Secuencias nucleotídicas de la región ITS en familias S₁ y PL de maíces poliembriónicos*

Nucleotide sequences of ITS region in S₁ and PL families of polyembryonic maize

Marselino Avendaño-Sanchez¹, José Espinoza-Velázquez¹, Alondra Gutiérrez-López¹, Adriana Carolina Flores-Gallegos² y Raúl Rodríguez-Herrera^2§

¹ Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro-Departamento de Fitomejoramiento. Blvd. Antonio Narro 1923, Buenavista Saltillo México.

* Recibido: septiembre de 2014
Aceptado: febrero de 2015

Resumen

Poliembrionía (PEm) es una mutación poco frecuente en maíz (Zea mays L.) y se manifiesta en la formación y desarrollo de dos o más plantas por semilla. Los mecanismos y causas de la PEm no están aún definidos. El objetivo del presente trabajo fue determinar la similitud de la secuencia de la región ITS de plantas madre y su progenie PEm obtenidas por autofecundación (S₁) y polinización libre (PL). La progenie se obtuvo a partir de la población UA-IMM-BAP (braquíticas, alta poliembrionía). Se tomaron muestras de tejido foliar de madres y sus progenies de 3 familias de polinización libre y 3 familias de líneas S₁. Después de extraer ADN, se amplificaron las regiones genómicas ITS (Internal Transcribed Spacer) mediante PCR y posteriormente se secuenció los fragmentos amplificados. La comparación de las secuencias ITS dentro de cada familia mostro cierta similitud, pero no fueron idénticas en las familias PL2, PL4, PL5 y S5. Sin embargo, en las familias S3 y S7 la comparación entre la secuencia de la madre y su descendencia (S3m vs S3P22 y S7m vs S7P22) presentó 100 % de similitud. La similitud encontrada entre las secuencias de ITS de plantas madre y descendientes PEm sugieren una probable relación entre la poliembrionía y apomixis.

Palabras clave: Zea mays L., diversidad nucleotídica, ITS, líneas S₁, polinización libre, similitud.

Abstract

Keywords: Zea mays L., ITS, nucleotide diversity, open pollinated, S₁ lines, similarity.

Introducción

La poliembrionía (PEm) es una variante genética en maíz, que se refiere a la producción de dos o más plántulas por semilla, emergiendo simultáneamente desde el momento de la germinación (Espinoza et al., 1998). La PEm se ha reportado como una mutación natural que aparece esporádicamente en baja frecuencia (Castro, 1979; Pilu, 2000), aunque también se ha reportado como mutación inducida (Morgan y Rappleye, 1951). El maíz poliembriónico presenta características de alto potencial agronómico, como son alta calidad proteica (15 a 20% más lisina) y mayor cantidad de grasa cruda en el grano (de 30 a 50%) que la encontrada en maíz común (González et al., 2011). Además, su capacidad de semilla prolífica produce una mayor cantidad de materia seca por semilla de siembra (Castro, 1979). Estos atributos hacen que este fenómeno haya sido estudiado por diferentes investigadores(as) en los últimos 100 años (Kempton, 1913; Weatherwax, 1921; Kiesselbach, 1926, Randolph, 1936; Skovested, 1939; Morgan y Rappleye, 1951; Kermicle, 1969, 1971; Pesev et al, 1976; Castro, 1979; Rebolloza et al., 2011; Espinoza et al., 2012).

Se ha propuesto que los embriones adicionales en la semilla pueden resultar de la diferenciación y desarrollo de varios tejidos maternos que están asociados al saco embrionario. Bhojwani y Bhatnagar (1974) indican que la poliembrionía puede surgir en angiospermas por diferentes mecanismos: 1) mediante la formación de gemelos o tripletes a partir de una célula huevo pro-embrionaria (cleavage); 2) por la formación de embriones a partir de células del saco embrionario diferentes a la ovocélula; 3) por el desarrollo de más de un saco embrionario dentro del mismo óvulo derivado de la misma célula madre de la megaespora o de células de la nucela; y 4) por la activación de una célula somática o esporofítica del óvulo para formar un embrión, en forma natural. También, en forma artificial, se puede inducir con la fitohormona 2-4-D en sacos embrionarios 2 días después de la polinización (Erdelska y Vidovencova, 1992; Erdelska, 1996).

