Histopathology of hartweg pine ( Pinus hartwegii Lindl.) innoculated with three ophiosto­matoid fungi

Omar Alejandro Pérez–Vera¹; Elizabeth Cárdenas–Soriano¹; Dionicio Alvarado–Rosales¹;David Cibrián–Tovar³; Armando Equihua–Martínez²

¹ Programa de Fitopatología, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Carretera México–Texcoco, km 36.5, Montecillo, Estado de México, C.P. 56230.

² Programa de Entomología, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Carretera México–Texcoco, km 36.5, Montecillo, Estado de México, C.P. 56230.

³ División de Ciencias Forestales (DICIFO), Universidad Autónoma Chapingo, C. P. 56230. Chapingo, Estado de México. Correo–e: oalejandrovera@ gmail.com

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue identificar las alteraciones histológicas en el pino de las alturas (Pinus hartwegii) causadas por tres especies de hongos ophiostomatoides, por medio de microscopía de luz. En Pinus hartwegii hubo acumulación de resina en la zona de inoculación a los diez días, y el follaje se tornó de amarillo a café rojizo a los 60 días. En las inoculaciones con Leptographium guttulatum y Ophiostoma olivaceapinii se observó que inducen la metabolización de polifenoles, depositándose en las paredes de las células de la corteza, el floema, cambium vascular y en la médula se necrosaron. O. ips causó necrosis más severa en corteza, floema, cambium vascular y médula. En xilema, las hifas de los tres hongos penetran en las traqueidas y avanzan longitudinalmente por las puntuaciones aeroladas y se distribuyen radialmente por células parenquimatosas y radios.

Palabras clave: Manchado azul, galerías, descortezadores, cambios estructurales.

ABSTRACT

The goal of this study was to identify the histological alterations in hartweg pine (Pinushartwegii) caused by three species of ophiostomatoid fungi by means of light microscopy. There was an accumulation of resin in the inoculated zone within 10 days, and foliage of inoculated seedlings turned yellow and reddish–brown at 60 days. With inoculation of Leptographium guttulatum and Ophiostoma olivaceapinii, it was observed that they induce the metabolization of polyphenols, which were deposited on the cell walls of the inner bark, the phloem, vascular cambium and in the pith, where they became necrotic. Compared to L. guttulatum and O. olivaceapini, O. ips caused a more severe necrosis of the inner bark, cambium, and pith. In the xylem of inoculated seedlings, the hyphae of the three different fungi penetrated into the tracheids and moved through the bordered pits and radially through the parenchyma cells in the rays.

Key words : Blue–stain, galleries, bark beetles, structural changes.

INTRODUCCIÓN

El género Ophiostoma H. & P. Sydow causa el manchado azul de la madera y produce pérdidas económicas importantes en bosques de coníferas (Gibbs, forests of conifers (Gibbs, 1993). El hongo se dispersa por insectos descortezadores by bark beetles (Coleoptera: Curculionidea, Scolytinae) que dañan el floema y el cambium vascular de coníferas (Farrell et al., (Farrell et al., 2001); Dendroctonus adjunctus es la plaga descortezadora principal de coníferas en México y transporta esporas de Ophiostoma spp., en los micangios, la hembra de D. adjunctus dispersa las esporas por las galerías sinuosas que produce en el fuste del árbol y contribuye de manera importante a la muerte del árbol en menos de un año por el bloqueo del transporte de sustancias por los sistemas de conducción (Cibrián, 1995). Se ha reportado que en México existen cerca de 15,000 ha de pino atacadas por diferentes especies de descortezadores; de éstas, 3,902.82 ha con 16 especies de pino son atacadas por D. adjunctus, entre éstos el pino de las alturas Pinus hartwegii (CONAFOR, 2007; Cibrián, 1995).

