Efecto de una película de hidroxipropilmetil celulosa-parafina en melón Cantaloupe (Cucumis melo) almacenado en frío*
Effect of a film of hydroxypropyl methylcellulose-paraffin in Cantaloupe melon (Cucumis melo) stored in cold
Jorge Armando Meza Velázquez1,2, Guadalupe Alanís Guzmán2, Carlos Leonel García Díaz2, Manuel Fortis Hernandez3, Pablo Preciado Rangel3 y Juan Ramón Esparza Rivera1§
1Facultad de Ciencias Químicas Gómez Palacio, Universidad Juárez del Estado de Durango Avenida Artículo 123 S/N Fraccionamiento Filadelfia C.P. 35010, Gómez Palacio, Durango, México. (jameza20002000@yahoo.com.mx). §Autor para correspondencia: jresparza02001@yahoo.com.
]]> 2 Universidad Autónoma de Nuevo León, Avenida Universidad s/n, Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, Nuevo León, México. (guadalupe.alanis@gmail.com); (carlos.garciadz@uanl.edu.mx).3 Instituto Tecnológico de Torreón, Carretera Torreón-San Pedro km 7.5, Ejido Ana. Torreón, Coahuila, México. (mforty05@yahoo.com.mx); (pablopreciado@gmail.com).
* Recibido: junio de 2012
Aceptado: enero de 2013
Resumen
El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de una película a base de hidroxipropilmetil celulosa y parafina sobre el índice de daños por frío (IDF), pérdida de peso, actividad enzimática de la lipasa y composición de la atmósfera interna del fruto en melón Cantaloupe (Cucumis melo). Los frutos de melón enteros cubiertos [PEL], y no cubiertos [control]) fueron almacenados a 8 ºC (80% HR) por 20 días, y evaluados a los 0, 4, 8, 12, 16 y 20 días de almacenamiento. Los melones PEL tuvieron menor índice de daños por frío (IDF= 1.25), y mayor concentración de CO2 (5.1-11.8 %) y etileno (45.0-200.0 ppm) en el espacio interno del fruto que los melones no cubiertos (p< 0.05) durante el almacenamiento a 8 ºC. Los resultados señalan que la aplicación de la cubierta de hidroxipropilmetil celulosa-parafina reduce 50% los daños por frío en melón Cantaloupe entero mínimamente procesado almacenado en refrigeración por 20 días, contribuyendo a la conservación de la calidad de este fruto.
Palabras claves: Cucumis melo, celulosa daños por frío, hidroxipropilmetil película.
]]> Abstract
The objective of this study was to evaluate the effect of a film based on hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC) and paraffin on chilling injury index (IDF), weight loss, the lipase enzyme activity and composition of the internal atmosphere in Cantaloupe melon (Cucumismelo). The whole melon covered [PEL], and not covered [control]) were stored at 8 °C (80% RH) for 20 days, and evaluated at 0, 4, 8, 12, 16 and 20 days of storage. PEL melons had less chilling injury index (IDF= 1.25), and higher concentrations of CO2 (5.1-11.8%) and ethylene (45.0-200.0 ppm) in the internal space of the fruit than the not covered melons (p< 0.05 ) during storage at 8 °C. The results indicate that the application of a cover of HPMC-paraffine reduces 50% chilling injury in whole melon minimally processed stored in refrigeration for 20 days, contributing to the preservation of fruit quality.
Key words: Cucumis melo, cellulose, chilling injury, hydroxypropylmethyl film.