Sin embargo, a la fecha aún existen lagunas en el conocimiento de la PE por lo que se han propuesto diferentes mecanismos genéticos que controlan la PE en maíz: desde herencia por un gen mendeliano, la interacción de dos genes y control genético de tipo cuantitativo. Investigaciones iniciales en el Instituto Mexicano del Maíz "Dr. Mario E. Castro Gil" (IMM) de la Universidad Autónoma Agraria "Antonio Narro" se propuso que la PE se heredaba de manera cuantitativa (heredabilidad de 0.65; Castro, 1979; Espinoza et al., 1998). La primera vez que se observaron maíces PE en poblaciones del IMM-UAAAN fue en una población denominada SSE, base de los maíces súper-enanos.

Originalmente, la condición de plantas gemelas se presentó en frecuencias de 1 a 2% (Castro, 1979). A partir de esas plantas, en este Instituto se generaron dos poblaciones PE que en la actualidad presentan frecuencias de 55 a 65% del mutante. Estas poblaciones de maíz fueron denominadas: UA-IMM-BAP (braquítica de alta frecuencia poliembriónica) y UA-IMM-NAP (porte normal de alta frecuencia poliembrionía). Conviene señalar que estas dos poblaciones serán referidas en lo sucesivo como BAP y NAP. Estudios posteriores sobre la herencia de la poliembrionía en estas poblaciones han permitido determinar y validar un modelo de herencia cualitativa, controlada por dos loci en interacción génica epistática recesiva duplicada del tipo 15:1 en segregación F₂ y de 12:4 en CP, cruza de prueba, presentando además el fenómeno de penetrancia incompleta (PI), por lo que el carácter se expresa generalmente de 30 a 70%, aunque es posible que en determinadas combinaciones híbridas entre genotipos PE de BAP y NAP con materiales exóticos, las progenies F2 y CP muestren 100% de poliembrionía en la proporción esperada de 1/16 o 4/16, respectivamente (Rebolloza et al., 2011).

Otros fenómenos reproductivos también se han asociado a la poliembrionía. Webber (1940) señalo que muchos casos de formación de células adventicias en angiosperma se refieren realmente a la apomixis y que es muy probable que la PE y la apomixis puedan estar interconectadas. Espinoza y De León (2005) reportaron que con base en el historial poliembriónico y poliploide de las poblaciones de maíz BAP y NAP, además de los trabajos preliminares sobre la conducta reproductiva atípica en maíz, se puede plantear que estas poblaciones pudieran contener la capacidad de manifestar reproducción asexual por semilla (apomixis). La introducción de la característica apomixis en maíz se ha intentado mediante retrocruzas convencionales usando como fuente de este fenómeno reproductivo a especies del género Tripsacum y se ha podido generar semillas viables de esta hibridación intergenérica. Algunas semillas se produjeron de manera apomíctica cuando fueron polinizadas utilizando maíz común (Leblanc et al., 1996), lo que sugiere que la fuente de polen también puede estar relacionada con apomixis y quizás con PE.

Por otra parte, el rDNA (ácido desoxirribonucleico ribosómico) nuclear tiene muchas copias, que se repiten en tándem; se trata de un sistema complejo que incluye los genes 18S, 28S, 5S y 5.8S. Las secuencias de estos genes están separadas por espaciadores internos ITS (Internal Transcribed Spacer). Estas regiones son fáciles de amplificar y alinear, tienen una alta tasa de mutación, y son relativamente pequeñas (Baldwin et al., 1995), por lo que son de gran interés en el estudio de identificación y tipificación de especies (Rogers y Bendich, 1987). Además, el análisis de la secuencia de los ITS ha probado ser útil para establecer relaciones filogenéticas en familias de plantas tales como las Poaceae (Hsiao et al., 1995). En el presente trabajo se compararon las secuencias nucleotídicas de la región ITS en familias S₁ y PL de la población BAP, desarrollada por el IMM-UAAAN con la finalidad de establecer la relación de identidad que existe entre los individuos de cada familia.

