fagocitosis. La evaluación de la apoptosis se realizó por microscopía de campo claro (ML) y de epifluorescencia (MF). Se observaron diferencias entre los tratamientos en ML para la capacidad de fagocitosis, el tipo compacto (CC) fue 86.50±2.93, serotipo capsular 5 (CP5) 74.98±2.44 y serotipo capsular 8 (CP8) 82.22±1.5 (P<0.05). Los valores para el índice de fagocitosis fueron: CC 6.13±0.31, CP5 4.88±0.13 y CP8 5.22±0.10 (P<0.05). La capacidad de fagocitosis observada en la MF fue: CC 86.77±2.6, CP5 62.52±3.26 y CP8 78.60±4.07. El índice de fagocitosis para la CC fue de 7.62±0.55, 4.67±0.29 para CP5 y de 5.53±0.40 para CP8 (P<0.05). Los porcentajes de apoptosis por ML fueron: testigo positivo (C+) 97.7±1.28, testigo negativo (C-) 27.13±1.85, CC 35.44±2.56, CP5 60.07±4.21 y CP8 45.57±4.34 (P<0.05). En la técnica de MF fueron: C(+) 95.61±2.66, C(-) 20.2±1.77, CC 26.5±1.65, CP5 52.78±3.29 y CP8 41.33±2.32 (P<0.05). Se encontraron diferencias en la capacidad e índice de fagocitosis y apoptosis de los PMN entre los tipos capsulares de S. aureus evaluados. El CP5 al reducir la actividad de fagocitosis e incrementar la inducción de la apoptosis en los neutrófilos, puede contribuir a la persistencia de la infección intraglandular mamaria del ganado lechero en la mastitis bovina.

Palabras clave: Fagocitosis, Apoptosis, Neutrófilos, Staphylococcus aureus, Serotipos capsulares.

Abstract

In vitro phagocytosis and apoptosis activity was evaluated in polymorphonuclear leukocytes (PMN) dairy cattle in the presence of Staphylococcus aureus capsular types 5 and 8. PMN were obtained from clinically healthy cows. The phagocytic activity of neutrophils was assayed through the phagocytic capacity and phagocytic index. Apoptosis was determined by light microscopy (LM) and epifluorescence (FM). Differences were observed between treatments in LM regarding the capacity of phagocytosis; compact type (CC) were 86.50±2.93, capsular serotype 5 (CP5) 74.98±2.44 and capsular serotype 8 (CP8) 82.22±1.50 (P<0.05). The values for the phagocytic index were: CC 6.13±0.31, CP5 4.88±0.13 and CP8 5.22±0.10 (P<0.05). The phagocytic capacity in the FM was: CC 86.77±2.6, CP5 62.52±3.26 and CP8 78.60±4.07. The phagocytic index for CC was 7.62±0.55, CP5 4.67±0.29 and CP8 5.53±0.40 (P<0.05). The percentages of apoptosis evaluated by LM were: positive control (C+) 97.7±1.28, negative control (C-) 27.13±1.85, CC 35.44±2.56 CP5 60.07±4.21, CP8 45.57±4.34 and CP5 52.78±3.29. In the FM technique were: C(+) 95.61±2.66, C(-) 20.2±1.77, CC 26.5±1.65, CP8 41.33±2.32 respectively (P<0.05). Differences in the in vitro phagocytosis capacity, phagocytic index and apoptosis of PMN were found between the S. aureus serotypes tested. Type CP5 decreased phagocytic activity and significantly increased the apoptosis compared with type CP8 in PMN.

Key words: Phagocytosis, Apoptosis, Neutrophils, Staphylococcus aureus, Capsular serotypes.

El Staphylococcus aureus es el principal patógeno causante de mastitis en las vacas lecheras⁽¹⁾. La persistencia de la infección por S. aureus en la glándula mamaria (GM) se asocia a los factores de virulencia que acentúan la inflamación y la respuesta leucocitaria local⁽²⁾. Un gran número de cepas de S. aureus aisladas del ganado lechero con mastitis expresan el exopolisacárido capsular, predominando los serotipos capsulares 5 y 8 considerados los más patógenos⁽³⁾. Las cepas que no expresan cápsula se denominan cepas compactas (CC). El exopolisacárido capsular del S. aureus contribuye a evadir la respuesta inmune innata al afectar la opsonización a través del complemento y la fagocitosis⁽⁴⁾.

