In vitro cytotoxic and antiproliferative activities of marine macroalgae from Yucatán, Mexico*

Actividad citotóxica y antiproliferativa in vitro de macroalgas marinas de Yucatán, México

R Moo–Puc^{1, 2}, D Robledo¹, Y Freile–Pelegrín¹*

¹ Departamento de Recursos del Mar; Cinvestav, Km 6 Carretera Antigua a Progreso, Cordemex, 97310, A.P. 73, Mérida, Yucatán, México. * E–mail: freile@mda.cinvestav.mx

² Unidad de Investigación Médica Yucatán, Unidad Médica de Alta Especialidad, Centro Médico Ignacio García Téllez, Instituto Mexicano del Seguro Social 41 No 439 x 32 y 34, Col. Industrial, CP 97150, Mérida, Yucatán, México.

Recibido en mayo de 2009.
Aceptado en octubre de 2009.

Abstract

Extracts from 27 marine algal species (14 Rhodophyta, 5 Phaeophyta, and 8 Chlorophyta) from the Yucatán Peninsula (Mexico) were evaluated for cytotoxic and antiproliferative activity by 3(4,5–dimethylthiazole–2–yl)–2,5–diphenyltetrazolium bromide (MTT) and sulforhodamine B (SRB) assays, respectively. To determine the specificity of cytotoxic activity against tumor cells, the selective index (SI) was also calculated. The following cancer cell lines were employed: normal canine kidney (MDCK) cells, human laryngeal carcinoma (Hep–2) cells, human cervical adenocarcinoma (HeLa) cells, and human nasopharyngeal carcinoma (KB) cells. The results indicated that 44% and 51% of the algal species tested showed cytotoxic and antiproliferative activity, respectively. Most of the cytotoxic extracts were from species of Chlorophyta, with Udotea flabellum and U. conglutinate showing the highest cytotoxic activity against all the cancer cell lines. For Rhodophyta, the Bryothamnion triquetrum extract showed outstanding selective cytotoxicity against Hep–2 cells (CC₅₀ 8.29 µg mL^–1, SI = 12.04). Two of the five species of Phaeophyta tested (Lobophora variegata and Dictyota caribaea) showed high cytotoxicity activity against the KB cell line. The data show that these species are a potential source of compounds for the treatment of certain cancer diseases.

Key words: antiproliferative, cytotoxicity, seaweeds, Yucatán.

Resumen

Los extractos de 27 especies de algas marinas (14 Rhodophyta, 5 Phaeophyta y 8 Chlorophyta) recolectadas en la península de Yucatán (México) fueron evaluados para probar su actividad citotóxica y antiproliferativa usando los ensayos de 3[4,5–dimetiltiazol–2–il]–2,5–bromuro de difeniltetrazolio (MTT) y sulforodamina B (SRB), respectivamente. Para determinar la especificidad de la actividad citotóxica en las células tumorales, el índice de selectividad (IS) fue también calculado. Para lo anterior fueron empleadas las siguientes líneas celulares: células normales de riñón caninino (MDCK), células de carcinoma humano laríngeo (Hep–2), células de adenocarcinoma humano de la cervix (HeLa) y células de carcinoma humano nasoafaríngeo (KB). Los resultados indicaron que 44% y 51% de las especies exhibieron actividad citotóxica y antiproliferativa, respectivamente. La mayoría de los extractos citotoxicos fueron de las especies pertenecientes a la división Chlorophyta, siendo Udotea flabellum y U. conglutinata las especies que mostraron la mayor actividad citotóxica selectiva sobre todas las líneas celulares tumorales. Para la división Rhodophyta, el extracto de Bryothamnion triquetrum tuvo una destacable citotoxicidad selectiva contra las células Hep–2 (CC₅₀ 8.29 µg mL^–1 con SI = 12.04). Dos de las cinco especies de Phaeophyta probadas (Lobophora variegata y Dictyota caribaea) mostraron alta actividad citotóxica sobre la línea celular KB. Los resultados muestran que estos extractos son una fuente prometedora de compuestos para el tratamiento de algunos tipos de cáncer.