Materiales y métodos

Material genético. Dentro de la población BAP se realizaron 50 autofecundaciones con el fin de seleccionar las mazorcas más sanas y con mayor número de granos para obtener así un total de 20 progenies S₁. Además, en la misma población, se dejaron 50 plantas a polinización abierta, y se seleccionaron las mazorcas de la forma antes descrita para obtener un total de 20 familias de polinización libre (PL). Las familias S₁ y PL fueron obtenidas bajo condiciones de campo en el ciclo primavera-verano 2010 en Buenavista, Saltillo, Coahuila, México [25° 21’ latitud norte, 101° 02’ longitud oeste, 1 756 msnm (CETENAL, 1975)]. De las plantas adultas poliembriónicas en plena floración que fueron seleccionadas en el campo para generar a las familias S₁ y PL, se colectó muestras de tejido de la lámina foliar, las cuales fueron etiquetadas de forma individual. El material vegetal se almacenó a -50 °C para la posterior extracción de ADN.

Evaluación en invernadero. Las semillas de las familias S₁ y PL se sembraron bajo condiciones de invernadero y fueron evaluadas a los 15 días de la siembra por su porcentaje de germinación, porcentaje de plántulas anormales y frecuencia de la poliembrionía. Cada familia fue representada por 20 semillas, con dos repeticiones, sembradas en charolas de germinación. El experimento se estableció bajo un diseño completamente al azar con dos repeticiones. A los 15 días se recolectó tejido de la lámina foliar de las progenies (plantas individuales y poliembriónicas), tanto de las S₁ como de PL. Las muestras de tejido fueron etiquetadas de forma individual. Debido a que a la fecha no se tienen líneas de maíz que presenten poliembrionía en 100% de los granos, una semilla puede producir solo una planta (cuando no se expresa la PE), o bien dos, tres o más plantas por semilla (cuando se expresa la PE); por lo tanto, en el muestreo de cada familia se colectó tejido vegetal de plantas individuales (provenientes de una sola semilla, y fueron etiquetadas como P1) y de dos plantas, provenientes de una semilla, etiquetando cada planta de forma individual, por ejemplo P2-1 y P2-2 (Figura 1). Las muestras de tejido vegetal fueron colocadas en bolsas con cierre hermético y después almacenadas en congelación (-50 °C) para realizar posteriormente la extracción de ADN.

Extracción del ADN. Del tejido vegetal congelado tanto de la planta madre como de su descendencia (plantas individuales y poliembriónicas), de las familias S₁ y PL, se extrajo ADN según el protocolo propuesto por Ausubel et al. (1992), con algunas modificaciones. Se pesaron aproximadamente 0.1 g del material vegetal los cuales fueron colocados en nitrógeno líquido. Posteriormente, el material fue macerado hasta obtener un polvo fino, que fue transferido a un tubo de 1.5 ml; aquí, se agregó 1 ml de buffer de extracción CTAB [1.4 M NaCl (SIGMA-ALDRICH St Louis MO, USA), 100 mM Tris-HCl (SIGMA-ALDRICH St Louis MO, USA) pH= 8, 20 mM EDTA (SIGMA-ALDRICH St Louis MO, USA), 18.2 M CTAB], y 20 µl de albúmina sérica bovina (SIGMA-ALDRICH St Louis MO, USA) al 20%.

Se mezcló ligeramente en vortex y se incubó a baño maría a 55° C durante 20 min. Después de esto, se centrifugó a 10 625 x g por 5 min y se tomaron 600 µl del sobrenadante a los cuales se le agregó un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) (SIGMA-ALDRICH St Louis MO, USA). Se mezcló por inversiones suaves durante 1-2 min y se centrifugó por 10 min a 10 625 x g para recuperar la fase acuosa a la cual se le agregaron 50 µl de acetato de amonio 7.5 M (SIGMA-ALDRICH St Louis MO, USA) y 800 µl de etanol (SIGMA-ALDRICH St Louis MO, USA) frío al 96%. Se mezcló por inversiones suaves y se colocó en un congelador por 60 min para llevar a cabo la precipitación del ADN. Posteriormente, se centrifugo a 10 625 x g por 5 min y se descartó el sobrenadante.

La pastilla obtenida fue lavada dos veces con etanol (SIGMA-ALDRICH St Louis MO, USA) al 70% y finalmente se resuspendió en 80 µl de NaOH (SIGMA-ALDRICH St Louis MO, USA) 8 Mm y se almacenó a -20 °C. La integridad del ADN extraído fue evaluada mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% (p/v) en buffer SB (Borato de Sodio 5 mM) por 30 min a 90 V y visualizada bajo luz ultravioleta por tinción con bromuro de etidio (0.5 µg^-1ml). La calidad del ADN extraído se estimó mediante la relación de las absorbancias a 260 y 280 nm leídas en un espectrofotómetro Epoch™ (Bio-Tek) y se cuantificó mediante la lectura a 320 nm.

