Inmunolocalización y contenido de esteroides sexuales en ovarios de hembras de Peromyscus melanotis Allen & Chapman, 1897 (Rodentia: Muridae) durante la primera mitad de la preñez
Arturo Salame-Méndez1, Rosa María Vigueras-Villaseñor4, Joaquín Herrera-Muñoz3,5, Enrique Mendieta-Márquez3, Isaías H. Salgado-Ugarte2,6, Alondra Castro-Campillo2 y José Ramírez-Pulido2
1 Departamentos de Biología de la Reproducción, División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana-Unidad Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco No. 186. Col. Vicentina. Iztapalapa, CP 09340. Apdo. Postal 55-535. D. F. MÉXICO. E-mail 1: asam@xanum.uam.mx
2 Biología, División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana-Unidad Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco No. 186. Col. Vicentina. Iztapalapa, CP 09340. Apdo. Postal 55-535. D. F. MÉXICO.
3 Ciencias de la Salud. División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana-Unidad Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco No. 186. Col. Vicentina. Iztapalapa, CP 09340. Apdo. Postal 55-535. D. F. MÉXICO.
4 Departamento de Histomorfología, Instituto Nacional de Pediatría, SSA. CP 04530. D. F. MÉXICO.
]]> 5 Unidad de Investigación en Medicina Reproductiva, Hospital "Luis Castelazo Ayala" IMSS. CP 01090. D. F. MÉXICO.6 Biología, FES "Zaragoza", UNAM. CP 09220, D. F. MÉXICO.
Recibido: 11 de marzo 2002
Aceptado: 31 de julio 2002
Resumen
Se analizó la histología de los ovarios de hembras de Peromyscus melanotis en la primera mitad de la preñez, así como el contenido de esteroides sexuales y su localización en las gónadas. Los ovarios mostraron folículos en diferentes etapas de crecimiento y cuerpos lúteos con actividad secretora. Las concentraciones tisulares de pregnenolona (P5), progesterona (P4), 17" -hidroxi-progesterona (17P4), androstendiona (A), testosterona (T) y estradiol (E2) fueron analizadas por radioinmunoanálsis (RIA). La P4 fue el esteroide de mayor concentración, seguido por P5, T, E2, 17P4, y A, respectivamente. La inmunohistoquímica reveló que la P4 se localiza principalmente en los cuerpos lúteos y el E2 tanto en el estroma como en las células foliculares. Los resultados muestran que durante la primera mitad de la preñez de P. melanotis se mantiene la foliculogénesis y que el cuerpo lúteo constituye el principal, aunque no el único, tejido esteroidogénico en el ovario.
Palabras clave: Peromyscus melanotis, preñez, ovarios, hormonas esteroides, México.
]]> Abstract
Ovarian histology, sexual steroids contents and their localization within the gonads were analyzed in females of Peromyscus melanotis during the first half of their pregnancy. The ovaries showed follicules in different growth stages and fully secreting corpora lutea. Ovarian concentrations of pregnenolone (P5), progesterone (P4), 17" -hydroxy-progesterone (17P4), androstenedione (A), testosterone (T), and estradiol (E2) were analyzed by radioimmunoassay (RIA). P4 was the steroid with the highest concentrations, followed by P5, T, E2, 17P4, and A, respectively. Inmunohistochemical analyses revealed that P4 is mainly located in the corpora lutea and that E2 can be found both in the estroma and in the follicular cells. Our results suggest that during the first half of the pregnancy, folliculogenesis is maintained in P. melanotis, and that the corpus luteum constitutes the main, although not the only, steroidogenic tissue within the ovary.
Key words: Peromyscus melanotis, pregnancy, ovaries, steroid hormones, Mexico.
Introducción
La endocrinología reproductiva de roedores se basa en los modelos clásicos de laboratorio establecidos con cepas de ratón y de rata albinos. En ellos se han demostrado las variaciones que tienen algunas hormonas en diferentes etapas de su ciclo de vida y, en algunos casos, su mecanismo de acción. Si bien la fisiología reproductiva en los modelos descritos podría considerarse semejante en términos generales a la de los roedores de vida silvestre, quedaría la incógnita de si los mecanismos particulares son especie-específicos.
