Presencia de integrones clase I en Escherichia coli aislada de productos cárnicos en plantas Tipo Inspección Federal (TIF) en el Estado de México

Presence of class I integrons in Escherichia coli isolated from meat products in Federal Inspection Type (TIF) plants in the Estado de Mexico

Raquel Fuentes Arriaga* Martín Talavera Rojas* Jesús Vázquez Navarrete** Edgardo Soriano Vargas* Adriana Gutiérrez Castillo*

* Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México. Carretera Panamericana Toluca-Atlacomulco Km 15.5, Toluca, 50200, México.

Responsable de correspondencia:
Martín Talavera Rojas,
teléfono/fax: 722 2965555,
correo electrónico: mtr0035@yahoo.com.mx

Recibido el 11 de junio de 2011.
Aceptado el 13 de noviembre de 2012.

Meat foods are the main vehicle of foodborne diseases as a result of poor handling during processing. The objective of this study was to determine the frequency and antibiotic resistance factors of Escherichia coli in TIF plants of the Estado de Mexico. For this, 3 Federal Inspection Type (TIF) plants in Mexico were analyzed, with n = 90 samples, 10 raw meat product (beef, pork and turkey meat), 10 finished meat product and 70 work tools. Eighteen (20%) E. coli strains were isolated (3 raw meat product, 2 finished meat products and 13 work tools (P > 0.05). The E. coli isolates showed high levels of resistance to ampicillin (88.8%), cephalothin (88.8%), carbenicillin (83.3%) and chloramphenicol (61.1%). There was a relationship between E. coli strains resistant to ampicillin and chloramphenicol and presence of resistance genes Pse-1 4/18 (22%) and floR 4/18 (22%). Five (55.5%) positive isolates to Pse-1 and floR, also exhibit the Cs3 Cs5 genes for the class I integrons. The results indicate that antimicrobial resistance and genetic resistance factors are present in Escherichia coli isolated from food processing plants, suggesting that they can be transmitted to the intestine microbiota of human population by contamination and consumption of improperly processed products and become a risk factor for public health.

Key words: Escherichia coli, integrons, antibiotic multiresistence.

Resumen

Los alimentos cárnicos constituyen uno de los principales vehículos de enfermedades transmitidas por alimentos, como consecuencia de un manejo deficiente durante su procesamiento. El objetivo del presente trabajo fue determinar la frecuencia de algunos factores de resistencia antibiótica de Escherichia coli en plantas Tipo Inspección Federal (TIF) del Estado de México. Para este fin se analizaron muestras de tres plantas TIF en el Estado de México (n = 90), 10 de materia prima (carne de bovino, cerdo y pavo), 10 de producto terminado y 70 de utensilios de trabajo. Se aislaron 18 (20%) cepas de E. coli, 3 de materia prima, 2 de producto terminado y 13 de utensilios de trabajo (P > 0.05). Las E. coli aisladas presentaron una frecuencia alta de resistencia a ampicilina (88.8%), cefalotina (88.8%), carbencilina (83.3%) y cloranfenicol (61.1%). Se encontró una relación entre las cepas de E. coli resistentes a ampicilina y cloranfenicol y la presencia de genes de resistencia Pse-1 4/18 (22%) y floR 4/18 (22%). Cinco (55.5%) aislamientos positivos a Pse-1 y floR también presentaron el gen Cs3 Cs5 del integrón clase I. Los resultados indican que la resistencia antimicrobiana y los factores de resistencia genéticos están presentes en Escherichia coli aislada de plantas procesadoras de alimentos, lo que sugiere que estos elementos pueden transmitirse a la microbiota intestinal de la población humana a través de la contaminación y consumo de productos mal procesados, y ser un factor de riesgo para la salud pública.

Palabras clave: Escherichia coli, integrones, multirresistencia antibiótica.

Introducción

La resistencia antibiótica es un fenómeno biológico natural debido a las mutaciones y a la gran capacidad de las bacterias para transferir horizontalmente su material genético, por lo que existe una clara correlación entre el uso de antibióticos y la resistencia bacteriana.¹ En todo el mundo las enterobacterias presentan alta resistencia a la ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol, tetraciclina, cloranfenicol y ácido nalidíxico.² Una estructura importante en el mecanismo de resistencia son los integrones, los cuales son capaces de captar genes que codifican factores determinantes de resistencia antibiótica.³ Los integrones están compuestos por tres elementos necesarios para la inserción y expresión de genes exógenos: un fragmento que codifica una integrasa (intI), una secuencia attI a la que se unen los genes en casetes que codifican diferentes mecanismos de resistencia y dentro de la intI, en el extremo 3', una secuencia promotora (Pc) a partir de la cual se transcriben los casetes de resistencia integrados.⁴ Existen dos grupos de integrones: el Grupo I, también llamados "integrones móviles", se encuentran en plásmidos y están relacionados con secuencias que codifican la resistencia antibiótica, y el Grupo II o "superintegrones", presentes a nivel cromosómico, y a diferencia de los primeros, no están relacionados con la resistencia antibiótica, salvo algunas excepciones.^2,5 Debido a la relación entre los integrones y la resistencia a diferentes familias de antibióticos, durante los últimos años se han registrado diversas prevalencias en enterobacterias.⁶ Dada la creciente resistencia antibiótica de E. coli y su actual impacto en salud pública en todo el mundo, es importante realizar un estudio sobre la resistencia microbiana y la presencia del integrón clase I en E. coli, a partir de materia prima y productos cárnicos en plantas TIF en el Estado de México, para conocer el comportamiento genético de la resistencia en estas cepas.

