Caracterización molecular de tres especies de Hylocereus (Cactaceae) presentes en México

Molecular characterization of three species of Hylocereus (Cactaceae) from México

María de los A. García Aguilar^1*, Teresa Terrazas³, Obdulia Segura León², Salvador Arias⁴, Heike Vibrans¹ y Lauro López-Mata¹

¹ Programa de Botánica, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. Km 36.5 Carretera México-Texcoco. 56230, Montecillo, Texcoco, Edo. de México. Tel. y Fax. (55)5804 59 47, 595 952 02 47, (595) 952 02 00 Exts. 1300 y 1301. *Autor para correspondencia (gamar@colpos.mx)

³Departamento de Botánica, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. 04510, México, D. F.

⁴Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. 04510, México, D. F.

Recibido: 11 de Agosto del 2011
Aceptado: 20 de Diciembre del 2012

Resumen

Hylocereus (Berger) Britton y Rose es una cactácea con elevado potencial económico. Se distribuye en climas tropicales, subtropicales y semiáridos. El número de especies reconocidas para México es controvertido, debido a que no existe un consenso en cuanto a su taxonomía, principalmente por la amplia variación morfológica que se observa en las estructuras vegetativas de muchas plantas. Se secuenciaron tres regiones del cloroplasto (matK, rbcL, psbA) y el espaciador intergénico trnL-F para evaluar su conveniencia como código de barras para H. ocamponis (Salm-Dick) Britton y Rose, H. purpusii (Weingart) Britton y Rose e H. undatus (Haworth) Britton y Rose. Las muestras provinieron de 18 localidades, las cuales fueron caracterizadas previamente con base en caracteres morfológicos y anatómicos. Como grupo de comparación se utilizaron dos especies del género Selenicereus. De forma individual, los marcadores rbcL y trnL-F confirmaron la diferenciación de las especies de Hylocereus estudiadas. En el análisis multilocus basado en inferencia Bayesiana, la combinación de rbcL + trnL-F, discriminó a las tres especies con probabilidades > 60 %. Los resultados sugieren que esta combinación de loci puede tener utilidad como código de barras para las tres especies de este género de cactáceas.

Palabras clave: México, código de barras, Hylocereus, variación genética, análisis multilocus matK, rbcL, trnH-psbA, trnL-F.

Abstract

Hylocereus (Berger) Britton and Rose is a cacti with high economic potential. It is distributed in tropical, subtropical and semi-arid environments. The number of species identified in Mexico has been controversial, mainly because of the wide morphological variation observed on their vegetative structures. Three chloroplast regions (matK, rbcL, psbA), and the intergenic spacer trnL-F were sequenced to evaluate their suitability as barcode for H. ocamponis (Salm-Dick) Britton and Rose, H. purpusii (Weingart) Britton and Rose and H. undatus (Hawor-th) Britton and Rose. The samples were collected from 18 localities and previously characterized based on morphological and anatomical traits. Two species of Selenicereus were used as comparison group. Individual markers rbcL and trnL-F confirmed the differentiation of the three species. The multilocus analysis based on Bayesian inference with rbcL and trnL-F combined also discriminated the three species with probabilities > 60 %. These results suggest that this loci combination could be useful as a barcode for Hylocereus species.

Key words: México, barcode, Hylocereus, genetic variation, multilocus analysis, matK, rbcL, trnH-psbA, trnL-F.

INTRODUCCIÓN

El género Hylocereus pertenece a la subfamilia Cactoideae, tribu Hylocereeae, en la que Anderson (2001) reconoció 18 especies. Se distribuye ampliamente en regiones tropicales, subtropicales y semiáridas de México, Centro y Sudamérica (Ortiz, 1999). Sus plantas son trepadoras hemiepífitas, diploides (2n = 2x = 22) o tetraploides (2n = 44), en su mayoría auto-incompatibles (Tel-Zur et al., 2004), aunque previamente se había reportado la autocompatibilidad solamente en algunas de éstas (Raveh et al., 1998). Por la importancia económica nacional e internacional que tiene la comercialización de los frutos de algunas especies de este género (Raveh et al., 1998; Tel-Zur et al., 2004, 2005), y por su excepcional tolerancia a la sequía (Juárez et al., 2009), su cultivo se ha extendido de huertos familiares a una producción intensiva y semi-intensiva en Estados como Hidalgo, Oaxaca, Puebla, Veracruz y Yucatán.