La actividad reproductiva de las hembras está relacionada con la función de los ovarios en cuanto a su producción de ovocitos y de esteroides sexuales (ES). Los ES imprescindibles en la biología reproductiva son las progestinas (progesterona, P4), estrógenos (estrona, E1; estradiol, E2) y andrógenos (androstendiona, A; testosterona, T).
La P4, al actuar en el endometrio, permite que se lleve a cabo la implantación y el desarrollo embrionario (O ' Grady & Bell 1977, Surani 1977, Madjerek 1972, Wu 1972). El E2 promueve el desarrollo folicular (Peters et al. 1975) y actúa como un factor luteotrópico, luteolítico, o ambos (Gorbman et al. 1983, Gibory & Keyes 1978, Damaur & Short 1973).
El E2 y la P4, coordinadamente con las gonadotropinas (hormona estimulante del folículo, FSH, por sus siglas en inglés; hormona luteinizante, LH, por sus siglas en inglés), regulan el ciclo estral o menstrual (Freeman 1994, Hillier 1994, Bronson 1989, van Tienhoven 1983, Finn & Booth 1977) que consta de foliculogénesis y ovulación. Además, la P 4 y el E2 facilitan la migración del embrión por el endometrio (Gorbman et al. 1983, Surani 1977).
La T es el principal metabolito intermediario para la producción de E 2 y la biotransformación de T en E2 se debe a la participación de una enzima llamada aromatasa (Chen et al. 1993), por lo que a este proceso de síntesis se le denomina aromatización (Akthar et al. 1997).
]]> Durante la preñez los ovarios producen y secretan P4, T y E 2, siendo el tejido esteroidogénico primario el cuerpo lúteo (CL). El CL funciona como un órgano endocrino a partir del cual algunas etapas de la preñez se mantienen (Niswender et al. 1994). La actividad endocrina del tejido lúteo, es regulada por el sistema nervioso central (Hillier 1994), así como por señales del embrión en desarrollo. En este proceso, llamado reconocimiento materno de la preñez (Wiltbank et al. 1992), las hormonas que actúan difieren entre las especies, así como los mecanismos de acción a partir de los cuales se mantiene la función lútea (Niswender et al. 1994). La función endocrina del tejido lúteo durante la preñez ha sido analizada en roedores de laboratorio y se sabe que en roedores de los géneros Mus (Pedersen & Peters 1971) y Rattus (Nelson et al. 1992, Miyauchi & Midgley 1990, Gibori et al. 1982, Meyer & Bruce 1979) el CL permanece activo durante la primera mitad de este proceso. Sin embargo, esta información se desconoce en roedores silvestres por lo que hemos iniciado recientemente el estudio de la biología reproductiva de dos especies del género Peromyscus y en este trabajo se analiza, de manera preliminar, la función de los ovarios en el ratón de orejas oscuras, Peromyscus melanotis, en la primera mitad de la preñez.
Materiales y métodos
Material Biológico
Se recolectaron individuos de P. melanotis de mayo de 1997 a junio de 1998 en el Parque Nacional Cumbres del Ajusco, Distrito Federal (0.85 Km N, 3.5 Km W Ecuanil, 3180 m; 19 ° 13' 37" N, 99 ° 15' 37" W). Su captura se hizo de manera selectiva con trampas Sherman (8 x 9 x 23 cm) cebadas con hojuelas de avena. El mismo día de la captura los ratones fueron trasladados al laboratorio en donde se les sacrificó por dislocación cervical y se registraron sus medidas convencionales (Kunz et al. 1996, Ramírez-Pulido et al. 1989). Durante la disección de los aparatos reproductores de las hembras, se constató si estaban preñadas o no. La edad aproximada de la preñez se determinó, de acuerdo con Layne (1968), a partir de la medición del engrosamiento del útero provocado por el embrión en desarrollo, así como por la medida céfalo-caudal de los fetos mayores de 12 días. La edad de la hembra se determinó de acuerdo con el desgaste de la superficie oclusal de los molares sensu Hoffmeister (1951).
Reactivos y Disolventes
Todos los reactivos y disolventes orgánicos fueron de grado analítico y se obtuvieron de diferentes casas comerciales.