Amplificación y secuenciación de ITS. Para la amplificación de la región ITS (Internal Transcribed Spacer) se emplearon los iniciadores N18L (5’- AAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-‘3) (Eldenäs et al., 1998) y C26 A (5’-GTTTCTTTTCCTCCGCT-3’) (Oliveira et al., 2007). La amplificación se llevó a cabo en un volumen de 25 µl que contenía: Buffer 1X (Invitrogen, Carlsbad CA), 2 mM MgCl₂ (Invitrogen, Carlsbad CA a), 50 µM dNTPs (Invitrogen, Carlsbad CA.), 0.8 pmol de iniciador N18L y 0.8 pmol de iniciador C26 A, 2.5 U de Taq Platinum (Bioline, London UK); el volumen de ADN se ajustó para alcanzar una concentración de 100 ng. La reacción de amplificación (PCR) se llevó a cabo en un termociclador P x 2 Thermal cycler^® con un paso inicial de desnaturalización a 95 °C por 5 min, seguido de 35 ciclos (desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineamiento a 50.3 °C por 1 min y extensión a 72 °C por 1 min), y por ultimo una extensión final a 72 °C por 5 min.

Para la secuenciación de las regiones ITS se seleccionaron al azar tres familias S₁ (S3, S5 y S7) y tres PL (PL2, PL4 y PL5), donde se incluyó en cada familia, la planta madre (v.g. S3), una planta individual (proveniente de una sola semilla- v.g. S3P1) y plantas dobles (dos plantas provenientes de una sola semilla, v.g. S3P21 y S3P22), las cuales en el resto del documento serán mencionadas con su clave respectiva.

Análisis de polimorfismo de secuencias. Las secuencias obtenidas se compararon mediante la herramienta Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) de la base de datos del NCBI, optimizando para las secuencias altamente similares para verificar que correspondieran a la región ITS. Posteriormente, las secuencias fueron alineadas mediante el programa MAFFT v6 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software) utilizando los parámetros pre-establecidos, y el alineamiento obtenido se visualizó con el editor de secuencias BioEdit v7.13. En estos alineamientos se compararon las secuencias de la madre y su descendencia (plantas individuales y poliembriónicas). Para el análisis de polimorfismo en las secuencias nucleotídicas se utilizó el programa DnaSP DNA Sequence Polymorphism versión 5.10.01 (Librado y Rozas, 2009).

Resultados y discusión

Poliembrionia en familias PL y S₁

En las progenies de las familias (F₁ de PL y las S₁ de autofecundación) generadas, los porcentajes de germinación fueron superiores al 90%, condición deseable en materiales derivados de una población poliembriónica y más aún en líneas poliembriónicas S₁, debido al proceso de endogamia, que influye para deprimir la expresión fenotípica. Se encontró una frecuencia de plantas PE de entre 55 y 68% (Cuadros 1 y 2) lo cual coincide con las proporciones esperadas en estas poblaciones poliembriónicas del IMM-UAAAN (Espinoza et al., 1998). De hecho, la PE en algunas familias S₁ fue de 100%, lo cual es poco usual en casos previos de la misma condición endogámica (Rebolloza et al., 2011). Esto podría deberse a que el proceso de uniformidad genética que se involucra en autofecundaciones conduce a poner en homocigosis a los genes que influyen en la poliembrionía, pero también a los genes que la obstruyen, lo cual causa la penetrancia incompleta del carácter (Rebolloza et al., 2011).

En este sentido, las familias S₁ presentan una expresión variable y errática de la PE y en muchos casos el porcentaje de PE es inusualmente bajo o alto. En este estudio el rango de porcentajes de PE fue más amplio en las familias S₁ que en las familias PL; los porcentajes de PE observados en estas últimas familias se ajustaron más a los valores típicos de la población de origen UA-IMM-BAP (Espinoza y Vega, 2000). El número de plántulas anormales fue menor que aquellos valores (15-32%) reportados por Rebolloza et al. (2011) en poblaciones F₂. Estos autores sugieren que la naturaleza de la poliembrionía produce anormalidades en las plántulas, lo cual obstruye su desarrollo.