El número de especies de Hylocereus reconocidas para México ha variado de nueve (Calix de Dios, 2004) a tres (García-Aguilar et al., 2009). Actualmente no existe un consenso en el reconocimiento puntual de cada una de las especies debido principalmente a la amplia variación morfológica que presentan las estructuras vegetativas de algunas de éstas (Ortiz, 1999; Grimaldo-Juárez et al., 2007). García-Aguilar et al. (2009) estudiaron la anatomía caulinar de diez poblaciones de Hylocereus en México y señalaron que atributos del tejido primario (grosor de la cutícula) y xilema secundario (diámetro del elemento de vaso, longitud de fibra, alto y ancho de radio) del tallo, permitieron explicar 72.5 % de la variación total, lo cual apoyó el reconocimiento de tres especies: H. ocamponis, H. purpusii e H. undatus.

De estas tres especies, H. undatus es la que ha mostrado mayor variación morfológica (Tel-Zur et al., 2003, 2004). Esta especie tiene una amplia distribución geográfica, ya que se le encuentra en forma silvestre y cultivada en algunas regiones del centro y en las vertientes del Pacífico y Golfo de México (Ortiz, 1999). Presenta un alto nivel de polimorfismo genético, de acuerdo con datos obtenidos mediante la técnica de RAPD (92.5 %) de 50 colectas en nueve estados del país (Legaria et al., 2005). Junqueira et al. (2010) describen también un alto polimorfismo (40.54 %) con 11 iniciadores RAPD en la región del Cerrado, Brasil.

Una de las alternativas más recientes para la identificación taxonómica de especies es el uso del código de barras de ADN, que consiste en el análisis de la variación de secuencias de ADN ortólogas (Hebert et al., 2003). Ésta ha sido particularmente útil en aportar información complementaria a los caracteres morfológicos (Hebert et al., 2003) y también para la identificación directa en algunos grupos de organismos. El Consorcio de Código de Barras para la vida (CBOL, 2009) propuso la combinación de varias regiones del ADN de cloroplasto como posibles candidatos para plantas, entre ellos matK, rbcL, rpoB y rpoC1 que son genes codificantes de proteínas, y de atpF-atpH, trnH-psbA y psbK-psbI que son espaciadores intergénicos no codificantes. De éstos, la combinación de matK + rbcL ha permitido la discriminación entre especies en más de 72 % (CBOL, 2009).

El objetivo de este estudio fue evaluar de forma individual y combinada diferentes regiones del ADN de cloroplasto (ADNc) en tres especies del género Hylocereus presentes en México, identificadas con base en caracteres anatómicos y morfológicos, con el propósito de reconocerlas molecularmente. Se emplearon las regiones matK, rbcL (codificantes) y trnH-psbA y trnL-F (espaciadores intergénicos no codificantes) que han sido utilizadas previamente en cactáceas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Las tres especies de Hylocereus se recolectaron en los Estados de Chiapas, Guerrero, Michoacán, Nayarit y Oaxaca, y se obtuvieron cinco individuos para H. ocamponis, seis de H. purpusii y cuatro de H. undatus (Cuadro 1). Las colectas fueron identificadas taxonómicamente con base en caracteres morfológicos y anatómicos propuestos por García-Aguilar et al. (2009). Además, se utilizaron tres individuos de dos especies del género Selenicereus (S. grandiflorus y S. testudo) provenientes del Jardín Botánico de la UNAM, como grupo de comparación.

Extracción de ADN y método de secuenciación

El ADN de las muestras se obtuvo directamente del tejido cortical colectado en campo y deshidratado con sílica gel hasta su utilización, y luego extraido con DNeasy Plant Mini kit de Quiagen^® (Austin, USA). Los fragmentos fueron amplificados con los iniciadores reportados en la literatura, matK (Johnson y Soltis, 1994), rbcL (Olmstead et al., 1992), psbA (Sang et al., 1997) y trnL-F (Taberlet et al., 1991) (Cuadro 2). Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se corrieron en geles de agarosa a 1.2 % (p/v) con amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato, pH 7.6; 1mM Na₂ EDTA), durante 30 min a 90 V. Los productos de la PCR fueron teñidos con bromuro de etidio (0.5 mg mL^-1) y registrados en un fotodocumentador. Los productos de PCR sin purificar fueron secuenciados en The Genomic Center, Washington University (http://genome.wustl.edu/).