Introducción

El cáncer es una de las principales causas de muerte en México entre la población de 30 a 64 años (INEGI 2006). La incidencia de esta enfermedad aumenta constantemente constituyendo un desafío enorme para las instituciones de salud, en donde las demandas para su atención médica se están incrementando considerablemente, con importantes repercusiones económicas. La quimioterapia del cáncer ha sido socavada por el hecho de que los fármacos usados actualmente son relativamente tóxicos o, hasta cierto punto ineficaces, por un incremento de la resistencia. Los mecanismos moleculares de la resistencia a la droga pueden implicar una variedad de factores tales como mutación de los genes blancos y la disminucion de las concentraciones de los fármacos en las células debido a la toxicidad renal (Gottesman y Pastan 1993, Smith et al. 1998, Isnard–Bagnis et al. 2005). Por todo lo anterior, existe una urgente necesidad de descubrir nuevos agentes terapéuticos para esta enfermedad. Los recursos naturales han jugado un papel importante en la obtención de fármacos tales como el taxol, la camptotecina, la vincristina y la vinblastina (Cragg y Newman 1999), principalmente a partir de plantas superiores debido a su accesibilidad. Sin embargo, actualmente algunos fármacos obtenidos de organismos marinos han mostrado resultados prometedores en diversas fases de esta enfermedad.

Las capacidades metabólicas y fisiológicas de los organismos marinos que les permiten sobrevivir en un hábitat complejo les confieren un enorme potencial para la producción de metabolitos únicos que no se encuentran en ambientes terrestres. Así, los organismos marinos y particularmente los invertebrados sésiles han sido reconocidos como una fuente atractiva de potenciales compuestos farmacéuticos (Faulkner 2002). Entre estos organismos, las algas se reconocen también como una de las fuentes más ricas en nuevos compuestos bioactivos de las cuales se han publicado recientemente revisiones sobre la actividad biológica de sus compuestos derivados (Blunt et al. 2006). Con relación a su prometedora actividad para el tratamiento para el cáncer, Yuan y Walsh (2006) obtuvieron actividad antiproliferativa de extractos de Palmaria palmata, Laminaria setchellii, Macrocystis integrifoli y Nereocystis luetkeana sobre la línea celular de aenocarcinoma de cérvix humano (HeLa). El extracto de Stypopodium zonale demostró también gran actividad citotóxica contra la línea celular de melanoma humano (Rocha et al. 2007). Por otro lado, se ha encontrado que varias especies de algas marinas producen metabolitos secundarios con actividad antitumoral (Blunt et al. 2006). Los polisacáridos extraídos de Sargassum stenophyllum y de Capsosiphon fulvescens inhibieron la migración y la viabilidad de las células de melanoma humano in vitro e in vivo (Días et al. 2005) y la inducción de apoptosis en células gástricas humanas (Kwon y Nam 2007), respectivamente. Los fucanos de bajo peso molecular extraídos de Ascophyllum nodosum mostraron actividad antiproliferativa contra el adeno–carcinoma de colon humano (Ellouali et al. 1993) y la línea celular de carcinoma broncopulmonar (Riou et al. 1996). Por otro lado, los esteroles aislados de Galaxaura marginata y de Galaxaura oblongata han demostrado ser citotóxicos a varios tipos de células de cáncer (Sheu et al. 1996, 1997a; Huang et al. 2005). Además, el incremento de los estudios en modelos con roedores han mostrado una prometedora actividad en especies de algas rojas y verdes contra la carcinogénesis de mama (Maruyama et al. 1991, Funahashi et al. 2001), intestinal (Yamamoto y Maruyama 1985) y de la piel (Higashi–Okai et al. 1999). De hecho, el consumo de algas se ha sugerido como agente quimiopreventivo contra el cáncer de mama (Aceves et al. 2005)

Las macroalgas marinas tropicales que crecen en la costa de la Península de Yucatán representan un recurso natural importante poco estudiado. Como parte de la búsqueda de compuestos biológicamente activos nuevos, hemos iniciado el estudio de algas marinas de la costa de la Península de Yucatán. Para ello utilizamos dos análisis para determinar el efecto de extractos acuosos y orgánicos de 27 especies de algas sobre tres líneas celulares humanas de cáncer y en una línea de células normales. El primero fue el ensayo de viabilidad por MTT, el cual determina la actividad mitocondrial en células vivas y ha sido usado para medir la citotoxicidad (Mosmann 1983); el segundo fue el ensayo de sulforodamian B, un colorante que se une a aminoácidos básicos de macromoléculas y ha sido usado para medir la actividad antiproliferativa (Skehan et al. 1990).