Introducción
El melón Cantaloupe (Cucumis melo) es un fruto de limitada vida de anaquel (máximo de 15 días bajo almacenamiento a 5 ºC) (Bachmann y Earles, 2000), el cual es comercializado principalmente como producto mínimamente procesado (lavado, sin remoción de cáscara y no empacado). Además, esta variedad de melón no es tolerante a procesos térmicos de conservación de alimentos tales como el escaldado, cocimiento o congelación. Asimismo, la refrigeración (almacenamiento del producto a temperaturas cercanas a la congelación) es un método de conservación utilizado para mantener la calidad sensorial del melón Cantaloupe, debido a que las bajas temperaturas reducen el ritmo respiratorio, deshidratación, actividad enzimática, maduración y envejecimiento del producto (Ferreira et al., 1994; Karel y Lund, 2003). Sin embargo, la refrigeración del melón Cantaloupe presenta algunas desventajas incluyendo el desarrollo de daños por frío, lo cual afecta la calidad visual del producto debido a la aparición de manchas oscuras en la cáscara de la fruta (Flores et al., 2004; Lurie y Crisosto, 2005; Mangaranis et al., 2008). Además, durante el almacenamiento del melón bajo refrigeración se presenta deshidratación (Artés y Artés-Hernández, 2003; Lurie y Crisosto, 2005), así como cambios tanto en la actividad hidrolitica de enzimas como la lipasa (Lamikanra y Watson, 2004), como en la concentración de dióxido de carbono y etileno en el espacio interno del fruto (Paul y Pandey, 2012). Estos procesos y cambios contribuyen al deterioro de la calidad sensorial del fruto, por lo cual es requerida la evaluación de métodos alternativos de conservación del melón Cantaloupe mínimamente procesado.
Se han propuesto diferentes métodos para retardar la maduración durante el almacenamiento de productos vegetales, incluyendo la aplicación de películas o cubiertas. Una película o cubierta es una capa delgada de material aplicada sobre la superficie de un alimento, o sobre componentes alimenticios de un producto (Gordon, 1986). Los materiales usados en la formulación de cubiertas o películas consisten principalmente en polisacáridos, como la celulosa y sus derivados incluyendo la hidroxipropilmetil celulosa (Ayranci et al., 1997), proteínas y lípidos tales como triglicéridos, ceras y parafinas (Rhim y Shellhammer, 2005; Sohail et al., 2006; Dogan y McHugh, 2007), los cuales pudieran ser combinados para obtener películas compuestas (Han y Gennadios, 2005; Hernández-Izquierdo y Krochta, 2008). Las películas compuestas generalmente son formuladas en forma de bicapa de polisacáridos y lípidos, emulsiones (Han et al., 2006; Maftoonazad et al., 2007), y también como combinaciones de proteínas y lípidos (Sohail et al., 2006; Fabra et al., 2008).
Dentro de las ventajas de las películas formuladas con polisacáridos y proteínas destacan sus excelentes propiedades como barrera a los gases (dióxido de carbono, etileno y oxigeno), aunque su naturaleza hidrofílica limita su capacidad de impermeabilidad. Por otro lado, las películas elaboradas con lípidos actúan efectivamente como barreras contra la humedad debido a su baja polaridad y naturaleza hidrofóbica (Talens y Krochta, 2005).
La aplicación de películas sobre la superficie de los vegetales provee una barrera a la humedad y los gases, lo cual generalmente resulta en una disminución de la deshidratación y ritmo respiratorio del producto (Krochta y De Mulder-Johnston, 1997; Vigneault et al., 2000; Pérez-Gago et al., 2002). Además, algunas cubiertas aplicadas en vegetales han comprobado su eficacia no solo para disminuir la actividad metabólica del producto, sino también para conservar su calidad sensorial durante el almacenamiento a bajas temperaturas.
Los objetivos del estudio fueron evaluar el efecto de una película de hidroxipropilmetil celulosa-parafina sobre daños por frío, pérdida de peso, actividad enzimática de la lipasa, y composición de la atmósfera interna del fruto en melón Cantaloupe refrigerado por 20 días.
]]>Materiales y métodos
Muestras experimentales. Se utilizaron frutos de melón Cantaloupe (Cucumis melo L. var. reticulates) recolectados en Ceballos, Durango en etapa pre climatérica (25 a 27 días después de polinización) de acuerdo con el método publicado por Nishiyama et al. (2007), siendo seleccionados frutos en estado de madurez ¾ desprendido (Beaulieu et al, 2004), de tamaño y dimensiones similares (frutos de 1.2 a 1.5 kg libres de daños físicos). Los melones enteros fueron lavados con agua potable (para remoción de suciedad y tierra), sumergidos en una solución de hipoclorito de sodio (200 ppm) por 2 min, y luego secados para la aplicación de la cubierta o película dentro de las 4 h posteriores a la recolección.
