Diagnóstico inmunohistoquímico de dermatosis inmunomediadas en perros domésticos

Immunohistochemical diagnosis of immune–mediated dermatoses in domestic dogs

Mario Adán Bedolla Alva* Gerardo Salas Garrido* Fernando Constantino Casas*

* Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

Abstract

A retrospective study of 28 dogs skin samples was carried out between 2001 and 2004. The fixed paraffin–embedded tissues showed microscopic lesions and suggestive diagnoses of pemphigus or lupus erythematosus (LE). The samples were re–evaluated by immunohistochemistry to identify intratissular deposits of canine IgG. Only 57.14% (16 cases) were positive. The location of IgG in the interstice space of the epidermis or in the basal membrane was helpful to differentiate between pemphigus and lupus erythematosus and among the different forms of pemphigus. From the positive cases 50% (eight cases) were consistent with pemphigus foliaceus, 31.25% (five cases) with pemphigus vulgaris, 12.5% (two cases) with pemphigus erythematosus, and 6.25% (one case) with lupus erythematosus. Immunohistochemistry is a valuable diagnostic tool for the definite diagnosis of immune mediated diseases such as pemphigus and lupus erythematosus. The aim of the present study was to demonstrate the usefulness of a never used method in Mexico for the specific diagnosis of pemphigus and lupus erythematosus.

Key words: Immunohistochemistry, pemphigus, lupus erythematosus, dogs, skin.

Resumen

Se realizó un estudio retrospectivo de 28 casos de perros, cuyas muestras de piel incluidas en parafina (de 2001 a 2004) presentaban lesiones microscópicas y diagnósticos sugerentes a pénfigo o lupus eritematoso (LE). Dichas muestras se reevaluaron mediante inmunohistoquímica, identificando un depósito intercelular de IgG canino. Se obtuvieron reacciones positivas en 57.14% (16 casos) de las muestras procesadas. La distribución de los depósitos intercelulares de IgG en el espacio de la epidermis, así como de la membrana basal, fue de ayuda para diferenciar entre pénfigo y lupus eritematoso y entre las diferentes presentaciones de pénfigo. De los casos positivos, 50% (ocho) fueron consistentes con pénfigo foliáceo, 31.25% (cinco) fueron diagnosticados como pénfigo vulgar, 12.5% (dos) fueron consistentes con pénfigo eritematoso y 6.25% (uno) correspondió a lupus eritematoso. La inmunohistoquímica es una herramienta diagnóstica de gran ayuda para el diagnóstico definitivo de enfermedades inmunomediadas como pénfigo y lupus eritematoso. El objetivo del presente trabajo fue demostrar la utilidad de un método no utilizado anteriormente en México para el diagnóstico específico de pénfigo y lupus eritematoso.

Palabras clave: inmunohistoquímica, pénfigo, lupus eritematoso, perros, piel.

Introducción

Las dermatosis inmunomediadas se caracterizan por la producción de autoanticuerpos contra componentes de la piel y por la formación de complejos antígeno–anticuerpo que se depositan en diferentes localizaciones de la piel.¹

Las más diagnosticadas son pénfigo y lupus eritematoso (LE). El primero se presenta aproximadamente en 0.6% de todas las dermatosis caninas, mientras que el segundo representa 0.5%.^2,3

Las enfermedades que constituyen el complejo pénfigo se asocian con la formación de autoanticuerpos contra proteínas de unión intercelular de queratinocitos (desmogleína 1 y 3).^1,4,5

El complejo pénfigo consta de cuatro enfermedades cutáneas: foliáceo, vulgar, eritematoso y vegetante, que se presentan en humanos, perros, gatos, caballos y cabras.^2,4

El diagnóstico de pénfigo se realiza por medio de diferentes métodos; para diferenciar los distintos tipos de pénfigo es necesario conocer la historia clínica, realizar el examen físico y la histopatología de las lesiones, además de aplicar la inmunofluorescencia o inmunohistoquímica.^1,6