Materiales y métodos

Recolecta y preparación de extractos algales

Las algas marinas fueron recolectadas en cuatro lugares en el Golfo de México y la costa del Caribe de la Península de Yucatán entre enero de 2005 y mayo de 2006. Una vez cosechadas, las algas fueron almacenadas en bolsas plásticas y enfriadas en hielo durante su transporte al laboratorio. Se identificaron ejemplares de todas las especies de acuerdo con Littler y Littler (2000) y fueron depositados en el Herbario de Algas Marinas del Cinvestav.

Líneas celulares y medio de cultivo

Las líneas celulares utilizadas para este estudio fueron: células normales de riñón canino (MDCK), células de carcinoma laríngeo humano (Hep–2), células de adenocarcinoma de cervix humano (HeLa) y células de carcinoma nasoafaríngeo humano (KB). Las células fueron cultivadas en medio de DMEM (Gibco) suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (SFB, Gibco), 100 U mL^–1 de penicilina y 100 mg mL^–1 de estreptomicina. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%, con una humedad del 95%. El medio de cultivo fue cambiado dos veces por semana.

Ensayo de citotoxicidad

Este análisis fue realizado de acuerdo con Rahman et al. (2001), sembrando 1.5 x 10⁴ células viables de cada línea celular en una placa de 96 pozos (Costar) e incubándolas de 24 a 48 h. Cuando las células alcanzaron más del 80% de confluencia, se cambió el medio y las células se trataron con los extractos crudos a 6.25, 12.5, 25 y 50 µg mL^–1, disueltos en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración máxima de 0.05%. Después de 72 h de incubación, se agregaron 10 de una solucion de 5 mg mL^–1 de 3[4,5–dimetiltiazol–2–yl]–2,5–bromuro de difeniltetrazolio (MTT, Sigma) a cada uno de los pozos y se incubó a 37°C durante 4 h. Se eliminó el medio y el formazán, un producto generado por la actividad de la deshidrogenasa en las células, fue disuelto en isopropanol acidificado (HCl 0.4 N). La cantidad de MTT–formazán, que es directamente proporcional al número de células vivas, fue determinada midiendo la densidad óptica (DO) a 540 nm usando un lector de prueba biológica (BioRad, USA). Se usó docetaxel (Sigma), un fármaco antitumoral, como control positivo, mientras que las células sin tratar (0.05% DMSO) se usaron como control negativo. Se calculó la concentración del extracto crudo que mató el 50% de las células (CC₅₀). Todas las cocentraciones fueron evaluadas por duplicado y cada experimento fue realizado por triplicado.

Ensayo antiproliferativo

Se realizó un ensayo de la sulforodamina B (SRB) para determinar la inhibición del crecimiento mediante análisis colorimétrico, que estima indirectamente el número de células tiñendo la proteína celular total con el colorante SRB (Rahman et al. 2001). El método se aplicó bajo las mismas condiciones que los análisis citotóxicos, salvo que el medio fue substituído por DMEM al 10% de SFB para inducir la proliferación celular. Después de una incubación de 48 h, se desecho el medio y las células fueron fijadas con 100 µL de ácido tricloroacético frío al 40% (TCA, Aldrich). Después se incubaron las células a 4°C durante 1 h y las placas se lavaron cinco veces con agua fría. Se drenó el exceso de agua y las placas se dejaron secar. Posteriormente, se agregaron 50 µL de SRB (10 mg de ácido acético al 1%, Sigma) y se dejóreposar durante 30 min. Finalmente, las placas se lavaron con 50 mL de ácido acético al 1% y se aclararon cuatro veces hasta que fue posible observar el tinte adherido a las células. Se midió la DO a 540 nm usando un lector ELISA (Bio–Rad modelo 450). Se utilizó docetaxel (Sigma), un fármaco antitumoral, como control positivo, mientras que las células sin tratar fueron utilizadas como controles negativos. Se calculó el valor de IG₅₀, definido como la concentración del extracto que inhibe el 50% del crecimiento celular. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Índice de selectividad

Para determinar la especificidad de la actividad citotóxica en las líneas célulares tumorales fue necesario obtener información sobre su citotoxidad en células normales. Por lo tanto, los extractos fueron probados contra una línea de MDCK. El índice de selectividad (SI) fue calculado usando la siguiente ecuación:

La actividad citotóxica y antiproliferativa fue determinada como el porcentaje de inhibición de la proliferación celular:

La CC₅₀, IG₅₀ y el 95% del límite de confianza fueron calculados por análisis de Probit.