Las secuencias obtenidas fueron revisadas y ensambladas con el programa Sequencher, versión 3.0 (Gene Code, Ann Arbor, Michigan, USA) con refinamiento manual. El alineamiento se realizó con Clustal W (Thompson et al., 1997) implementado en el programa MEGA 4 (Tamura et al., 2007). En este caso se consideró buena lectura bidireccional y tiempo de edición requerido, criterios establecidos por la CBOL (2009). Las secuencias ya alineadas se compararon con las registradas en el Banco de Genes (NCBI) mediante el programa BLASTn (Altschul et al., 1997).

Análisis de divergencia de nucleótidos

La discriminación entre las especies se estimó con base en la proporción de sitios segregantes S o polimorfismo (número de sitios nucleotídicos que difieren entre secuencias) (Nei y Kumar, 2000) de cada una de las regiones analizadas. Además, se calculó la divergencia corregida entre las secuencias de las especies con la aplicación del modelo de distancia de Tamura-Nei, implementado en el programa MEGA 4 (Tamura et al., 2007).

Para las regiones matK y rbcL (codificantes) se calcularon varios estimadores de la variabilidad de nucleótidos: (a) π diversidad nucleotídica, dada por el número de nucleótidos diferentes por sitio entre dos secuencias (Nei y Li, 1979); y (b) θ, la proporción de sitios en que los nucleótidos difieren, determinado con base en el número de sitios segregantes (S). También se hicieron análisis de diversidad haplotípica: (i) número de haplotipos (h), (ii) diversidad haplotípica (Hd) (Nei, 1987), (iii) número de posiciones polimórficas (S) y (iv) número medio de diferencias nucleotídicas (k) entre cada par de secuencias (Tajima, 1989).

Prueba de neutralidad

Las secuencias de nucleótidos de las regiones matK y rbcL (codificantes) se transformaron a aminoácidos con el código genético de plastidio. Se estimaron las tasas de substitución sinónimas (dS) y no sinónimas (dN). Seguido de esto, se aplicó la prueba D de Tajima (Tajima, 1989), a fin de detectar desviaciones del modelo neutral, la cual se basa en las diferencias entre diversidad de nucleótidos π (Nei y Li, 1979) y el θ calculado a partir de la expresión θ = 4Ne μ (Kimura, 1968), donde Ne es el tamaño efectivo de la población y μ es la tasa de mutación. Los supuestos de esta prueba son: D = 0 (neutralidad), cuando los estimadores π = θ, - D = (negativa) selección purificadora cuando π < θ; y + D = (positiva), selección balanceadora con π > θ. Estas pruebas se implementaron con el programa DnaSP versión 5.10 (Librado y Rozas, 2009).

Análisis filogenético

Análisis multilocus

La combinación de las cuatro regiones se analizó con estadística Bayesiana, las combinaciones fueron de dos y tres marcadores: rbcL + psbA, rbcL + trnL-F, psbA + trnL-F y rbcL + trnL-F + psbA implementadas en MrBayes v. 3.1.2 (Ronquist y Huelsenbeck, 2003). En todos los casos se empleó un modelo de 4 x 4 y el modelo de substitución GTR y 100 000 generaciones de Cadenas de Markov de Montecarlo MCMC, con un muestreo cada 100 generaciones. Para el cálculo de probabilidades posteriores de los árboles, se usó un burn-in (número de árboles no considerados en el análisis) de 5000, equivalente a 25 % de los árboles muestreados. De cada partición, se obtuvo un árbol de consenso con 95 % de probabilidades de estabilidad.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las cuatro regiones moleculares seleccionadas se amplificaron en las muestras de los 15 individuos de las tres especies de Hylocereus, y en tres individuos de dos especies de Selenicereus. De éstas, matK fue la región que presentó la más alta calidad en la lectura y alineamiento de las secuencias, seguida por rbcL. Las regiones intergénicas psbA y trnL-F mostraron mayor dificultad en el alineamiento, en comparación con las regiones codificantes, y requirieron un mayor ajuste manual.

Los marcadores utilizados permitieron identificar distintos niveles de variación. Para el marcador matK se obtuvo un fragmento de 813 pb en 18 individuos: cinco correspondientes a H. ocamponis, seis a H. purpusii, cuatro de H. undatus y dos del género Selenicereus. Esta región no presentó variación entre las especies de Hylocereus, pero sí entre las especies de Selenicereus, con cuatro sitios variables (Cuadro 3). Estos resultados coinciden con lo señalado por Yesson et al. (2011), quienes reportaron que matK sólo permitió identificar a 77 % de 528 especies de cactáceas, debido a que esta región no cuenta con iniciadores universales que puedan ser usados en todos los grupos de plantas. Otros autores han señalado la eficacia de este marcador en la resolución taxonómica en niveles supraespecíficos, como diversas familias de angiospermas (Hilu et al., 2003).