El pénfigo vulgar es la forma más grave y segunda más común del complejo pénfigo.^1,3 Las lesiones macroscópicas consisten en vesículas, erosiones y úlceras en cavidad oral y alrededor de las uniones mucocutáneas. El examen histológico de la piel muestra acantolisis, hendiduras y vesículas en la región suprabasal de la epidermis. Las vesículas contienen queratinocitos acantolíticos y ninguna o pocas células inflamatorias; además, dichas vesículas exhiben en su parte basal una hilera de células basales unidas a la membrana basal (células en hilera de lápidas). La dermis superficial suele tener inflamación de perivascular a liquenoide compuesta por linfocitos, células plasmáticas y macrófagos.^1,5

El pénfigo vegetante es la forma benigna de pénfigo vulgar.^1,3 Las lesiones macroscópicas son vesículas, pústulas y vegetaciones verrucosas en el tronco. La histopatología de la piel revela hiperplasia epidérmica irregular, papilomatosis y microabscesos que contienen numerosos eosinófilos, escasos neutrófilos y células acantolíticas. La inflamación en dermis superficial se compone de macrófagos, linfocitos y células plasmáticas.^1,5

El pénfigo foliáceo es una variante más leve y más común del complejo pénfigo.^1,3 Las lesiones macroscópicas consisten en vesículas o pústulas, erosiones y costras, principalmente en la cara (plano nasal y región periorbitaria). En la histopatología de la piel se aprecia acantolisis, hendiduras, vesículas y pústulas en la región subcorneal de la epidermis. Las pústulascontienen numerosos neutrófilos o eosinófilos, así como queratinocitos acantolíticos. La dermis superficial muestra inflamación de perivascular a liquenoide compuesta por macrófagos, linfocitos y células plasmáticas.^1,5

Las pruebas de inmunofluorescencia o inmuno–histoquímica resultan esenciales para confirmar que la enfermedad es parte del complejo pénfigo, en donde se observa el depósito de inmunoglobulinas, con o sin complemento, sobre la superficie de los queratinocitos.^1,2,4,5 En pénfigo vulgar y pénfigo vegetante se observan depósitos intercelulares de IgG y ocasionalmente complemento en la parte basal de la epidermis, lo que ayuda a diferenciarlos son los hallazgos histopatológicos.⁷ En el pénfigo foliáceo se aprecian depósitos intercelulares de IgG o IgM, y frecuentemente C3 en la parte superficial de la epidermis.⁷ En pénfigo eritematoso se observan depósitos de inmunoglobulinas en el espacio intercelular de epidermis y membrana basal.^1,5,7

Existen dos formas de lupus eritematoso: lupus eritematoso sistémico (LES), que afecta múltiples órganos y tejidos, incluyendo la piel, y el lupus eritematoso discoidal (LED), que afecta únicamente la piel.⁸

En LES y LED las lesiones cutáneas son similares. Macroscópicamente se presentan principalmente en el puente de la nariz y región periorbitaria, y consisten en eritema, costras, despigmentación y alopecia. Las lesiones histológicas consisten en dermatitis de interfase, compuesta por histiocitos, linfocitos y células plasmáticas; hay degeneración hidrópica de los queratinocitos basales, incontinencia pigmentaria, formación de hendiduras o vesículas entre la dermis y epidermis.^1,5

Con la inmunofluorescencia o inmunohistoquímica es posible detectar IgG, IgA, IgM o C3 a todo lo largo de la membrana basal de la piel, estos depósitos conforman lo que se denomina banda de lupus.^1,3,7,9,10

Otro método diagnóstico de estas dermatosis es la inmunofluorescencia (IF), si bien es una técnica rápida, tiene desventajas respecto de la inmunohistoquímica (IHQ); para IF las muestras deben ser procesadas en fresco y requieren cortes por congelación en criostato, en IHQ las muestras se conservan en formol y se procesan los tejidos incluidos en parafina, lo que permite su almacenamiento para reutilizarlos en estudios posteriores. En la IF las reacciones no son permanentes, en la IHQ con cromógenos como el aminoetilcarbazol (AEC) la reacción puede durar meses. Para la evaluación microscópica de tejido en IF se requiere microscopio especial de fluorescencia, en IHQ se utiliza un microscopio de luz convencional.¹¹

El objetivo del presente trabajo fue realizar el diagnóstico inmunohistoquímico específico de estas dermatosis en perros domésticos, cuyo uso no se ha informado con anterioridad en México.