Resultados

Se recolectaron veintisiete especies de macroalgas pertenecientes a las tres divisiones, en cuatro lugares de la costa (fig. 1). El material algal consistió en catorce especies de algas rojas (Rhodophyta), cinco especies de algas cafés (Phaeophyta) y ocho especies de algas verdes (Chlorophyta). En la tabla 1 se muestra el origen y la información taxonómica de cada especie, así como el rendimiento de sus extractos orgánicos y acuosos (% de peso seco).

Se evaluaron las actividades citotóxicas y antiproliferativas para aclarar si el efecto de los extractos se correlaciona directamente con la inducción de la muerte o sobre la supresión de la proliferación celular. De acuerdo a los criterios del Instituto Nacional del Cáncer de los EUA, un extracto es considerado activo si tiene una CC₅₀ < 30 µg mL¹ sobre células tumorales (Suffness y Pezzuto 1990). En este trabajo, la actividad de los extractos se consideró alta si era <30 µg mL^–1, media si era de 31–60 µg mL^–1 y baja si era de 61–99 µg mL^–1.

Rhodophyta

Dos de las catorce especies de Rhodophyta probadas (Bryothamnion triquetrum y Gracilaria cervicornis) resultaron citotóxicas contra las células de cáncer (tabla 2). Bryothamnion triquetrum mostró una actividad citotóxica alta y selectiva contra las células Hep–2 (CC₅₀ = 8.29 µg mL^–1 y SI = 12.04), así como una actividad media contra las células KB y HeLa (CC₅₀= 32.57 y 48.45 µg mL^–1, respectivamente). Sin embargo, el extracto mostró una actividad antiproliferativa baja en las células KB (IG₅₀ 62.98 µg mL¹) (tabla 3).

Por otra parte, Gracilaria cervicornis mostró una actividad citotóxica alta contra las células KB (CC₅₀= 19.23 µg mL^–1); sin embargo, mostró actividad citotoxica en las células normales (CC₅₀ = 48.64 µg mL¹). Su actividad antiproliferativa contra células KB y HeLa fue baja (IG₅₀= 68.28 y 75.56 µg mL^–1 , respectivamente).

Phaeophyta

Tres de las cinco especies probadas de Phaeophyta (Turbinaria turbinata, Lobophora variegata y Dictyota caribaea) mostraron una cierta actividad en la línea celular KB. El extracto de T. turbinata mostró las actividades citotóxica y antiproliferativa más altas contra células KB (CC₅₀= 23.94 µg mL^–1 e IG₅₀= 29.84 µg mL^–1, respectivamente); sin embargo, también mostró actividad citotóxica contra las células normales (tabla 2).

Chlorophyta

Excluyendo la especie Halimeda tuna, los extractos de todas las Chlorophyta probadas mostraron alguna actividad citotóxica y antiproliferativa contra las células tumorales (tablas 2, 3). Las propiedades citotóxicas (CC₅₀≤ 30 µg mL^–1) obtenidas fueron altas y como sigue: P. dumetosus > U. conglutinata > U. flabellum, sobre las células Hep–2; U. flabellum > U. conglutinata > P. lamourouxii > H. incrassata, sobre las células HeLa; y U. flabellum > U. conglutinata > A. digitata > P. lamourouxii > P. dumetosus > R. phoenix, sobre las células KB.

Discusión

En relación con los extractos acuosos, que no mostraron ninguna importante actividad, se considera que los extractos orgánicos poseen diferentes constituyentes en comparación con los extractos hidrofílicos que pueden ser importantes por los efectos citotoxicos y antiproliferativos sobre líneas celulares de cáncer. El factor más importante es la permeación a la membrana: los compuestos lipofílicos son permeables a la membrana en tanto que los hidrofílicos no. Esto puede explicar al menos en parte el poco efecto de los extractos hidrofílicos sobre las líneas celulares.