En México se han reportado 17 hongos ophiostomatoides pertenecientes a los órdenes Ophiostomatales y Microascales en coníferas y latifoliadas (Cibrián et al., 2007). Se han realizado pruebas de patogenicidad con Ophiostoma ips en Pinus radiata y P. elliottii (Zhou et al., 2001); P. ponderosa con Ceratocystis minor, C. clavigera y Leptographium terebrantis (Harrington y Cobb, 1983; Owen et al., 1987). Jacobs y Wingfield (2001) reportan a L. wageneri como uno de los que causan la enfermedad de la mancha negra de la raíz en coníferas y L. calophylli como causante de una marchitez en Calophyllum inophyllum, ambos considerados como patógenos. Además consideran algunas especies donde no se ha definido su patogenicidad, como L. serpens, L. terebrantis, L. lundbergii, L. procerum en Pinus sp, pero pueden llegar a causar lesiones en el floema y matar a los árboles con inoculaciones artificiales. Únicamente se han observado cambios histológicos inducidos por Ophiostoma ulmi en Ulmus americana, Prunus pensylvanica y Populus balsamífera (Rioux y Quellette, 1991). Para el caso de México, la información de las enfermedades forestales es escasa y sobre los daños causados por este grupo de hongos manchadores es nula. El objetivo de este estudio fue identificar las alteraciones histológicas en el pino de la alturas Pinus hartwegii causadas por tres especies de hongos ophiostomatoides.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal e inóculo

El material vegetal consistió de 42 árboles de Pinus hartwegii de tres años de edad y de una altura promedio de 30 cm, crecidos en bolsas de polietileno de 8 x 20 cm, obtenidos de la Estación Forestal Experimental Zoquiapan (EFEZ) de la Universidad Autónoma Chapingo, en Zoquiapan, Estado de México, trasladados a invernaderos de la División de Ciencias Forestales (DICIFO) y mantenidos durante 30 días a una temperatura de 26 ± 2 °C como un periodo de acondicionamiento previo a la inoculación.

Los aislamientos se obtuvieron de la colección del laboratorio de Patología Forestal del Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Texcoco, veinte hongos ophiostomatoides puros y se incrementaron en extracto–malta–agar al 2 % (EMA) e incubaron a 25 ± 2 °C durante 15 días. Estos hongos fueron: 10 Ophiostoma ips (ZOQ1, ZOQ3, ZOQ4, ZOQ7, ZOQ10, ZOQ11, ZOQ14, ZOQ18, ZOQ19 y ZOQ20), dos Leptographium guttulatum (ZOQ2 y ZOQ8), tres Ophiostoma olivaceapinii (ZOQ5, ZOQ15, ZOQ17), tres Ophiostoma angusticollis (ZOQ9, ZOQ13, ZOQ16), uno de Ophiostoma nigrocarpum (ZOQ12) y uno Pesotum sp. (ZOQ6). Los aislamientos ZOQ18, ZOQ19 y ZOQ20 provienen del cuerpo del insecto Dendroctonus adjuctus, y el resto de las galerías del descortezador en Pinus hartwegii.

Inoculación de plantas

Preparación de las muestras para microscopia de luz

Con el fin de conocer los daños ocasionados por los hongos inoculados en los árboles, se tomaron de cada árbol tres secciones de tallo de 5 mm de longitud aproximadamente de las partes alta y baja de la zona no inoculada, y la parte media de la zona inoculada a los 60 días después de la inoculación (ddi). Las muestras se fijaron en una solución Craf III durante 48 h. Todas las muestras se lavaron tres veces con agua corriente durante cinco minutos, se deshidrataron gradualmente en soluciones de alcohol de 50, 70, 96, 100 % y etanol absoluto–xileno (1:1) tres cambios de xileno y dos cambios de Paraplast (Sigma Chemical Co.) por tres horas en cada solución en un cambiador automático de tejidos Tissue–Tek® (Sakura Fingtechnical Co., mod. 4640–B). De cada muestra se obtuvieron tres bloques de parafina. Se hicieron cortes en serie de 10 Lim de grosor, tanto longitudinales como transversales, en un micrótomo de rotación (American Optical Company, mod. Spencer 820); los cortes se pegaron a portaobjetos, colocándolos previamente en un baño de flotación con agua a una temperatura de 60 °C más grenetina (Johansen, 1940).