En la glándula mamaria los leucocitos polimorfonucleares (PMR), constituyen la primera línea de defensa celular frente a la infección a través de la fagocitosis⁽⁵⁾. La migración de los PMR en respuesta a los estímulos quimiotácticos del tejido mamario, es crucial en la resistencia y en la resolución del proceso infeccioso⁽⁶⁾. Durante la migración vascular y transepitelial en la glándula ocurre su degranulación^(7,8) acentuando de manera precoz su apoptosis^(9,10). La diapédesis de los PMR disminuye las reservas de glucógeno, reduciendo la fagocitosis y la explosión oxidativa⁽¹¹⁾. Así mismo la presencia de glóbulos de grasa y las micelas de caseína de leche afectan la actividad de fagocitosis de los PMR⁽¹²⁾; incrementándose la apoptosis durante la infección glandular, resultando en la fragmentación del DNA, formación de cuerpos apoptóticos⁽¹³⁾, reducción de la capacidad de respuesta a estímulos quimiotácticos y disminución de la intensidad de fagocitosis⁽¹⁴⁾.

Actualmente es poco conocida la influencia del S. aureus de los tipos capsulares 5 y 8 sobre la apoptosis de los PMN de vacas lecheras. El objetivo del estudio fue evaluar la actividad de fagocitosis y apoptosis in vitro de los PMN de vacas inducidas por los tipos capsulares 5 y 8 de S. aureus.

El grupo de animales donadores de PMN se integró con tres vacas lecheras multíparas, clínicamente sanas con un periodo pos partum promedio de 121 días. Los criterios de inclusión de las vacas fueron: serología negativa a anticuerpos anti S. aureus tipo capsular 5 y 8⁽¹⁵⁾, un conteo de células somáticas en leche <200 x 10³ células/ml⁽¹⁶⁾ y bacteriológicamente negativas a S. aureus en tres muestreos consecutivos⁽¹⁷⁾. El cuidado de las vacas se realizó siguiendo los lineamientos de las Normas Oficiales Mexicanas NOM 056-ZOO-1999 y NOM 062-ZOO-1999, bajo la supervisión del comité de bioética institucional de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de México. Para evaluar la capacidad de fagocitosis (CFN) e índice de fagocitosis (IFN) se emplearon dos grupos experimentales y un grupo testigo denominados: CP5, PMN + cepa de S. aureus tipo capsular 5; CP8, PMN + cepas capsulares 8 y de testigo (CC), PMN + cepa compacta. Se emplearon para evaluar la inducción de la apoptosis un grupo testigo positivo C(+) integrado por PMN incubados con ciclofosfamida (400 μg/100 Ml) y un grupo testigo negativo C(-) con PMN suspendidos en medio de cultivo. Los ensayos in vitro se realizaron por triplicado.

Para evaluar el índice de fagocitosis, capacidad de fagocitosis y apoptosis, se utilizaron dos cepas de S. aureus de origen bovino para cada tratamiento; caracterizadas con los antisueros anti-cap5 y anti-cap8, por medio de PCR se identificaron los genes cap5 y cap8 mediante los procedimientos descritos por Verdier et al⁽¹⁸⁾. Como testigos se emplearon las cepas de S. aureus: ATCC 12598 (Cowan1) tipo compacto, la cepa ATCC 25904 de tipo capsular 5⁽¹⁹⁾ y la cepa ATCC 49525 tipo capsular 8⁽²⁰⁾.

Los PMN se aislaron de sangre obtenida por venopunción de la vena yugular; en tubos de recolección al vacío (Vacutainer, Becton Dickinson, USA), con solución de ácido cítrico dextrosa 1:9⁽²¹⁾. El conteo total y diferencial de leucocitos se realizó empleando un hemocitómetro y la tinción del frotis sanguíneo con Giemsa. Los PMN se aislaron por el método de la lisis hipotónica de eritrocitos⁽²²⁾. La pureza de PMN maduros se observó en un frotis celular sanguíneo teñido con May Grunwald-Giemsa. La viabilidad se determinó por el método de exclusión de azul de tripán al 4%⁽²³⁾. La pureza y viabilidad de los PMN fueron estimadas al 95%.