Materiales y reactivos. Los reactivos metabisulfito de sodio, sorbato de potasio, monoestearato de propilenglicol, D-metilo de ácido poligalacturónico, sulfato de amonio, tris, sulfato de amonio, laurato de p-nitrofenilo, dodecil sulfato de sodio, Triton X-100, azul de bromotimol, y estandares de CO2 y etileno fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MI, EUA). Se empleó parafina grado reactivo (Analítika, México), y la hidroxipropilmetil celulosa (HPMC) fue donada por Colorcon (México).
Preparación de la película HPMC-parafina. La película fue preparada usando una modificación del método publicado por Cisneros-Zevallos y Krochta (2003). Se solubilizó primeramente la HPMC (2.5%) en agua destilada caliente (90 ºC), enfriando después la mezcla a 10 ºC. La solución de HPMC luego fue calentada a 80 ºC, y se le añadió monoestearato de propilenglicol (0.25%), aceite de maíz (0.2%), metabisulfito de sodio (0.025%), y sorbato de potasio (0.1% p/v). Finalmente fue añadida la parafina (25%) a la solución caliente, agitando con un homogeneizador Ultraturrey T18 (IKA® Works, Inc, Wilmington, EUA) a 15000 rpm durante 10 min. La emulsión formada fue enfriada a 7 ºC y almacenada a esta temperatura hasta su aplicación (no más de 48 h después de su elaboración). La formulación de la cubierta y grosor de la película aplicada fueron determinados en pruebas preliminares con la finalidad que la película fuera maleable y adherible al producto, además que tuviera permeabilidad a la humedad así como estabilidad en las condiciones de almacenamiento del estudio.
Tratamientos. Los frutos de melón lavados fueron distribuidos al azar en dos tratamientos: control (no cubiertos), y PEL (cubiertos con la película de HPMC-parafina), con 23 frutos enteros de melón por tratamiento. La cubierta fue aplicada uniformemente sobre la superficie total de los frutos de melón (grosor de la película= 0.063 a 0.122 mm) usando una modificación del método publicado por Conforti y Zinck (2002), y luego los frutos cubiertos fueron expuestos a una corriente de aire (9 a 10 m/s) a 20 ºC durante 40 a 50 min para secar la película aplicada. Las muestras de frutos enteros (control y cubiertos con película) fueron almacenadas en frío (8 ± 2 ºC y humedad relativa de 80 ± 4 %) por 20 días. Las variables evaluadas fueron: índice de daños por frío, pérdida de peso, actividad enzimática de la lipasa, y composición de atmósfera interna del fruto (concentración de CO2 y etileno en el espacio interno del fruto de melón). Se realizaron ocho repeticiones de los tratamientos (n= 23 frutos enteros por tratamiento en cada repetición). Los frutos de melón fueron evaluados a los 0, 4, 8,12, 16 y 20 días de almacenamiento. Los intervalos para evaluación de los frutos fueron determinados en pruebas preliminares.
Pruebas analíticas
Índice de daños por frío (IDF)
La determinación del IDF se realizó utilizando la escala de valores de 0 a 4 propuesta por García-Sahagún et al. (2005), donde 0= fruto sin daño; 1= daño ligero (10% o menos de la superficie del fruto dañada); 2= daño moderado (10 a 15% de la superficie); 3= daño regular (15 a 25% de la superficie dañada, producto no apto para comercialización); y 4= daño severo (más de 25% de la superficie del fruto dañado). La evaluación fue realizada en cuatro frutos de melón por tratamiento. El cálculo del IDF fue obtenido usando la fórmula 1:
]]> IDF = [(n)0 + (n)1 + (n)2 + (n)3 + (n)4] / N ...........(Fórmula 1)Donde: n = número de frutos dañados; y N= número de frutos por tratamiento.
Pérdida de peso
El peso de los frutos enteros de melón fue obtenido utilizando una balanza granataria digital Ohaus (Ohaus de México, México), y se pesaron cinco frutos de melón por tratamiento para cada tiempo de almacenamiento establecido.