Tinción

Para teñir los cortes se utilizó la tinción diferencial safranina–verde rápido (Johansen, 1940), para lo cual se eliminó primero el paraplast mediante tres cambios de xileno y se hidrataron en una serie gradual de alcohol etílico 100, 96, 70 y 50 % durante tres minutos en cada uno. Luego se tiñó con safranina al 1 % en alcohol etílico al 50 % durante 30 min; posteriormente se lavaron en una serie ascendente de alcohol etílico al 50, 70 y 96 % (3 min en cada uno); después se aplicaron dos a tres gotas de verde rápido al 1 % en alcohol etílico al 96 %, por 45 seg, se decantó el sobrenadante y se lavó con alcohol etílico al 96 y 100 % y tres cambios de xileno (3 min en cada uno). Finalmente, se montaron con resina sintética entre porta y cubreobjetos para su observación y se tomaron fotomicrografías de las preparaciones en un microscopio de luz Romano III (Carl Zeiss^®) con una cámara digital Paxcam 3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Anatomía del tallo sano de Pinus hartwegii

En plantas testigo no inoculadas se observó a la peridermis conformada por una capa externa de células lignificadas, y debajo de ésta de dos a cuatro capas celulares con polifenoles castaños densos y capas de células largas con polifenoles granulosos rojizos con paredes lignificadas. La corteza estuvo compuesta por células parenquimatosas conteniendo polifenoles guindas granulosos o rojizos, amarillos granulosos y densos. Además, presentó canales resiníferos constituidos por células epiteliales con paredes delgadas y las células de la vaina con paredes relativamente gruesas, ambas sin lignificar. Las de la vaina se encontraron llenas de polifenoles rojizos e incluso en las epiteliales. Algunas células de parénquima con escasos granos de almidón (Figura 1A). El floema axial presentó células del parénquima con polifenoles amarillos granulosos y las del parénquima radial con abundantes gránulos de almidón (Figura 1B). Limitando el floema del xilema está el cambium; a veces éste se observa con sus células pequeñas y alineadas uniformemente (Figura 1B). El xilema constituido por traqueidas con punteaduras aeroladas en sección radial, radios uniseriados, canales resiníferos verticales y horizontales con l a capa de células parenquimatosas epiteliales y las células de la vaina, y por lo regular cercanos a los radios. Ningún tipo de células del xilema contiene polifenoles (Figura 1B y C). La médula posee sus células con polifenoles del mismo color y apariencia que los de la corteza (Figura 1C). Las características coincidieron parcialmente con la descripción de Esau (1977); la diferencia puede ser por la edad del árbol.

Anatomía del tallo inoculado de Pinus hartwegii

El manchado oscuro del floema y xilema en Pinus hartwegii que se observa macroscópicamente, es causado por la melanina del hongo (polímero 1,8 dihidroxinaphtaleno) o el ácido 2,3–dihidroxibenzoico y ceratenolone combinado con hierro (Seifert, 1993). Sin embargo, se puede inferir que también es por la metabolización de los polifenoles que normalmente contienen las células que conforman estos tejidos. En la zona de inoculación las ramas de P. hartwegii presentaron lesiones necróticas de 0.8 a 10 mm de longitud, esto dependiendo del aislamiento. En el interior del xilema de las ramas se presentó una coloración café claro a café oscuro. De acuerdo con Zhou et al. (2002), Leptographium lundbergii, L. serpens y Ophiostoma ips causan lesiones de 29.3, 27.8 y 33.3 mm, respectivamente, en Pinus caribeae, P. elliottii y P. radiata de dos años de edad en Sudáfrica sin presentar síntomas a nivel de follaje. Las lesiones necróticas alrededor de la zona de inoculación son el resultado de flujo de resina y la acumulación de compuestos fenólicos para prevenir el avance del hongo hacia el interior de los tejidos (Solheim, 1993).

En la zona de inoculación (parte alta) con Ophiostoma olivaceapinii, las células de la peridermis metabolizaron los polifenoles que contenían en su citoplasma e impregnaron en las paredes (Figura 1D). Los polifenoles de las células de la corteza de igual manera se metabolizaron e impregnaron en las paredes, y ya no se observaron polifenoles granulosos ni densos; posteriormente las células se colapsaron, perdieron su forma y sus paredes sufrieron rompimientos; algunas se hipertrofiaron. El floema y cambium fueron los más dañados; se observaron completamente colapsados sus componentes celulares y en ocasiones necrosados (Figura 1D y E). El xilema aparentemente no sufre daños, excepto los radios y canales resiníferos donde hubo colapso de células por presencia de hifas del hongo (Figura 1E). Las paredes de las células de la médula se observaron rotas e invadidas por el hongo (Figura 1F). Esto coincide con Forde (1995), quien reporta a la especie Ophiostoma piliferum creciendo en células parenquimatosas, ricas en azúcares, triglicéridos y ácidos grados. En la parte media y baja de inoculación se observó también impregnación de polifenoles y colapso o desorganización celular. En las tres partes de la zona inoculada, debido a la fragilidad de las paredes del floema y del cambium, se observa en ocasiones a estos dos tejidos como si estuvieran macerados o con grandes cavidades por la desintegración de las células. En cortes tangenciales no se observó la forma de penetración y avance de Ophiostoma olivaceapinii en el xilema. Sin embargo, los hongos ophiostomatoides invaden las traqueidas a través de las puntuaciones y canales resiníferos distribuyéndose longitudinal y radialmente por células parenquimatosas de la corteza, floema, cambium y radios del xilema (Seifert, 1993; Gibbs, 1993).