Comparación de las secuencias nucleotídicas de regiones ITS en familias S₁ y PL

El porcentaje de sitios invariables (monomórficos) en la familia PL2, generada por PL se encontró en un rango de 78% a 90%, indicando que tanto las secuencias de la madre como las de los hijos son de alto parecido genético pero no son idénticas (Cuadro 3). Esto podría atribuirse a que los sitios polimórficos estén dados por la complementariedad de los genes aportados por la variada fuente de polinizadores, aunado a que la madre es genéticamente parcialmente homogénea, ya que proviene de una familia de medios hermanos, por lo que también puede ser fuente de variabilidad. Dado el manejo reproductivo del grupo de PL donde no existió un control de los polinizadores, la procedencia del progenitor masculino fue desconocida, lo que indica que la proporción de similitud entre las secuencias de ADN de la madre e hijas se ajustan a la dotación genética que por la vía de gameto femenino otorgó la madre a cada una de las hijas.

En esta familia se observó que entre los cuatro genotipos (madre y tres hijas) ningún par comparado fue idéntico, aún entre las plantas dobles PE generadas de la misma semilla que, aunque mostraron una similitud de 90%, no fueron idénticas. Estos resultados sugieren que el origen genético de cada una de las platas doble es diferente, siendo las plantas dobles más parecidas a la planta madre que la planta individual. Por lo tanto, la relación entre la planta hija del tipo individual con las hermanas PE debe ser tal que refleje la diferencia del polen fecundante, por lo que se esperarían diferencias genéticas entre las plantas hermanas. El promedio general de sitios monomórficos para la familia fue 86% con desviación estándar de ± 4.5. En estas comparaciones se emplearon secuencias con una longitud de 261 a 297 nucleótidos.

Para la familia PL4 y PL5 los porcentajes de similitud fueron de 76 a 92% y de 82 a 90%, respectivamente (Cuadro 3), y se apreció que las plantas PE hermanas provenientes de la misma semilla, en la familia PL4 presentan el parecido más alto; sin embargo, no son idénticas lo que sugiere que los embriones contemporáneos que les dan origen tienen una base genética distinta. Si las plantas gemelas provinieran del mismo embrión deberían ser idénticas (100% de similitud), mientras que cuando tienen origen muy diferente, sea de célula gamética o somática la similitud será menor a 100%. En ambas familias PL4 y PL5 la similitud entre la madre y las plantas hijas (individual y doble) fue igual. Las secuencias de ADN que se compararon en la familia PL4 tuvieron una longitud de 282 a 299 nucleótidos, mientras que las secuencias de ADN que se compararon en la familia PL5 fueron en un rango de 288 a 299 nucleótidos.

En el grupo de familias procedente de autofecundaciones (Cuadro 4), la familia S3 presentó sitios invariables que van de 62 a 100% de similitud, resaltando que la comparación de la secuencia madre contra una hija poliembriónica (S3 vs S3P22) presentó 100% de similitud. Esto podría explicarse por: 1) la planta hija poliembriónica 2 se originó de una célula somática, probablemente de la nucela, que se desarrolló como embrión adventicio diploide, de la misma naturaleza genotípica que el tejido somático de la madre; ó 2) de dos plántulas hermanas PE, la poliembriónica 1 se originó por la vía de la doble fecundación (embrión 2n y endospermo3n) mientras que la planta-hija poliembriónica 2 se originó de manera atípica en el saco embrionario, a partir de una célula germinal no-reducida, de dotación 2n, idéntica a la madre. Por otro lado, la comparación madre-planta doble 1 (S3 vs S3P21) presentó el valor más bajo (62%). Igualmente que en los casos anteriores, las plantas dobles fueron diferentes entre sí.

En la familia S5 los sitios monomórficos se encontraron en un intervalo de 85 a 91% (Cuadro 4), en donde la comparación entre las secuencias de las plantas dobles mostró un mayor porcentaje de sitios polimórficos (15%), que las comparaciones de la secuencias de la planta individual con cualquiera de las plantas dobles v. g. planta individual con la planta doble-1 (91%, S5P1 vs S5 P21). Como en el caso S3, en la familia S7 existe una consistencia en la proporción de semejanza presentando una similitud de 100% entre la madre y una de las hijas PE (S7m vs S7P22), mientras que con la otra hija PE sólo presenta una semejanza de baja proporción; el intervalo de similitud para esta familia fluctuó en un rango de 72 a 100%.