Esteroides de Referencia
Para la nomenclatura de los esteroides se siguió a Kime (1995): 3β-hidroxi-5-pregneno-20-ona (pregnenolona, P5); 4-pregneno-3,20-diona (progesterona, P4); 17α-hidroxi-4-pregneno-3,20-diona (17-hidroxiprogesterona, 17P4); 4-androsteno-3,17-diona (androstendiona, A); 17β-hidroxi-4-androsteno-3-ona (testosterona, T) y 1,3,5(10)-estrantrieno-3,17β-diol (estradiol, E2). Los esteroides se obtuvieron de Steraloids® (Wilton, New Haven, USA) y se purificaron, previo uso, por cromatografía en capa fina (CCF), utilizando secuencialmente benceno, benceno-acetato de etilo (7:3, v/v) y benceno-metanol (95:5, v/v).
Esteroides Radiactivos
]]> Se obtuvieron de New England Nuclear® (Boston, MS) P5 (6,7- 3H) (actividad específica -ae- 93 Ci/mmol); P4 (1,2,6,7- 3H) (ae 109 Ci/mmol); 17P4 (1,2-3H) (ae 44 Ci/mmol); A (1,2,6,7-3H) (ae 84 Ci/mmol); T (1,2,6,7,16,17-3H) (ae 139 Ci/mmol) y E2 (2,4,6,7,16,17-3H) (ae 140 Ci/mmol). Cada esteroide se purificó, previo uso, por CCF y se utilizaron los mismos sistemas cromatográficos mencionados en el apartado de esteroides de referencia.Análisis Histológicos
Se estudiaron 5 hembras preñadas: una juvenil (edad I) con una edad gestacional de 7 días; dos subadultas (edad II), una con 10 días y la otra con 11 días de gestación; una adulta joven (edad III), con 13-14 días de gestación y una adulta (edad IV) con una edad gestacional de 12 días. A cada una de estas hembras se les extirparon los ovarios, fijándose el órgano derecho en formol al 10% en solución amortiguadora de fosfatos para este estudio. Los otros ovarios se utilizaron para un análisis no reportado en este trabajo. Las gónadas se procesaron para ser incluidas en parafina. De cada una de ellas se obtuvieron cortes de 5-10 µm de grosor y se tiñeron con hematoxilina-eosina.
Inmunohistoquímica
De los ovarios embebidos en parafina, utilizados para el análisis histológico, se obtuvieron cortes de 3 µm de grosor, los cuales se desparafinaron y clarificaron con xilol. La inmunolocalización de P4 y E2 se realizó según Kurman et al. (1978). A cada corte se le agregó anticuerpo policlonal contra P4 o contra E2 (Biogenex®, USA) incubándose 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción cromogénica de inmunolocalización se realizó utilizando fucsina. Además, como parte de la técnica estándar y con el objeto de comprobar la actividad de los anticuerpos usados, así como para constatar que no hubiese reacción inmunohistoquímica inespecífica, se prepararon controles de manera paralela. Estos controles incluyeron secciones de ovarios de Peromyscus incubados sin el anticuerpo primario, así como secciones de ovarios de rata (Cepa Wistar) y ratón (Cepa CD1) en diferentes etapas del ciclo estral. Esto nos permitió cotejar la función positiva de los anticuerpos y asegurar que los resultados presentados en este trabajo constituyesen evidencia de inmunolocalización específica de cada hormona en los tejidos de los ovarios analizados.
Cuantificación de Esteroides Sexuales
La extracción de los esteroides sexuales a ser analizados, se llevó a cabo a partir del par de ovarios de cuatro hembras preñadas: una juvenil con una edad gestacional de 8 días; dos subadultas, una con 9 días y la otra con 12 días de gestación, y una adulta con 11 días de gestación. Los ovarios extirpados se colocaron en tubos Eppendorf que contenían solución isotónica de Ringer y se almacenaron a -70 ° C hasta su análisis. Cada par de órganos se homogeneizó por ultrasonido (Sonic Dismembrator-50, Fisher®), y se obtuvo una alícuota para determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford (1976), utilizando albúmina de suero de bovino como estándar para la curva patrón. Otra alícuota del homogenizado se transfirió a tubos conteniendo . 1000 cpm de cada uno de los esteroides tritiados utilizados como trazadores para valorar el porcentaje de recuperación.
Los esteroides totales se extrajeron dos veces con éter dietílico. La fase orgánica se separó de la acuosa, colocando cada tubo en hielo seco-acetona; al congelarse la fase acuosa, la orgánica se decantó a otro tubo y se evaporó a sequedad.