Obtención del extracto para medición de actividad enzimática
La obtención del extracto enzimático fue realizada mediante una modificación del método descrito por Lamikanra y Watson (2004). Fueron mezclados 40 g de pulpa de melón con 80 mL de buffer Tris (pH 7.8, 0.05 M) y homogenizados en una mezcladora por 2 min. La mezcla fue luego centrifugada a 4 800 x g a 4 ºC durante 30 min, y el sobrenadante fue mezclado con sulfato de amonio hasta alcanzar una concentración de 60%. Después, la solución fue mantenida en congelación (a -18 ºC) por 1 h, y luego fue centrifugada a 4 800 x g a 4 ºC por 1 h, desechando el sobrenadante. El residuo fue mezclado con 4 mL de Tris por 1 min, centrifugando la mezcla a 4 800 x g a 4 ºC por 1.5 h, y el sobrenadante fue recuperado y utilizado como el extracto enzimático para la prueba de medición de la actividad de la lipasa. La muestra para la obtención del extracto fue obtenida de la mezcla de pulpa de dos frutos de melón en cada tiempo de almacenamiento.
Medición de la actividad enzimática de la lipasa
]]> La actividad enzimática de la lipasa fue determinada mediante una modificación del método publicado por Lamikanra y Watson (2004), utilizando laurato de p-nitrofenilo (p-NPL) como sustrato. El sustrato de p-NPL fue preparado mezclando 0.0135 g de p-NPL con 0.017 g de dodecil sulfato de sodio en 100 mL de Triton X-100 al 1%, calentando la solución en baño maría a 65 ºC por 25 min. La mezcla fue luego agitada en vortex y enfriada a temperatura ambiente. La prueba fue realizada mezclando 1 mL de la solución sustrato de p-NPL, 1 mL de buffer de tris (0.005 M y pH de 8.2), y 0.66 mL de extracto, iniciando la reacción al adicionar el extracto enzimático. La absorbancia de la mezcla fue leída en un espectrofotómetro UV-HACH 4000 (HACH, EU) a una longitud de onda de 410 nm, usando como blanco mezcla sin adición del extracto enzimático. La actividad enzimática de la lipasa fue determinada como la velocidad de reacción entre los 10 y 70 s del tiempo de reacción, reportándose como porcentaje de actividad relativa.
Atmósfera interna del fruto entero (concentración de CO2 y etileno)
La determinación de la concentración de CO2 y etileno en el espacio interno del fruto (composición de la atmósfera interna de los frutos enteros) fue realizada mediante el método publicado por Pérez-Gago et al. (2002). Se tomó muestra del contenido de gas del espacio interno (aproximadamente 5 mL) del melón entero sumergido en un recipiente con agua potable, inyectándose un volumen de 1 mL de la muestra a un cromatógrafo de gases HP 6820 (Agilent Technology, CA, EUA). La concentración de CO2 fue determinada en el cromatógrafo de gases adaptado con una columna empacada Alltech CTR I de 6 pies por ¼ de pulgada (Alltech Associates, Inc., Deerfield, Illinois, EU), y un detector de conductividad térmica; teniendo una temperatura del inyector de 20 ºC, en el detector de 170 ºC, y en la columna de 35 ºC.
La determinación de la concentración de etileno fue realizada en el mismo cromatógrafo adaptado con una columna Carboxen de 30 m x 0.5 mm x 0.25 µm (Supelco, PA, EUA), y un detector de ionización de flama; la temperatura del inyector fue 120 ºC y la del detector de 250 ºC; con una temperatura inicial de la columna de 35 ºC, la cual fue aumentada 20 ºC/min hasta 120 ºC. Las lecturas del cromatógrafo fueron analizadas con el software Agilent Cerity NDS (Agilent Technologies, EUA), y comparadas con curvas de calibración de estándares de CO2 y etileno. La medición fue llevada a cabo en dos frutos de melón por tratamiento en cada tiempo de almacenamiento.
Análisis estadístico. Los resultados de las variables evaluadas fueron analizados mediante una prueba t de student para muestras independientes (muestras cubiertas PEL vs muestras CTL en cada tiempo de almacenamiento) con un nivel de significancia de 0.05, usando el programa estadístico SAS versión 8 (SAS Institute Inc. 2005).