Material y métodos

Se realizó un muestreo por conveniencia en tres plantas Tipo Inspección Federal en el Estado de México; se obtuvo el tamaño de muestra de acuerdo con la metodología del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) (método N60), que consiste en calcular 60 porciones del producto cárnico con dimensiones aproximadas de 5 × 10 cm, hasta completar un peso de 500g (esto es considerado como una muestra).⁷ Se realizaron tres muestreos en cada planta TIF, obteniendo 4 del TIF A y 3 del TIF B y C (10 muestras de materia prima cárnica: bovino, porcino y pavo, de la misma manera se obtuvieron 4 del TIF A y 3 del TIF B y C (10 muestras de producto terminado) y 28 del TIF A y 21 del TIF B y C (70 muestras de utensilios de trabajo) n = 90. Las muestras de materia prima y producto terminado se tomaron conforme a lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSA-1994,⁸ la muestra de los utensilios de trabajo se tomó durante el proceso de los productos y se utilizó el método descrito por la Unión Europea.¹ Las muestras fueron transportadas en refrigeración al Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de México. Las muestras de materia prima y producto terminado se incubaron previamente 6 ± 2 h a 37ºC y las muestras de utensilios de trabajo, 24 ± 2 h a 37ºC en caldo peptonado al 10 % y posteriormente en Agar MacConkey y Agar MacConkey Sorbitol.*⁹ Las colonias sospechosas se identificaron con pruebas bioquímicas de rutina.¹⁰ La resistencia a los agentes antimicrobianos se determinó mediante la técnica de Kirby-Bauer de acuerdo con el Clinical Laboratory Standars Intitute (CLSI).¹¹ Se evaluó la resistencia a los siguientes antibióticos: amikacina (30 µg), ampicilina (10 µg), cefalotina (30 µg), carbenicilina (100 mg) cefotaxima (30 µg), ceftriazona (30 µg), cloranfenicol (30 µg), gentamicina (10 µg), netilmicina (30 µg), nitrofurantoína (300 µg), pefloxacina (5 µg) y trimetropim-sulfametoxasol (25 µg).** Las lecturas se compararon con las tablas de interpretación de acuerdo con el CLSI.^11,12 Para la prueba de PCR en tiempo real se realizó la extracción de ADN utilizando un paquete comercial Insta Gene ^TM Matrix,*** la base de secuencias y el tamaño previsto de la amplificación para los oligonucleótidos específicos (Pse-1 y floR) utilizados fueron señalados por Chiu et al.,¹² y Córdova¹³ (Cuadro 1). Se realizó un PCR en tiempo real utilizando un volumen total de 25 μl que consistió en: 2 μl de ADN, 0.6 ml de cada oligonucleótido, 12.5 μl de Master Mix Kit, 1 μl SYBR^®Green 1 X† y 8.3 μl de H₂O. Las reacciones se sometieron a las siguientes condiciones: desnaturalización inicial de 95°C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 95°C por 5 minutos de desnaturalización, 58°C por 1 minuto de alineación y 72°C durante 1 minuto de síntesis de ADN y extensión final a 72ºC por 5 min. La reacción de la PCR para la identificación del integrón clase I se realizó con 25 μl como volumen total, utilizando: 2 μl de ADN, 0.6 ml del oligonucleótido (Cs3Cs5) 12.5 μl de Master Mix, 1 μl SYBR®Green 1 X† y 8.3 μl de H₂O. La reacción se sometió a las siguientes temperaturas: amplificación inicial de 3 minutos a 94°C y 35 ciclos de 94°C durante 40 segundos de desnaturalización, 58°C durante 40 segundos de alineación y 75°C durante 40 segundos de síntesis de ADN y un ciclo final de 75°C durante 7 minutos.¹³ Los resultados fueron evaluados por medio de la prueba de ji cuadrada con un intervalo de confianza de 95%.¹⁴

Resultados

Del total de muestras analizadas (n = 90) se obtuvieron 18 (20%) aislamientos de E. coli. De las 10 muestras analizadas de materia prima se obtuvieron 3 (33.3%) aislamientos y de las 10 muestras de producto terminado se obtuvieron 2 (20%) aislamientos positivos. Por otra parte, de los 70 utensilios de trabajo analizados se obtuvieron 13 (18.57%) aislamientos positivos.

La frecuencia de resistencia para ampicilina fue de 88.8%, para cefalotina 83.3%, para carbencilina 72.2% y para cloranfenicol 61.1%.

Todas las cepas que presentaron el gen Pse-1 y floR fueron resistentes a la ampicilina y cloranfenicol, respectivamente. La frecuencia de genes Pse-1, floR y el integrón I (Cs3Cs5) fue de 27.7 % para cada uno de ellos. Un aislamiento (5.5%) presentó ambos genes (Pse-1 y floR).