La selección recurrente practicada en el manejo reproductivo en la población BAP ha permitido concentrar una alta frecuencia de los alelos recesivos que determinan la manifestación de la poliembrionía, de acuerdo al modelo de herencia propuesto por Rebolloza et al. (2011). Sin embargo, la catalogación hasta ahora de la frecuencia de PE en una familia determinada, dada una generación, ha sido solamente fenotípica, ya que la clasificación de las semillas de las que germinan simultáneamente dos y hasta siete plántulas, es sólo por observación visual cuidadosa y experimentada. Así, este es el primer estudio de las secuencias genómicas para determinar la identidad entre plantas poliembriónicas y uno de sus progenitores. Adicionalmente a la manifestación de la PE, una proporción menor, aunque notable, de casos de plántulas múltiples presentan también radículas múltiples (Espinoza et al., 2011). Cualquiera que fuera el significado en la modificación del sistema radical seminal, los genes de la poliembrionía parecieran tener un efecto pleiotrópico.

La propuesta de Erldeska (1996) sobre el origen de semillas poliembriónicas en maíz incluye la formación de gemelos o tripletes a partir de una célula huevo pro-embrionaria, originados por la división de la célula huevo de manera espontánea o después de alguna inducción, los cuales comparten un suspensor común, parte del escutelo y capas superficiales de radícula. Por ello, los embriones germinan con plúmulas separadas pero con un solo complejo radicular, lo que sugiere que las plantas gemelas serían genéticamente idénticas. Aunque este tipo de origen es uno entre varios de los que se han observado fenotípicamente en la población BAP (Espinoza et al., 1998; Espinoza et al., 2008; Espinoza et al., 2012), en este estudio en ningunas de las familias se pudo comprobar que las plantas gemelas fueran idénticas en sus secuencias nucleotídicas.

El otro tipo de origen son los casos de gemelos o tripletes que provienen de células huevo individual del saco embrionario o de células con capacidades multi-huevo que están estrechamente adheridas, pero separados por capas epidérmicas, con un endospermo en común; las plúmulas y radículas son independientes. En poca proporción, este tipo de surgimiento de plántulas se puede ver en las poblaciones poliembriónicas en estudio. Esta hipótesis tiene más relación con los resultados de las comparaciones de secuencias nucleotídicas obtenidos en el presente trabajo. También la PE puede originarse por embriones gemelos de sacos multi-embrionarios que comúnmente están ubicados en lados opuestos, o a distancia en el grano, los cuales carecen de tejidos comunes y germinan independientemente. Es poco común encontrar este tipo de origen en las poblaciones poliembriónicas bajo investigación pero existen, en proporciones muy bajas. Por otra parte, se ha reportado que los niveles de polimorfismo se incrementan a medida que el contenido de GC aumenta, al menos en secuencias genómicas cortas.

Sachidanandam et al. (2001) reportaron que contenidos de GC entre 45 a 55% tienen una correlación positiva con la diversidad nucleotídica. Sin embargo, en este estudio se encontró una correlación negativa de -0.52 (p< 0.05) entre el contenido de GC y la diversidad nucleotídica en las familias PL, con un contenido de GC entre 64 y 69%. En las familias S₁ no se apreció una correlación estadísticamente significativa entre las variables antes descritas, a pesar de que el contenido de GC fue muy similar al de las familias PL (63 a 69%).

Conclusiones

En la población de maíz poliembriónico evaluada se comprobó mediante el análisis de secuencias de la región ITS que, en algunos casos, la secuencia de una plántula doble (dos plantas provenientes de una sola semilla) tenían 100% de similitud a la planta madre. Por otra parte, también se apreció que plantas dobles (provenientes de una sola semilla) no necesariamente tienen el mismo origen, dado que difieren en su secuencia ITS. En algunas familias una de las plantas dobles, mostró mayor similitud con la planta individual (provenientes de una sola semilla) que con su planta gemela.

Agradecimientos

Este proyecto fue financiado por la Universidad autónoma Agraria Antonio Narro y la Universidad Autónoma de Coahuila. M A S, A G L, y A C F G agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por el apoyo económico proporcionado en forma de beca para sus estudios de postgrado.

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