En los cortes de la parte alta del tallo de Pinus hartwegii con Leptographium guttulatum se observó que los daños ocasionados en corteza, floema y cambium vascular fueron los mismos que en Ophiostoma olivaceapinii (Figuras 2A y B), excepto los canales resiníferos; éstos sufren necrosis en las células epiteliales; las células de la vaina están totalmente invadidas por hifas café oscuro del hongo (Figura 2B). En el xilema se nota que la infección se mueve radialmente a través de los radios unicelulares, y alcanza los canales resiníferos presentando necrosis (Figura 2B y C). Se observó que el hongo penetra por las puntuaciones y avanza longitudinalmente por las traqueidas, principalmente las cercanas a los radios; esto concuerda con Harrington y Cobb (1983), quienes reportan el avance de Leptographium en traqueidas y radios. En la parte media parece que el daño sólo fue en la zona de inoculación y no abarcó toda la circunferencia del tallo, y se observó impregnación de polifenoles y colapso o desorganización. En la parte baja los daños fueron similares que en la parte alta, y únicamente la médula estuvo más desintegrada (necrosada) y con hifas del hongo (Figura 2D). En un corte transversal del tallo inoculado se observó macroscópicamente una coloración café oscuro en la corteza, floema y xilema, lo que coincide con Jacobs y Wingfield (2001), quienes reportan a L. guttulatum como causante de un manchado de la madera de Picea abies y Pinus sylvestris. En este estudio se observaron alteraciones en los tejidos de P. hartwegii de tres años de edad causadas por L. guttulatum; aunque estos hongos no alteran las propiedades mecánicas en la madera, pueden influir en la pérdida de peso al consumir carbohidratos, ácidos grasos y triglicéridos (Cibrián et al., 2007). Se reporta L. wageneri con sus tres variedades como patógenos verdaderos por causar la pudrición negra de la raíces de Pinus en los Estados Unidos de América (Jacobs y Wingfield, 2001).

Las alteraciones causadas por Ophiostoma ips, obtenido del cuerpo del insecto, se observaron en la zona alta, media y baja de la corteza, floema y cambium, todos bastante colapsados y necrosados; sin embargo, aún se pudo ver el hongo (Figura 2E y F). El xilema poco lignificado, radios y canales resiníferos con necrosis y con el hongo (Figura 2G). Ligera presencia de polifenoles en radios y células del parénquima que rodean a los canales resiníferos. La médula necrosada y las paredes de las células rojizas con micelio del hongo (Figura 2H). En Sudáfrica se reporta a O. ips en Pinus caribeae, P. elliottii, P. radiata de dos años de edad causando lesiones de 30 mm sin presentar síntomas externos a nivel de follaje (Zhou et al., 2002); la mayoría de las especies de Ophiostoma causan un manchado de la madera recién cortada (Seifert, 1993). Las especies reportadas de este género que causan la enfermedad del olmo holandés son: O. ulmi (Buism.) Nannf. y O. novo–ulmi Brasier con dos subespecies, O. novo–ulmi subsp. Americana y O. novo–ulmi subsp. novo ulmi en Ulmus americana (Brasier y Kirk, 2001). Los cambios histológicos observados en Ulmus americana fueron la formación de estructuras alveolares, tilides, geles y zonas de barreras; algunas células exhiben autoflorescencia amarilla alrededor de los vasos del xilema que impide el avance del hongo (Et–Touil, et al., 2005). En Prunus pensylvanica hay formación de burbujas en los miembros del vaso del xilema a los tres días de la inoculación y la formación de geles después de cinco días (Rioux y Quellette, 1991). En Populus balsamífera hay formación de tilides ocho días de la inoculación y acumulación de compuestos fenólicos en las células del parénquima (Rioux y Quellette, 1991). En el caso de Ophiostoma ips se considera un patógeno débil como O. minus, Leptographium terebrantis y L. wingfieldii, que pueden llegar a causar alguna lesión sobre el floema o pueden llegar a matar el árbol cuando son inoculadas en masa (Zhou et al., 2002; Gibbs, 1993).