Resultados y discusión
Efecto de la película de HPMC-parafina sobre el daño por frío en melón Cantaloupe
Los frutos cubiertos con la película de hidroxipropilmetil celulosa-parafina (PEL) tuvieron menor índice de daño por frío (p< 0.05) que los melones sin película (CTL) desde el día 8 de almacenamiento a 8 ºC (Figura 1). Asimismo, los melones PEL presentaron IDF de 1.25 ± 0.3 (considerado como daño ligero a moderado) a los 20 días de almacenamiento, mientras que los frutos sin cubierta tuvieron valores de 2.50 ± 0.2 (considerados como daños moderados a regulares). Flores et al. (2004) afirman que el daño por frío en melón Charentais está asociado con estrés hídrico o deshidratación. En el presente estudio no hubo diferencia en pérdida de peso de los frutos (p> 0.05) durante el almacenamiento (Figura 2), teniendo pérdidas de peso 14.3% (frutos PEL), y 16.3% (frutos control) al día 20 de almacenamiento.
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Los resultados obtenidos indican que los frutos de ambos tratamientos tuvieron niveles de deshidratación similares debido a las condiciones de almacenamiento (baja temperatura y alta humedad relativa), y a la permeabilidad de la película a la humedad (Cisneros-Zevallos y Krochta, 2002). Las películas que contienen lípidos y ceras generalmente son barreras efectivas para la humedad debido a su baja polaridad y naturaleza hidrofóbica (Talens y Krochta, 2005), pero tienen baja cohesividad e integridad estructural. La formulación de la cubierta aplicada incluyó un máximo 25% de parafina, lo que contribuyó a que la película fuera adherible al producto pero con limitada impermeabilidad a la humedad, lo cual explica los niveles de deshidratación obtenidos en el experimento.
Respecto a los daños por frío, se puede establecer que en esta variedad de melón no es directamente atribuible a los niveles de pérdida de humedad (deshidratación) del producto refrigerado, siendo posible que el desarrollo de este problema en melón Cantaloupe sea inducido por otros factores, como pudiera ser la exposición del fruto a etileno (Nair y Singh, 2003; Nishiyama et al., 2007).
Los resultados obtenidos indican que la aplicación de la película de HPMC-parafina formulada pudiera ayudar a proteger al melón Cantaloupe almacenado en refrigeración contra daños por frío hasta por 20 días, contribuyendo a mantener la calidad comercial de esta variedad especifica de melón, ya que se ha reportado que la aplicación de una cubierta o película puede tener muy variable respuesta dependiendo de la variedad y tipo de producto vegetal (Olivas y Barbosa-Cánovas, 2005), por lo que no es posible generalizar sus efectos y usos.
Efecto de la cubierta de HPMC-parafina sobre actividad enzimática de la lipasa y la composición de la atmosfera interna en melón Cantaloupe
Los resultados de medición de la actividad enzimática de la lipasa indican una disminución en todas las muestras durante el almacenamiento en frío, manteniéndose en 44-64% de actividad relativa en los melones no cubiertos (Figura 3), mientras que en los frutos con película se tuvieron valores entre 45-70%. Además, la actividad relativa de la lipasa fue mayor (p< 0.05) en los frutos con cubierta (PEL) a los 4 días de almacenamiento, pero no fue diferente entre tratamientos a partir del día 8, manteniéndose entre 50-60%.
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Lamikanra y Watson (2004) explican que la lipasa del melón Cantaloupe contribuye al desarrollo del sabor en esta fruta mediante al hidrolizar triglicéridos hasta ácidos grasos y glicerol, pero que en melón refrigerado esta enzima junto con esterasas endógenas causa deterioro textural. Asimismo, estos investigadores reportan que la lipasa en melón Cantaloupe troceado es relativamente estable al ser expuesta a temperaturas de hasta 70 ºC, además que su actividad relativa se mantuvo constante hasta por 5 días en rodajas de esta variedad de melón almacenadas a 4 ºC, y luego disminuyo al 45% durante el almacenamiento de las muestras a 15 ºC.
Estos resultados difieren a los encontrados en el presente estudio, siendo posible que las diferencias en actividad enzimática sean atribuibles al diferente tipo de procesamiento de las muestras (fruto entero o rebanado). Así pues, en el presente estudio la actividad enzimática de la lipasa del melón Cantaloupe mínimamente procesado (cubierto y control) disminuyó durante el almacenamiento en frío, teniéndose una mayor actividad de esta enzima en las muestras cubiertas únicamente en el día 4 de almacenamiento. Estos eventos pudieran estar relacionado con otros cambios fisiológicos post cosecha reportados en frutos climatéricos, como aumentos en la concentración de etileno en el espacio interno del fruto.