De los 5 aislamientos positivos a Cs3Cs5, 4 presentaron el gen Pse-1 (80%), 2 fueron positivos al gen floR (40%) y sólo 1 (20%) presentó ambos genes (Cuadro 2, Figuras 1-3). (2)

La frecuencia de Escherichia coli obtenida en este estudio fue de 20%. En un estudio realizado en muestras de carne cruda picada en Estados Unidos de América se encontró 0.5% de E. coli O157:H7, en plantas con inspección federal.¹⁵ En este trabajo se realizó el aislamiento en medio MacConkey Sorbitol para tratar de identificar Escherichia coli O157:H7; sin embargo, no se encontró ninguna cepa de este serotipo. Byrne et al.¹⁶ registraron una prevalencia de 4.9% en plantas empacadoras en Estados Unidos de América, aunque también se han mencionado prevalencias que van de 0.1 a 54%, por lo que se puede considerar que hay diferentes factores dentro de los procesos de obtención de cárnicos que intervienen en el aislamiento de E. coli. En estudios realizados en rastros municipales del Estado de México se registró una prevalencia de 2.6% para E. coli O157:H7;^10,17 sin embargo, y como se mencionó anteriormente, este serotipo no se encontró en el presente estudio, lo que puede indicar que las buenas prácticas de manufactura y los Procedimientos Operativos Estándares de Sanitización (POES) implementados en las plantas TIF reducen significativamente la presencia de E. coli; a pesar de ello, la presencia de este agente supone un riesgo a la inocuidad del producto, dada la resistencia antibiótica que presenta. Por esta razón, la resistencia antibiótica de E. coli representa un problema emergente en todo el mundo, ya que se han registrado altos porcentajes de resistencia hacia ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol, tetraciclina, cloranfenicol y ácido nalidíxico.² En este estudio se encontró resistencia a cuatro antibióticos (ampicilina, carbencilina, cefalotina y cloranfenicol), lo que coincide con lo referido por Reyes,¹⁰ quien registra una resistencia a ampicilina 25%, cefalotina 75% y carbencilina 62.5%, en aislamientos de E. coli O157:H7 a partir de muestras tomadas de canales de bovinos en establecimientos municipales. Ratnam et al.¹⁷ indican que de 174 aislamientos estudiados de E. coli O157:H7 a partir de canales de bovinos, 0.6% fue resistente a la ampicilina, carbencilina y la tetraciclina. Ji-Yeon et al.¹⁸ mencionan que de los aislamientos encontrados en un estudio en cerdos y bovinos en Corea y Estados Unidos de América, el 100% fue resistente a eritromicina, seguido de ampicilina (27.2%), cefalotina (18.2%) y tetraciclina (18.2%). Diversos autores han registrado resistencia a cloranfenicol hasta de 91% en cepas de E. coli aisladas en países europeos, asiáticos y de América del Norte.^19-23 La resistencia a los antimicrobianos mencionados son similares a otros estudios en el Estado de México y países asiáticos, europeos y de América del Norte, lo que sugiere una transferencia horizontal de material genético en forma dinámica en las poblaciones animales desde la etapa de producción hasta la elaboración de productos y subproductos de origen animal. Los aislamientos de E. coli que presentaron resistencia a ampicilina y cloranfenicol también presentaron los genes Pse-1 y flor resultados coincidentes con los mencionados por Varela,²⁴ quien informó una relación de 73.68% para la resistencia a ampicilina y la presencia del gen Pse-1, en aislamientos de Salmonella spp. En cuanto a la resistencia a cloranfenicol, estudios realizados en Perú por Mosquito et al.,² sugieren que ésta puede estar mediada o relacionada con genes como cmlA y floR.² En un estudio realizado en Mozambique con Shigella y Salmonella se determinó que los mecanismos de resistencia a cloranfenicol se relacionaban con la presencia de CAT (89 y 67%), cmlA (2 y 33%) y floR (0 y 83%), respectivamente.²⁵ En este estudio se encontró una correspondencia entre los aislamientos que presentaron los genes de resistencia Pse-1 y floR, con la presencia de integrones clase I, los cuales están relacionados con los casetes de resistencia a Beta-lactámicos y otros antibióticos. Se encontró que 5 de los 10 (50%) aislamientos que presentaron los genes Pse-1 y floR, presentaron también el gen Cs3 Cs5, coincidiendo con lo registrado en Perú en aislamientos de E. coli, que describían multirresistencia y presentaban integrón clase I.

Estos resultados sugieren que la resistencia antibiótica y la transferencia de material genético pueden ser por el uso inadecuado de antibióticos, que representa un riesgo para la salud pública, por lo que la vigilancia permanente en su uso es de suma importancia para determinar la presencia y la prevalencia de cepas resistentes en alimentos cárnicos.²⁶

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NOTAS

* SMAC Becton Dickinson. Heidelberg, Alemania.

*** Instagene TM Matrix (Bio-Rad). Hercules, California, Estados Unidos de América.

† Applied Biosystems, Estados Unidos de América.