Material y métodos

En este estudio se utilizaron casos pertenecientes al acervo del servicio de diagnóstico del Departamento de Patología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, de la Universidad Nacional Autónoma de México.

Las biopsias de piel de perro, ya incluidas en parafina, se cortaron a 5 um de grosor en un microtomo,* realizando dos cortes seriados, uno de los cuales fue teñido con la técnica de rutina de hematoxilina y eosina¹² para su observación microscópica, y el otro se procesó por inmunohistoquímica (IHQ).

Para la técnica de IHQ se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo Anti–IgG canino** a una dilución 1/250. Se usó un anticuerpo secundario biotinilado anticonejo de origen caprino*** marcado con biotina, aplicando 50 µL sobre el tejido.

La sustancia reveladora usada se preparó con 50 µL de cada una de las sustancias incluidas en el paquete de reactivos comerciales*** [sustrato de amortiguador concentrado, el cromógeno AEC (aminoetilcarbazol) y 0.6% de peróxido de hidrógeno], en 1 mL de agua destilada.

Para la recuperación de antígenos, se aplicó a los tejidos 50 µL de pronasa a 0.1% (0.05 g de proteasa**** + 50 mL de solución amortiguadora) incubados en cámara húmeda durante 10 minutos a 37° C en estufa. Para detener esta reacción enzimática, las muestras se sumergieron en PBS realizando dos cambios de cinco minutos cada uno a temperatura ambiente.

a) Testigo positivo: Se utilizó una sección de piel que fue positiva para pénfigo foliáceo a través de la técnica de inmunohistoquímica (Figuras 1 y 2).

Resultados

La reacción positiva por inmunohistoquímica se observó microscópicamente como depósito granular, adyacente a la membrana citoplasmática (espacios intercelulares) de los diferentes tipos celulares.

La reacción positiva se localizó en el espacio intercelular de la porción superficial de la epidermis en ocho casos (50%), los cuales fueron consistentes con pénfigo foliáceo (Figuras 1 y 2); en el espacio intercelular de la porción basal de la epidermis esta reacción se observó en cinco casos (31.25%), los cuales fueron consistentes con pénfigo vulgar (Figuras 3 y 4); en el espacio intercelular y membrana basal de la epidermis se observó en dos casos (12.5%), que corresponde a pénfigo eritematoso (Figuras 5 y 6); en la membrana basal de la epidermis se presentó en solamente un caso (6.25%), el cual fue consistente con lupus eritematoso (Figuras 7 y 8) (Cuadro 1).

Discusión

De acuerdo con los resultados del estudio inmunohistoquímico, 57.14% de los casos fueron positivos con esta técnica utilizando un anticuerpo anti–IgG canino, este porcentaje es menor a los estudios realizados por Haines et al.;¹³ sin embargo, Bradley y Calderwood¹⁴ obtuvieron un porcentaje similar (59%) al que se realizó en este estudio.

Las muestras de piel tampoco fueron evaluadas para la detección de C3, no obstante la contribución de C3 en las enfermedades cutáneas autoinmunes es mínima, variable y ocurre sólo en áreas de acantolisis y siempre está acompañada por la presencia de IgG o IgM.¹⁷

Un aspecto crítico en la técnica de inmunohistoquímica fue la recuperación antigénica, que se efectuó por medio de pronasa a 0.1%. El tratamiento de los tejidos con esta enzima es esencial para restablecer la estructura de las inmunoglobulinas depositadas.¹⁶ Otra enzima útil para este propósito es la tripsina a 0.25%.^13,14

La literatura refiere que en cuanto a la frecuencia de las diferentes presentaciones de pénfigo, el pénfigo foliáceo es el más numeroso, seguido de pénfigo vulgar, del pénfigo eritematoso de pénfigo vegetante.^1,4,5,13,14 Lo anterior coincide con los resultados obtenidos aquí, en los que se presentó pénfigo foliáceo en 50% de los casos (ocho), seguido de pénfigo vulgar con 31.25% (cinco) y 12.5% (dos) correspondió a pénfigo eritematoso.