Separación de los Esteroides Sexuales
A cada tubo con los esteroides totales se le agregó una disolución de éter:metanol (2:1, v/v) y el contenido se transfirió a placas de vidrio cubiertas con 0.25 mm de gel de sílice e indicador para absorción de radiación ultravioleta de 254 nm (Merck®). Se utilizó un par de carriles de cada cromatoplaca para la aplicación de los esteroides de referencia. Los esteroides de cada muestra fueron separados utilizando los sistemas cromatográficos mencionados en el apartado de esteroides de referencia. Las áreas que correspondían al esteroide de referencia, de acuerdo con la distancia de desplazamiento que recorre la muestra desde el punto de aplicación (Rf = running factor o factor de corrimiento), fueron separadas y resuspendidas en una disolución de éter:metanol (1:1, v/v). Una alícuota de esta disolución se transfirió a un vial para valorar el porcentaje de recuperación. El disolvente restante se evaporó en estufa (30 ° C) con vacío y en cada tubo correspondiente a P5, P4, 17P4, A, T y E2 se determinó por duplicado su contenido por medio de técnicas radioinmunoanalíticas (RIA) descritas por Mendieta et al. (1991).
]]> Radioinmunoanálisis (RIA)A cada tubo con el esteroide a evaluar se le agregó solución amortiguadora de fosfatos (0.25 M pH 7.0 con azida de sodio y gelatina 1%) con el correspondiente antisuero generado en conejo, a diluciones previamente calculadas (Bermúdez et al. 1975), y el estándar apropiado ( . 5000 cpm), incubándose la mezcla por 18 hrs a 4 ° C. Al término de la incubación, el esteroide libre se separó del unido, agregando a cada tubo 200 : l de una mezcla de carbón-dextrán. Cada tubo se centrifugó a 1500 x g x 15 min a 4 ° C, decantándose el sobrenadante a un vial al que se le agregó Instagel (Packard®). El contenido de radiactividad se midió en un espectrómetro de centelleo líquido (Beckman®, LS-7000) con una eficiencia máxima para tritio del 53%. El control de calidad de cada RIA fue realizado de acuerdo a especificaciones internacionales de exactitud, precisión y sensibilidad (Cekan 1976). Las concentraciones de los esteroides se expresaron como log (pg/mg de proteína).
Análisis Estadísticos
Dado que los valores de concentración de los ES mostraron heteroscedasticidad, se decidió utilizar una transformación logarítmica que mostró varianzas más homogéneas (Salgado-Ugarte 1992) y todos los análisis estadísticos posteriores se llevaron al cabo con los datos transformados.
Para analizar la relación entre la edad de gestación y el contenido de ES, se utilizó un análisis de covarianza (ANCOVA), en donde los diferentes ES fueron los tratamientos y la edad de gestación la variable covariada. Posteriormente, para investigar la significancia de las diferencias entre las concentraciones de ES por edad gestacional, se realizaron comparaciones múltiples de Bonferroni. Además, para determinar el patrón de la concentración de cada esteroide con la edad, se hicieron regresiones para cada uno de los ES cuantificados (Winer et al. 1991).
Con el objeto de integrar el patrón general de concentración de los ES analizados durante la primera mitad de la preñez, los datos de todas las hembras gestantes fueron agrupados por esteroide. Para facilitar la visualización de la dispersión de los datos, los resultados se presentan por medio de diagramas de caja (Hoaglin et al. 1983, Salgado-Ugarte 1992). Todos los cálculos se realizaron con el paquete estadístico StataCorp (2001).
Resultados
Histología e Inmunohistoquímica
Se observaron folículos en diferentes etapas de desarrollo en cada uno de los ovarios de las cinco hembras analizadas durante la primera mitad de la gestación. Asimismo, todos los ovarios presentaron cuerpos lúteos con actividad secretora (Fig. 1A) conformados por células granuloso-luteínicas, las cuales constituyen el epitelio glandular (Fig. 1C). La reacción inmune contra E2 se presentó en el estroma y con mayor intensidad en la región folicular (Fig. 1B), mientras que la reacción inmunológica contra la P4 fue mayor en el tejido lúteo (Fig. 1C).