Los bajos niveles de variación de nucleótidos de la región matK a nivel especie pueden ser explicados por la expresión génica del mismo. Es considerado un gen putativo del grupo de intrones tipo II que codifica para la proteína madurasa, la cual participa en la regulación del desarrollo de las plantas y funciona como un "regulador genético" que limita su evolución. Ello explica la relativamente baja variación intra-específica pero alta a nivel inter-específico (La-haye et al., 2008). En el futuro sería deseable explorar las regiones no conservadas del intrón a fin de buscar variación inter-específica para las especies de Hylocereus. La región matK fue excluida del análisis de diversidad de nucleótidos e inferencia filogenética, debido a que no detectó variación entre las especies de Hylocereus.

El fragmento amplificado con el marcador rbcL se obtuvo en los 18 individuos estudiados, con una longitud de 605 pb, de los cuales 544 fueron útiles y codificaron para 181 aminoácidos. Esta región presentó variación intra-específica en una de las tres especies de Hylocereus. A nivel inter-genérico, mostró seis mutaciones, lo que permitió diferenciar a Selenicereus de Hylocereus (Cuadro 3).

Sólo H. purpusii mostró diversidad genética para rbcL, mientras que las otras dos especies de Hylocereus no mostraron variación de nucleótidos a nivel intra-específico. La diversidad haplotípica para esta especie fue Hd = 0.500, mientras que la diversidad nucleotídica fue π = 0.00092 en la cual π < θ, valores apenas por debajo de los obtenidos para Selenicereus (Cuadro 4). La tasa de sustitución dN/ dS fue R = 0.08 y la prueba de neutralidad de Tajima D = -0.61237 no fue significativa (α = 0.01), para así rechazar que los cambios detectados son de tipo neutral.

Sin embargo, el valor negativo de esta prueba señala un proceso de selección purificadora (Simmonsen et al., 1995), lo cual puede estar relacionado al tipo de propagación vegetativa muy frecuente en las especies de este género. Aunque estos resultados no revelan un proceso de selección positiva en H. purpusii, que permitan reconocerla como independiente, sí reflejan un probable proceso de adaptación, ya que en todos los individuos de esta especie fue posible detectar una mutación de tipo sinónima en la tercera posición del codón (CCA-CCT) (379, 380, 381), que codifica para el aminoácido prolina. Esto muestra un uso preferencial de codón en la síntesis de este aminoácido (Nei y Kumar, 2000), el cual no implica cambios a nivel de aminoácido. Algunos estudios han relacionado a este fenómeno con cambios en la eficiencia de la transcripción del codón, inducido probablemente por una presión de selección (Sharp et al., 2010). Gran parte de la variación encontrada en algunas especies parece estar relacionada con este tipo de patrón (Hershberg y Petrov, 2008).

La prolina es un aminoácido libre que se encuentra en hojas, tallos y raíces de las plantas de manera natural. Se tiene evidencia de que aumenta su concentración como respuesta y adaptación al estrés hídrico (Claussen, 2005), y por efectos a la alta salinidad, deficiencia de nitrógeno, alta intensidad de luz y en respuesta a temperaturas extremas (Xu et al., 2002). Las plantas expuestas a sequía pueden llegar a acumular en las vacuolas osmolitos orgánicos y solutos como la prolina para el ajuste osmótico (Handa et al., 1986). Los resultados sugieren que H. purpusii presenta un proceso de selección impuesto por las condiciones ambientales en las cuales se distribuye.

El fragmento amplificado para psbA presentó una longitud de 474 pb, y fue secuenciado en todos los individuos estudiados. Esta región presentó variación intra-específica en dos de las tres especies de Hylocereus, dos sitios variables en dos individuos de H. purpusii provenientes de la localidad de Xaltianguis, Gro. (14) y Nochistlán, Oax. (7), y un sitio variable en dos individuos de H. undatus, uno de Tierra Colorada, Gro. (19) y otro de La Trinitaria, Chis. (4) (Cuadro 3). En la reconstrucción filogenética basada en la matriz de Distancias-P estos individuos formaron un grupo independiente con un "bootstrap" de 65. El resto de los individuos de las tres especies de Hylocereus se agruparon juntos en una politomía (Figura 1B).