Rhodophyta

Bryothamnion triquetrum contiene lectina como componente principal en sus células con estructuras primarias que difieren de las procedentes de plantas o animales, por lo que esta proteína puede ser el paradigma de una nueva familia de lectina (Calvete et al. 2000). Las lectinas interactúan con estructuras específicas de glicanos unidas a glicoconjugados solubles de la membrana. Estas interacciones entre proteína y carbohidrato desempeñan un papel relevante en algunos procesos biológicos tales como la comunicación entre las células, las infecciones patógenas y la defensa del huésped, fertilización, desarrollo, diferenciación de la célula, cáncer y metástasis (Damme et al. 1998, Beisel et al. 1999). Existen evidencias que demuestran que las lectinas de plantas terrestres tienen actividad antitumoral (Dalla Pellegrina et al. 2004, Park et al. 2004, Chauhan et al. 2005, Khil et al. 2007). Sin embargo, en este estudio el extracto acuoso que contiene compuestos hidrofílicos como la lectina, no registró actividad importante, lo que sugiere que las lectinas no podrían ser las responsables de la actividad citotóxica y antiproliferativa de B. triquetum sobre las células tumorales. Son necesarios más estudios para aislar e identificar los compuestos activos de B. triquetum responsables de tales efectos.

Con relación a la alta actividad citotóxica mostrada por Gracilaria cervicornis sobre las células de KB, es de destacar que se han aislado ácidos grasos clorados (Shoeb y Jaspars 2003), lecitinas con actividad acaricida (Leite et al. 2005), policavernósidos tóxicos (Yotsu–Yamashita et al. 2004) y ciclopropano con cerebrosidos, con citotoxicidad débil sobre la línea celular de melanoma (Ito y Nagai 1998, Sun et al. 2006). Sin embargo, aunque no existen otros trabajos en los que se haya reportado actividad citotoxica para esta especie en particular, los resultados obtenidos en el presente estudio hacen de G. cervicornis una candidata para futuras investigaciones.

Phaeophyta

Los bromofenoles y fenoles son una de las principales moléculas bioactivas de las Phaeophyta y recientemente han recibido gran atención debido a sus efectos terapéuticos (Kolodziej et al. 2001, Paul y Puglisi 2004, Tasdemir et al. 2006). Los florotaninos o polifenoles de algas cafés poseen un papel defensivo contra herbívoros principalmente en especies algales tropicales. Son polímeros derivados del acetato–malonato de floroglucinol y se encuentran en concentraciones altas de 25% a 40% del peso seco (Ragan y Glombitza 1986). Los florotaninos son importantes en el género Lobophora, en cuyas especies se encuentran en concentraciones de 13.9% a 29.2% de peso seco (Targett et al. 1992, Zubia et al. 2007). De hecho, se ha reportado una notable producción de florotaninos de 330 µg g^–1 día^–1 y una alta tasa metabólica para las especies de este género (Arnold y Targett 1998, Arnold y Targett 2000). Recientemente Zubia et al. (2007) reportaron que el extracto orgánico de L. variegata de Yucatán mostró una alta actividad antioxidante atribuíble a su alto contenido fenólico. Los compuestos fenólicos son generalmente conocidos por mostrar no sólo actividad antioxidante sino también pro–oxidante. Por ejemplo, el 4–metilcatecol ejerce una acción oxidante en las células en cultivo a través de la generación de peróxido de hidrógeno. Este efecto también puede ser observado incluso incubando el compuesto en el medio sin las células (Morita et al. 2003). La quercetina y los compuestos fenolicos relacionados que contienen una forma del catecol en sus estructuras químicas, han mostrado que son fácilmente oxidados, dando por resultado la peroxidación de lípidos bajo ciertas condiciones en ensayos in vitro (Laughton et al. 1989, Yamanaka et al. 1997, Galati et al. 1999). Otros estudios recientes también han mostrado que estos compuestos se pueden oxidar y pueden generar rápidamente el peróxido de hidrógeno en medios de cultivo celulares de uso general (Long et al. 2000). De acuerdo con estos resultados, parecería razonable considerar que los compuestos fenólicos que son completamente solubles en solventes orgánicos pueden ejercer daño oxidativo en las células como resultado de la generación de peróxido de hidrógeno en el medio de cultivo. Sin embargo, esta inferencia es poco probable debido a que L. variegata mostró una selectividad alta sobre células tumorales (SI de 6 a 17), implicando un selectivo mecanismo de acción sobre las celulas de cáncer. Además de lo anterior, la actividad antiproliferativa de L. variegata fue baja en las células KB (IG₅₀= 68.48 µg mL^–1). Un trabajo reciente mostró una débil inhibición del crecimiento de L.variegata a concentraciones <100 µg mL^–1 contra células de melanoma, aunque fracciones semipurificadas mostraron un incremento del efecto con una IG50 < 18 µg mL^–1 (Rocha et al. 2007), lo que sugiere la existencia de metabolitos secundarios específicos que podrían interferir con la mitosis celular. Algunas evidencias han propuesto que los compuestos fenólicos inhiben la actividad de la telomerasa en las células tumorales (Naasani et al. 1998, Mizushina et al. 2005, Chakraborty et al. 2006). La telomerasa es una transcriptasa reversa especializada, tiene un importate papel en el proceso de inmortalización y tumorogénesis. En la mayoría de los tumores, el mantenimiento de los telómeros se alcanza con la expresión de la telomerasa (Akiyama et al. 2002). El alto contenido fenólico de L. variegata puede ser la causa del efecto selectivo sobre las células tumorales, probablemente como resultado de la inhibición sobre la actividad de la telomerasa. En este sentido, es necesario realizar estudios más profundos para sustentar esta implicación. Por otro lado, el loboforólido, un macrólido policíclico estructuralmente sin precedente en algas marinas ha sido recientemente aislado de esta especie mostrando actividad antineoplásica contra la línea celular del tumor de colon HCT–116 (Kubanek et al. 2003). Por todo lo anterior, L. variegata de Yucatán se perfila como una especie prometedora y de interés para continuar con futuras investigaciones en este campo.