Respecto a la composición de la atmósfera interna del melón, las muestras cubiertas con la película tuvieron durante el almacenamiento una mayor concentración de CO2 (p< 0.05) que los melones control. Además, ambos tratamientos presentaron un descenso en la concentración del dióxido de carbono el día 4, seguido de un aumento gradual desde ese día hasta el día 16 (Figura 4a). Paul y Pandey (2012) reportan que el melón es un producto vegetal de tipo no climatérico; sin embargo, los resultados obtenidos confirman que el melón Cantaloupe debe ser considerado como un producto climatérico como ha sido reportado por Nishiyama et al. (2007), teniendo su pico climatérico (aumento en producción de etileno) a los 4 días de su recolección (Figura 4b).
Por otra parte, la concentración de etileno en el espacio interno de los melones PEL fue más alta que en el melón no cubierto durante todo el almacenamiento (p< 0.05) con excepción del día 8, alcanzando 200 ppm el día 16. Estos niveles de concentración de etileno acumulados en la atmósfera interna del producto cubierto son atribuibles a la impermeabilidad de la película contra este gas, lo que dificulto su emisión a través de la cáscara del fruto. Se ha reportado que algunas cubiertas o películas compuestas actúan como barrera restrictiva del intercambio de humedad y gases, principalmente CO2, etileno y oxigeno (Han y Gennadios, 2005; Dogan y McHugh, 2007), lo cual puede contribuir a reducir el deterioro de calidad de algunos productos vegetales durante etapas poscosecha.
En el presente estudio se observa que la aplicación de la cubierta reduce 50% los daños por frío en el fruto almacenado en refrigeración, lo cual está asociado con la concentración de etileno en la atmósfera interna del melón cubierto. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por otros investigadores, en los cuales Nair y Singh (2003) reportan menores daños por frío en mango (Mangifera indica L., cv. Kensington Pride) tratado con ethrel (2-cloroetil ácido fosfonico), el cual es un agente inductor de producción de etileno; mientras que Ben-Amor et al. (1999) señalan que la exposición de melón Honeydew a altas concentraciones de etileno redujo el daño por frío en este producto hasta 75%.
Se estableció que el menor daño por frío presentado en el fruto entero de melón cubierto por la película HPMC-parafina durante el almacenamiento por 20 días a 8 ºC fue causado por la exposición de la pulpa del melón al etileno acumulado en el interior del fruto (de 50 a 200 ppm). Es requerida más evaluación del efecto de la aplicación de altas concentraciones de etileno sobre los diferentes tejidos constituyentes del producto entero (cáscara y pulpa), además que resulta de interés el estudio del efecto del etileno como potencial agente protector contra los daños por frío en melón Cantaloupe, tanto en producto mínimamente procesado con cáscara o en pulpa de esta fruta.
]]>Conclusiones
Los frutos de melón Cantaloupe enteros cubiertos con la película de hidroxipropilmetil celulosa-parafina mostraron menores daños por frío durante el almacenamiento bajo refrigeración por 20 días en comparación con los frutos no cubiertos. Por otra parte, la aplicación de la cubierta resulto en una reducción en la actividad enzimática de la lipasa y un mayor contenido de dióxido de carbono y etileno en la composición de la atmósfera interna del fruto refrigerado, sin afectar la pérdida de peso del producto. Es requerida la evaluación de la aplicación de altas concentraciones de etileno sobre los diferentes tejidos constituyentes del fruto (cáscara y pulpa), como potencial agente protector contra los daños por frío en melón Cantaloupe mínimamente procesado. Se concluye que la aplicación de la película de hidroxipropilmetil celulosa-parafina en frutos de melón Cantaloupe enteros almacenados a 8 ºC pudiera contribuir a la conservación de la calidad de este producto por periodos de almacenamiento más prolongados.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo invaluable de Rafael Minjares Fuentes y María Concepción Reyes Ávalos en la realización de este estudio, y a la Dra. Gabriela Ramos Clamont por su apoyo en la revisión de este artículo. Asimismo, se agradece al Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de Durango (COCYTED) por el financiamiento otorgado al Proyecto DGO-2006-C01-43720 (Fondo Mixto CONACYT-Gobierno del estado de Durango); así como a la Distribuidora BEBO S. P. R de R. L por su participación en la presente investigación.
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