Para determinar la actividad de fagocitosis in vitro se empleó como sustrato una suspensión de S. aureus 2 x 10⁸ UFC/ml inactivada a 120 °C durante 20 min y conservada a 4 °C hasta su uso; se realizó una proporción neutrófilo:bacteria de 1:10⁽²⁴⁾. En un microtubo se adicionaron: 0.1 ml de la suspensión bacteriana, 0.1 ml de suero autólogo inactivado a 56 °C y 0.8 ml de suspensión de neutrófilos, incubado a 37 °C durante una hora. Posteriormente a cada tratamiento se le adicionó lisostafina (1 μg/ml, lysostaphin SIGMA, USA), reincubándose por 30 min. Se realizó un frotis teñido con May Grunwald-Giemsa previo a la observación en microscopía de campo claro (ML) 100x.

La actividad de fagocitosis se evaluó mediante el índice de fagocitosis (número promedio de bacterias fagocitadas por PMN), al observar y contar 200 células en diferentes campos microscópicos. La CFN se estimó a partir del porcentaje de PMN que fagocitaron, contando 200 células. En la evaluación mediante microscopía de epifluorescencia (MF) para estimar el IFN y CFN, se empleó una suspensión inactivada de S. aureus 2 x 10⁸ UFC/ml, conjugada con isotiocianato de fluoresceína. La evaluación de la apoptosis in vitro de los neutrófilos, se realizó a partir de un frotis teñido con May Grunwald-Giemsa⁽²⁵⁾, observado en ML 100x, enumerando 200 PMN en varios campos de acuerdo a las características morfológicas⁽²⁶⁾. La observación de la apoptosis se realizó bajo el microscopio de epifluorescencia con bromuro de etidio 100 μg/ml (PROMEGA, Madison USA) y naranja de acridina 100 μg/ml (SIGMA-AlDRICH, USA); a 100 μl de la muestra de estudio se adicionaron 8 Ml de las soluciones de contraste fluorescente⁽²⁷⁾.

El análisis de los resultados se realizó a partir del IFN y CFN de los tratamientos, comparados con el grupo testigo. Se determinó la media y la desviación estándar. Para evaluar las diferencias de la actividad de fagocitosis e inducción de apoptosis entre los tratamientos y el grupo testigo se realizó un análisis de varianza⁽²⁸⁾, la comparación de medias de los tratamientos se realizó con la prueba de Tukey, utilizando el programa GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Sofware Inc. USA).

Los valores obtenidos en el ensayo in vitro para evaluar la actividad de fagocitosis de los PMN observada mediante ML para la CFN fueron: cepa compacta (CC) 86.50 ± 2.93, CP5 74.98 ± 2.44 y CP8 82.2 ± 1.50. En la observación con MF la CFN para el tipo compacto fue 86.77 ± 2.60, para CP5 62.52 ± 3.26 y CP8 78.60 ± 4.07 (P<0.05) (Cuadro 1).

El IFN observado mediante ML en los diferentes tratamientos fueron, para CC 6.13 ± 0.3, CP5 4.88 ± 0.13 y CP8 5.22 ± 0.1 (P<0.05). En la observación con MF los valores para el IFN fueron: CC 7.62 ± 0.55, CP5 4.67 ± 0.29 y CP8 5.53 ± 0.4 (P<0.05) (Cuadro 1). Al evaluar los métodos de observación microscópica para el IFN estos mostraron diferencias entre los tratamientos con respecto al grupo testigo (P<0.05).

La inducción de la apoptosis por los tipos capsulares de S. aureus, se evaluó mediante las características morfológicas del núcleo y el citoplasma apreciadas en los frotis teñidos con May Grunwald-Giemsa (Figura 1).

En la Figura 2 se observan los porcentajes de apoptosis entre los grupos: CC(+) 97.7 ± 1.28, CC(-) 27.13 ± 1.85, CC 35.44 ± 2.56, CP5 60.07 ± 4.21 y CP8 45.57 ± 4.34 (P<0.05).

En MF en los frotis húmedos teñidos con bromuro de etidio y naranja de acridina se observaron células viables de color verde y apoptóticas de color anaranjado. Las células apoptóticas presentaron zeiosis, fragmentación nuclear y en algunas se apreció la formación de cuerpos apoptóticos (Figura 3). Mediante esta técnica los valores de inducción de apoptosis fueron, CC(+) 95.61 ± 2.66, CC(-) 20.2 ± 1.77, CC 26.5 ± 1.65, CP5 52.78±3.29 y CP8 41.33 ± 2.32 respectivamente (P<0.05). En las técnicas de ML y MF se observaron diferencias entre los tratamientos con respecto al grupo testigo (P<0.05).