El lupus eritematoso es la segunda enfermedad cutánea autoinmune más diagnosticada después del complejo pénfigo.³ No obstante, el número de casos positivos aquí fue menor al referido por Haines et al.¹³, Bradley et al.¹⁴ y Pérez et al.¹⁵ En cuanto a los casos negativos, algunos mostraron depósitos de inmunoglobulina; sin embargo, no se observaban en el espacio intercelular de la epidermis ni en membrana basal en un patrón característico descrito para el complejo pénfigo o LE. Los factores que pueden estar involucrados en los casos negativos son: selección inapropiada del sitio anatómico para tomar la muestra, la toma de biopsias de piel ulcerada o con infecciones bacterianas secundarias, biopsias de piel de pacientes con antecedentes de terapia inmunosupresora,¹⁴ uso de soluciones fijadoras inapropiadas o excesivo tiempo de fijación. En este sentido, las soluciones ideales para realizar un estudio inmunohistoquímico son: paraformaldehído a 4% o formaldehído a 10% amortiguado, a pH 7.4, durante 12 a 24 horas;¹⁸ mayor tiempo de fijación puede ocasionar enmascaramiento antigénico debido a la presencia de puentes interproteínicos que modifican la morfología del antígeno.¹⁹

Es importante establecer que se debe realizar una evaluación histopatológica de las muestras, antes de someterlas a inmunohistoquímica, para verificar que el tipo de lesiones son sugerentes a dermatosis inmunomediada.^13,14,20 Sin embargo, hay casos cuyas lesiones histológicas cutáneas coinciden con enfermedades que no son de tipo autoinmune, por lo cual el diagnóstico inmunohistoquímico representa una herramienta indispensable para el diagnóstico de las dermatopatías autoinmunes.^2,3,5,8

La distribución de las reacciones positivas en el espacio intercelular de la epidermis y membrana basal fue útil para diferenciar los diferentes tipos de pénfigo y entre pénfigo y lupus eritematoso. La distribución en el espacio intercelular en la epidermis superficial es un patrón consistente con pénfigo foliáceo. La distribución en el espacio intercelular en la epidermis profunda es consistente con pénfigo vulgar. En el caso de pénfigo eritematoso, la reacción positiva se localiza en el espacio intercelular y membrana basal. En lupus eritematoso se localiza en la membrana basal.^13,14

La aportación de este artículo consiste en informar al clínico, que en México, puede auxiliarse de la inmunohistoquímica para el diagnóstico certero de pénfigo y lupus eritematoso, debido a que de esta manera podrá establecer un tratamiento específico contra la dermatopatía autoinmune identificada, además podrá sugerir un pronóstico clínico entre los diferentes tipos de pénfigo o entre pénfigo y lupus eritematoso, ya que éstos varían en la forma y severidad de la enfermedad. Además se podrá utilizar esta técnica para posteriores trabajos sobre la prevalencia de pénfigo y cada una de sus variantes, así como de lupus eritematoso.^1–3,21

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Notas

* Leica Instruments, Modelo 820, Catálogo 5991006, Nussoloch, Alemania.

** Biodesign International, Catálogo W991142, Industrial Park Road, Saco Maine, 04071, Estados Unidos de América.

*** Zymed Laboratorios Inc., Catálogo 95–6143, San Francisco, CA, 94080, Estados Unidos de América.

**** Sigma Chemical Co. Cat. P–547, Estados Unidos de América.