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RIA
En el cuadro 1 se muestran las concentraciones originales de los seis ES analizados, de acuerdo con la edad de gestación de las hembras y se pueden observar dos claras tendencias generales en la información. La primera es que existe una disminución progresiva de la concentración de cada esteroide conforme avanza la edad de gestación (columnas). La segunda es que la concentración de P4 supera por mucho la de cualquier otro esteroide en todas las hembras, independientemente de la edad de gestación (filas). Ambas tendencias fueron corroboradas por los resultados de los análisis estadísticos (Figs. 2 y 3).
En el segundo caso, dado que las concentraciones relativas entre los diferentes ES presentaron la misma tendencia en las cuatro hembras con diferentes edades de gestación (filas en el Cuadro1), se agruparon los datos para explorar el patrón general en la primera mitad de la preñez de Peromyscus melanotis. En la figura 3, como en el cuadro 1, se puede apreciar que la concentración de la P4 supera cuatro veces más la suma de las concentraciones de todos los ES restantes. A las concentraciones de esta progestina, le siguieron en orden descendente las de P5, T, E2, 17P4, y A, respectivamente. Con base en las pruebas a posteriori de Bonferroni, se determinó que la concentración de P4 superó significativamente la de P5 (P< 0.001); asimismo, la concentración de T fue mayor que las de 17P4, A y de E 2 (P< 0.001).
Discusión
El análisis histológico de los ovarios de las hembras preñadas de P. melanotis permitió observar folículos en diferentes etapas de crecimiento, lo cual coincide con lo citado para roedores de laboratorio como Mus, género en el que hay un desarrollo folicular no cíclico durante la primera mitad de la preñez (Pedersen & Peters 1971), así como cuerpos lúteos (CL) con características secretoras.
Los CL de los ovarios de las hembras preñadas de P. melanotis pudieron formarse a partir de los folículos del último ciclo estral o incluso formarse durante la preñez, como lo demuestran Pedersen y Peters (1971) en el ratón albino. La presencia de actividad secretora de los CL de las hembras preñadas en P. melanotis fue evidente y muy similar a lo reportado en los tejidos lúteos de hembras preñadas de ratones de laboratorio (Pedersen & Peters 1971).
En Mus musculus, la vida media de un CL es de 12 días, tiempo en el que comienza su luteólisis (Pedersen & Peters 1971). En cambio, en Rattus rattus el CL es funcional en la producción de P4 y E 2 (Sridaran 1986) hasta la primera mitad de la preñez (Miyauchi & Midgley 1990, Gibori et al. 1982, Gibori et al. 1977), coincidiendo la luteólisis con el conspicuo decremento de P4 en el suero de hembras de 18 días de preñez (Morishige et al. 1973, Pepe & Rothchild 1972). En función de la edad aproximada de la gestación de las hembras estudiadas de P. melanotis, que fue de 7 a 14 días, así como de la comprobación de las características secretoras de los CL y de acuerdo a la inmunolocalización preferente de P4 en este tejido, nuestros resultados apoyan que los CL de los ovarios de P. melanotis son, en efecto, funcionales durante la primera mitad de gestación.
La actividad secretora de los CL durante la primera mitad de la preñez en P. melanotis podría deberse a la actividad de una luteotropina secretada por la decidua y el trofoblasto. Lo anterior se ha demostrado en la rata albina (Niswender & Nett 1988, Gibori et al. 1988), si bien no existen datos en otros roedores de laboratorio, y menos todavía en especies silvestres.
La biosíntesis de las hormonas esteroides se lleva a cabo por vías metabólicas bien establecidas (Makin 1975), iniciándose con la biotransformación del colesterol en P5, que es el esteroide a partir del cual se lleva a cabo la producción de progestinas, como la P 4; y posteriormente la de los andrógenos (A y T) y la de los estrógenos (E1 y E2). A su vez, la síntesis de T puede seguir dos rutas metabólicas alternas: la vía de los intermediarios Δ5 y la vía de los intermediarios Δ4. La prevalencia de una vía sobre la otra varía en cada especie; por ejemplo, en el caso de ratones y ratas de laboratorio la ruta prevaleciente es la Δ4, mientras que en humanos, cerdos, conejos y perros es la Δ5 (Henricks 1991). La importancia relativa de los intermediarios Δ4 y Δ5, depende de la actividad de la enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3β-HSD), la cual es considerada como un marcador característico de los tejidos esteroidogénicos (Lippset 1986).