Aunque no fue posible con este marcador el reconocimiento de las especies de Hylocereus, sí se observó afinidad de H. purpusii con H. undatus, especies que presentan una distribución geográfica continua desde Xaltianguis, Gro. a La Trinitaria, Chis. (Cuadro 1). Selenicereus vuelve a diferenciarse claramente con 11 sitios variables (Cuadro 5). Aunque este espaciador intergénico ha sido útil en la discriminación de algunas especies (Goremykin et al., 2005) y varios géneros como Gastrolobium (Chandler et al., 2001) y Cerastium (Scheen et al., 2004), no siempre permite detectar variación entre especies muy cercanas (Kress y Erickson, 2007), como ocurrió en el presente estudio en el cual sólo fue posible diferenciar a los individuos a nivel genérico.

Selenicereus se volvió a diferenciar con trnL-F, ahora con 41 sitios variables. Esta región mostró el mayor número de diferencias de las cuatro regiones analizadas en este estudio. Estos resultados concuerdan con lo reportado por Calvente et al. (2011), quienes señalaron a esta región como particularmente útil en la resolución de relaciones entre géneros cercanos. En combinación con matK, esta región ha permitido resolver relaciones filogenéticas a nivel subfamilia de Cactaceae (Hernandez et al., 2011), pero no a nivel de especie cuando se tienen más de dos muestras (Bárcenas et al., 2011).

Análisis multilocus. Los resultados del análisis multilocus obtenidos con base en el Teorema de Bayes, mostraron que la combinación que permitió discriminar a las especies de Hylocereus con la mayor probabilidad fue rbcL + trnL-F (Figura 2B). En la reconstrucción filogenética, las tres especies de Hylocereus formaron grupos definidos. El grupo formado por H. undatus mostró una probabilidad de 87 %, con excepción de un individuo proveniente de la localidad de Ocozocoautla, Chis. (18) el cual formó una politomía junto con los individuos de H. purpusii. Este resultado fue similar a lo encontrado en el análisis individual de rbcL, donde este individuo (18) mostró afinidad con un individuo de H. purpusii, proveniente de la localidad del Nayar, Nay. (6). Estos resultados sugieren una probable zona de transición entre estas dos especies, apoyado por la reconstrucción filogenética individual del espaciador intergénico psbA, en el cual se observó un agrupamiento similar entre un individuo de H. purpusii proveniente de la localidad de Xaltianguis, Gro. (14) que mostró afinidad con tres individuos de H. undatus provenientes de las localidades de Tierra Colorada, Gro. (19), Nochistlán, Oax. (7), y La Trinitaria, Chis. (4). Lo anterior tendrá que confirmarse con un mayor número de colectas.

En estudios previos se ha aceptado como código de barras la combinación de regiones codificantes como rbcL con regiones intergénicas no codificantes, que evolucionan rápidamente en algunos grupos (Kress et al., 2009). La combinación de rbcL y trnL-F se ha usado con éxito en la discriminación de especies en pteridofitas (Hollingsworth et al., 2009). Recientemente Groot et al. (2011) analizaron de forma individual y combinada los marcadores rbcL y trnL-F, y señalaron que la combinación de estos loci proporciona una resolución de 100 % en especies de helechos. Los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que esta combinación de loci podría ser útil como código de barras para las especies del género Hylocereus.

CONCLUSIONES

La combinación de las regiones rbcL+ trnL-F permitió reconocer a las tres especies de Hylocereus. Por consiguiente, la diferenciación de las tres especies de Hylocereus reconocidas con base en caracteres morfo-anatómicos queda confirmada molecularmente. En H. ocamponis no se detectó variación intra-específica para ninguna de las cuatro regiones analizadas, por lo que se sugiere hacer una exploración de genes nucleares, así como un muestreo exhaustivo para esta especie. Los resultados sostienen a esta combinación de loci como candidata para emplearse como el código de barras para las especies de Hylocereus.

Al CONACYT por la beca para realizar estudios de doctorado a María de los Ángeles García Aguilar (161921). Al Laboratorio de Sistemática Molecular del Instituto de Biología (UNAM), por las facilidades para la extracción y amplificación de ADN. A la Dra. Monserrat Vázquez-Sánchez, por su asesoría en dicho laboratorio, y al Colegio de Postgraduados por las facilidades para realizar el trabajo de campo.

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