Por otro lado, la actividad citotóxica mostrada por Dictyota caribaea puede ser debida a la presencia de diterpenos puesto que ha sido reportado que la familia Dictyotaceae produce una serie de diterpenos únicos con actividad contra las células tumorales (Gedara et al. 2003). En cuanto a la actividad mostrada por Turbinaria turbinata, se han aislado compuestos citotóxicos y antitumorales de esta especie tales como el ácido turbinárico (Asari et al. 1989), esteroles (Sheu et al. 1997b) y fucosteroles oxigenados (Sheu et al. 1999), que podrían ser los responsables del efecto tanto citocidal como citoestático que provocan daño tanto a las células tumorales como a las normales.

Chlorophyta

La familia Udoteaceae (Halimeda, Penicillus y Udotea) mostró un cierto patrón citotóxico en relación con el análisis taxonómico a nivel de género. Esta familia es conocida por la producción de terpenos (Fenical y Paul 1984, Paul y Fenical 1987) y, aunque no es posible excluir que una o varias moléculas contribuyan a esta capacidad, la presencia de terpenos en Chlorophyta puede estar relacionada con la actividad citotóxica mostrada, puesto que se ha demostrado que este tipo de metabolitos, aislados de fuentes terrestres, son responsables de actividad citotóxica (Kintzios 2006). Los extractos de U. flabellum y de U. conglutinata mostraron la actividad citotóxica selectiva más alta contra todas las variedades de células de cáncer. El diterpenoide hidrato de udoteatrial ha sido aislado de la especie U. flabellum (Nakatsu et al. 1981), y sus análogos sintéticos han mostrado una significativa citotoxicidad in vitro contra el carcinoma humano KB y A–549 (Yu–Ting et al. 1993). Basado en lo anterior, las especies de Udotea se perfilan como fuentes potenciales para el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos.

En cuanto a la alta citotoxicidad mostrada por las dos especies de Penicillus de Yucatán, no existe a la fecha ningún otro estudio donde se reporten actividades similares a las encontradas en el presente estudio.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por SEP–CONACYT 053687 e IMSS–FOFOI (contrato 2005/1/I/051). Los autores desean agradecer el Cinvestav por la beca postdoctoral de R Moo–Puc.

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Nota

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