En este estudio no se observó el inicio de las primeras alteraciones causadas por hongos en los diferentes tejidos, debido a que los síntomas fueron evidentes a los 60 días ddi; generalmente se reporta muerte rápida de células y la acumulación de metabolitos secundarios en el sitio de daño que da como resultado una lesión necrótica (Nagy et al., 2004). Los hongos manchadores al invadir células de sus hospedantes inducen la acumulación de compuestos secundarios; tal es el caso de Pinus sylvestris ,donde hay la presencia de estilbenos (Pinosylvin y éter monometilico pinosylvin) y un flavonoide (pinocembrin) al ser inoculados con Leptographium wingfieldii, Ophiostoma brunneociliatum y O. ips (Croisé et al., 2001). Las alteraciones en Pinus hartwegii fueron: colapso y necrosis como resultado del avance de la infección en corteza, floema, cambium, radios y canales resiníferos hasta la médula; estos resultados concuerdan con Nagy et al. (2004) y Franceschi et al. (2000), quienes además observaron cambios morfológicos e incremento de fenoles en células parenquimatosas en Picea abies en respuesta al daño que causa Ceratocystis polonica. Además, hay reducción de la humedad interna, hidrólisis de almidón, poca adhesión de la corteza, resinosis, traumatismo de los canales resiníferos y la producción de nuevo cambium y peridermis (Nagy et al., 2005).

La acumulación de hifas de los hongos se observó alrededor de los canales resiníferos y radios, ambas constituidas por células parenquimatosas (Forde, 1995). El avance longitudinal de los tres hongos fue por traqueadas, como lo hace Ophiostoma piliferum (Gibbs, 1993), y penetrando a través de sus puntuaciones (Seifert, 1993). Otros autores, como Harrington y Cobb (1983), reportan hifas del hongo Verticicladiella abietina en traqueidas y Verticicladiella procera, V. wageneri, Verticicladiela spp y Leptographium terebrantis en traqueidas y radios del xilema en Pinus ponderosa. Hubert (1953) observó hifas largas café oscuro con anastomosis en xilema, invasión de células del radio y canales resiníferos en Pinus montícola inoculados con Leptographium. Estos estudios sugieren que todos los hongos ophiostomatoides son similares en su crecimiento a través de las células del hospedante. Además, las células parenquimatosas y radios con fenoles son ricas en fenilalanina amonio liasa; ésta es una enzima clave para la síntesis de compuestos fenólicos; estos compuestos llegan a inactivar las enzimas pectolíticas que ayudan a los hongos a penetrar las paredes celulares (Franceschi et al., 2000).

La mayoría de las especies de Ophiostoma y sus anamorfos son patógenos débiles o saprofíticos, y se asocian con insectos descortezadores (Jacobs y Wingfield, 2001). Sin embargo, en este estudio Ophiostoma ips fue la más patogénica en relación a O. olivaceapinii y Leptographium guttulatum en árboles de Pinus hartwegii de tres años de edad. Lieutier et al. (1989) lo consideran como un ascomiceto débil por causar un manchado azul en la madera en coníferas; dentro de esta categoría están O. minus, O. montia, O. penicillatum y O. picea (Seifert 1993). En este estudio O. ips causó necrosis en los tejidos de la corteza, floema, cambium, y en el xilema creció en radios y canales resiníferos llegando a causar la muerte de la planta. Wingfield y Marasas (1980) reportan lesiones en el cambium y xilema en Pinus pinaster de diez años de edad. En general, los tres hongos inoculados penetraron en las punteaduras de las traqueidas y se establecieron en células parenquimatosas de la corteza, floema, cambium, canales resiníferos y radios causando muerte celular en los diferentes tejidos, y a pesar de haber necrosis, el hongo vive, eso debido a que es un hongo con hábitos saprofíticos (Seifert, 1993; Gibbs, 1993).

CONCLUSIONES

LITERATURA CITADA

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