Por la técnica de ML y de MF se determinó la viabilidad de los PMN en el ensayo in vitro y la presencia de las células y los cambios relacionados con la apoptosis temprana y tardía. En el grupo testigo C(+) se observaron células apoptóticas identificadas por presentar zeiosis, cariopicnosis, fragmentación nuclear y formación de cuerpos apoptóticos⁽³⁰⁾. En los grupos experimentales CP5 y CP8 se identificaron PMN que presentaban características morfológicas de células apoptóticas en mayor proporción que el grupo C(-) y CC. Las diferencias observadas entre los tratamientos CP5 y CP8 son importantes para explicar el desarrollo de la infección por S. aureus, al mostrar que CP5 induce una mayor apoptosis en los PMN de las vacas lecheras. Las diferencias observadas entre la actividad de fagocitosis e inducción de apoptosis en los PMN bovinos ocasionada por CP5 y CP8 puede estar asociada también a la deficiente opsonización en presencia de anticuerpos y complemento en la leche al ocurrir la infección^(31,32).

En el estudio se demostró que CP5 de S. aureus indujo un porcentaje mayor de apoptosis en los PMN en comparación con el CP8 en las vacas lecheras. De acuerdo a lo reportado por Kampen et al⁽³³⁾, las cepas no capsuladas de S. aureus estimulan la actividad del estallido respiratorio en PMN bovinos, mientras que las cepas capsuladas estimulan pobremente la actividad. Un paso importante en el estallido respiratorio es la activación de la NADPH oxidasa. Algunos autores refieren que la activación de la NADPH oxidasa y la generación de oxidantes en el fagosoma del PMN humano y murino frente a S. aureus, previene la activación de la cascada de caspasas citoplasmáticas que induce la apoptosis por vía intracelular o extracelular⁽³⁴⁾. Asimismo Watts et al⁽³⁵⁾ observaron que las cepas de S. aureus CP5 a diferencia de las CP8 tienen mayor sobrevivencia en neutrófilos obtenidos de sangre de ratón.

En PMN los cambios típicos de la apoptosis se presentan a las 24 h después de la estimulación con un análogo sintético del péptido de muramil dentro del tejido mamario en las vacas jóvenes. Así mismo, después de 24 h de la administración de una solución PBS y lipopolisacáridos administrados en la glándula mamaria, se observaron alteraciones típicas de la apoptosis en los PMN, aunque el pico más alto se produjo a las 48 h postratamiento⁽³⁶⁾. En el presente trabajo los cambios típicos se presentaron a partir de una hora de incubación in vitro. Nilsdotter-Augustinsson et al⁽³⁷⁾, consideran una característica importante de la virulencia del S. aureus la modulación de la apoptosis en PMN aislados de sangre humana, y sugiere que S. aureus capsular puede modular la apoptosis en PMN bovinos y que el serotipo CP5 incrementa este proceso en mayor porcentaje que CP8.

Los resultados obtenidos en este estudio confirman que la cápsula es un factor de virulencia del S. aureus que afecta la actividad de fagocitosis, al reducir el IFN e inducir el proceso de apoptosis en los PMN de bovinos lecheros. La CP5 indujo un mayor grado de apoptosis, en comparación con los CP8 y compacto, lo cual podría estar relacionado con la persistencia de la infección intraglandular mamaria en el ganado lechero durante el desarrollo de la mastitis.

Los resultados obtenidos en este estudio confirman que la cápsula es un factor de virulencia del S. aureus que afecta la actividad de fagocitosis, al reducir el IFN e inducir el proceso de apoptosis en los PMN de bovinos lecheros.

AGRADECIMIENTOS

Al CONACYT por la beca 326195 para cursar estudios de Posgrado (PCARN-UAEM). Al PROMEP- SEP por el financiamiento otorgado al proyecto "Caracterización genotipica de Staphylococcus aureus de tipo capsular en aislamientos obtenidos de hatos lecheros de producción familiar del valle de Toluca" y a la Secretaría de Investigación de la UAEM en el proyecto "Variación genético de aislamientos de S. aureus MRSA obtenidos de vacas lecheras en unidades de producción familiar, clave 3484/2013CHT.

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