Los resultados de la cuantificación de los ES presentados en este trabajo permitieron constatar que en los ovarios de hembras de P. melanotis se encuentran concentraciones detectables de P5 y de los esteroides intermediarios que conforman la vía Δ4 (P4, 17P4 y A), durante la primera mitad de la gestación. De acuerdo con esto, la esteroidogénesis en P. melanotis parecería comportarse de manera semejante a la del ratón y la rata de laboratorio. Sin embargo, para confirmar esto, estamos estudiando la biotransformación del precursor colesterol para definir claramente la ruta esteroidogénica preferente.
]]> La producción de P4 en ratas de laboratorio es muy evidente en la primera mitad de la preñez. Meyer y Bruce (1979) constataron que entre los días 10 a 16 de la preñez, la concentración de P4 en suero tiene un incremento dramático, al igual que el peso de los CL. Esta información concuerda con los resultados obtenidos en este trabajo, en donde el esteroide de mayor concentración en los ovarios de hembras preñadas de P. melanotis fue la P4, lo que parece reflejarse en las concentraciones plasmáticas de esta progestina, que alcanzan un valor aproximado de 700 pg/ml (datos no publicados). Estos hechos, aunados a que la inmunolocalización de P4 fue preferente en los CL, sugieren que, durante la primera mitad de la preñez, la producción de esta hormona esteroide en los ovarios de P. melanotis proviene principalmente del tejido lúteo.Por otra parte, la baja concentración de E2 con respecto a las de P 4 y T en los ovarios de las hembras preñadas de P. melanotis, coincide con lo reportado en Rattus (Braden et al. 1994 Bogovich & Richards 1982, Richards & Kersey 1979), en donde la actividad de aromatización es baja. Este fenómeno se presenta normalmente en la fase lútea del ciclo estral.
Durante la primera mitad de la preñez, la P4 actúa tanto en la implantación como en el desarrollo embrionario, por lo que el principal tejido productor de esta hormona es el CL. Sin embargo, conforme avanza la gestación, y por acción del E2, la función del CL inicia su involución (Gibori et al. 1977 Gibori & Keyes 1978); repercutiendo en la producción de P4 (Morishige et al. 1973). Al haberse determinado que los contenidos de todos los ES, y en particular de la P 4, disminuyeron con la edad de la gestación, se demuestra que la función endocrina (esteroidogénica) del CL de P. melanotis decrece conforme avanza la primera mitad de la preñez. Sería interesante establecer si el estradiol actúa como un factor luteolítico en esta especie.
Los resultados de este trabajo permiten constatar que, durante la primera mitad de la preñez, hay desarrollo folicular en los ovarios de P. melanotis, que los CL presentan actividad secretora y que existen concentraciones detectables de P5, Δ4 intermediarios (P4, 17P4, A), T y E2, siendo la P4 la hormona de mayor concentración. Asimismo, la inmunolocalización de E2 es evidente tanto en el estroma como en el tejido folicular, mientras que la de P4 es muy evidente en los CL y residual en el estroma. A la luz de estos resultados se concluye que, durante la primera mitad de la preñez, los ovarios de P. melanotis mantienen la foliculogénesis y que el CL es el principal, pero no el único, tejido esteroidogénico.
Agradecimientos
Nuestro reconocimiento a Juan Patiño Rodríguez, por su valiosa colaboración tanto en el trabajo de campo como de gabinete. Al Sr. Pedro Medina Granados por su asistencia en el procesamiento de las muestras para histología e inmunohistoquímica. Al Dr. Héctor F. Serrano y a la Dra. Carolina Valdespino, así como a los dos revisores anónimos, nuestro reconocimiento por sus valiosos comentarios y sugerencias para este trabajo. Al Dr. José Arturo Bermúdez, ex-jefe del Laboratorio de Andrología del Hospital "Luis Castelazo Ayala" del IMSS, quien gentilmente nos facilitó los antisueros por él generados. Este trabajo forma parte del Proyecto "Determinación de los Contenidos de Esteroides Sexuales en Dos Especies de Roedores del Género Peromyscus de Dos Parques Nacionales del D. F." CBS, UAMI No.144.03.07 (ASM) y fue parcialmente financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No. 400200-5R29117N, JRP). Los resultados de este trabajo forman parte del convenio Interinstitucional entre el Departamento de Biología de la Reproducción de la UAMI (ASM) y la Coordinación de Investigación del IMSS (JHM).
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