Caracterización fisicoquímica de propóleos colectados en el Bosque La Primavera Zapopan, Jalisco

MPhysical-chemical description of propolis collected in La Primavera forest, Zapopan, Jalisco state

María de Lourdes Delgado Aceves¹, Jesús Ángel Andrade Ortega² y Carlos Alberto Ramírez Barragán²

¹ Licenciatura en Biología, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara.

Recibido 12 de noviembre de 2014.
Aceptado 20 de enero de 2015.

Resumen

El propóleo es un material resinoso producido por las abejas a partir de recursos naturales vegetativos; tiene propiedades antimicrobianas, antifúngicas, antivirales y antiparasitarias, las cuales varían en función de su fuente natural geográfica. El objetivo de este trabajo fue la caracterización fisicoquímica de propóleo y de su extracto etanólico [EEP], de Apis mellifera colectados en la región Zapopan, Jalisco, México. Se obtuvieron extractos etanólicos de propóleo desgrasado [EEPd], que fueron analizados de acuerdo a la Norma Ramal Cubana 932-88. Se determinó la cantidad de flavonoides y fenoles totales, y se obtuvieron sus perfiles espectroscópicos de UV-Vis, fluorescencia y FTIR. Los resultados evidenciaron que el mayor porcentaje en peso se distribuye entre ceras (47 %) y material insoluble en etanol (16 %); sin embargo, el rendimiento del extracto etanólico del propóleo (EEP) fue de 33 %. Se determinó un contenido de fenoles totales de 260 mg equivalentes de ácido gálico por gramo de EEP y 130 mg de flavonoides equivalentes de quercetina por gramo de EEP. Las huellas espectroscópicas de los EEP muestran bandas de absorbancia (UV-Vis) en los mismos intervalos de longitud de onda en los que las presentan los fenoles; en cuanto a la fluorescencia, las señales de los EEP son similares a las de las moléculas del tipo flavonoides. Los espectros FTIR son consistentes con los de la literatura para otros propóleos, lo que significa que se siguió un buen proceso de obtención.

Palabras clave: Bosque La Primavera, composición química, espectroscopia, fenoles, flavonoides, propóleo.

Propolis is a resinous material produced by bees from vegetative natural sources. It has antimicrobial, antiviral and antiparasitic properties, which show variations according to its natural original source and geographic location. The aim of this work was the physicochemical characterization of propolis and its ethanolic extract [EPP] of Apis mellifera collected in Zapopan, Jalisco, Mexico. Ethanolic propolis extracts were obtained from defated propolis [EPPd] according to the Ramal Cubana 932-88 standards. Spectroscopic profiles of UV-Vis, fluorescence and FTIR were obtained. Results show that the main percent by weight is composed for waxes (47 %) and ethanol insoluble material (16 %). The yield of ethanolic extract [EEP] was 33 %. The quantification of phenolics compounds were 260 mg of gallic acid equivalents per gram of EEP (expressed as total phenol content) and 130 mg of flavonoids as quercetin equivalent per gram of EEP. The spectroscopic fingerprints (UV-VIS, fluorescence and FTIR spectra) features of the EEP showed absorbance bands in the same wavelength region described by phenols. In the instance of fluorescence, the EEP signals are similar to those reported for flavonoid type molecules. FTIR spectra are consistent with those published in the literature for other propolis, as an indication of a suitable process used in this work.

Key words: La Primavera forest, chemical composition, spectroscopy, phenols, flavonoids, propolis.

Introducción

El nombre de propóleo proviene del griego propolis, pro "en defensa de" y polis "ciudad"; es decir, en defensa de la ciudad, que en el caso de las abejas se refiere a la colmena. El propóleo es una mezcla de resinas y exudados vegetales recolectados por las abejas (Apis mellifera Linnaeus, 1758), con el fin de sellar herméticamente su colmena e impedir que se forme dentro de ella cualquier tipo de contaminación, ya que actúa como un agente microbicida; por lo anterior se le ha usado de manera amplia y popular como un remedio medicinal desde tiempos remotos (Asís, 1991; Farré et al., 2004; Li-Chang et al., 2005).

Las propiedades antimicrobianas, antifúngicas, antivirales y antiparasitarias que se le atribuyen a este producto, también denominadas como actividad biológica o simplemente bioactividad (Banskota et al., 2001; Choi et al., 2006; Cruz et al., 2008; Vargas et al., 2013) varían en función de la fuente natural geográfica de donde es extraído (fitogeografía) (Catalin et al., 2010; Yaghoubi et al., 2007);y se atribuyen a la presencia de componentes químicos identificados como familias de polifenoles, flavonoides, ácidos fenólicos, etcétera, que pueden llegar a superar los 150 compuestos en un propóleo (Palomino et al., 2010). Entre las moléculas farmacológicamente activas destacan las de tipo flavonoides y ácidos fenólicos con sus ésteres.

En muestras provenientes de países del trópico, que tienen una actividad biológica similar, se han identificado moléculas de terpenoides, derivados prenilados de ácidos r-cumáricos, lignanos y benzofenonaspreniladas (Martínez et al., 2012). En Brasil se han aislado como sus constituyentes principales terpenoides y derivados prenilados de ácidos p-cumáricos (Marcucci, 1995), mientras que en Chile se han detectado, predominantemente, lignanos, y en Venezuela, Brasil y Cuba se hallaron benzofenonaspreniladas (Palomino et al., 2010).

Los propóleos originarios de zonas templadas (oeste de Asia, Europa y América del Norte) poseen una composición química parecida entre ellos en la que sobresalen los fenólicos (flavonoides, ácidos cinámicos y derivados).

Lamentablemente, pocos estudios han sido desarrollados con propóleos mexicanos (Lotti et al., 2010), pero es evidente que todo lo anterior sugiere que su actividad biológica se debe a la combinación y sinergias de los diferentes compuestos que contiene.

En trabajos recientes se han incorporado métodos analíticos a los ya tradicionalmente usados (FTIR, absorbancia UV-Vis y cromatografía); tal es el caso de la espectroscopía infrarroja visible/cercana (Vis/NIR), fluorescencia, espectroscopía Raman y resonancia magnética nuclear (RMN) (Cruz et al., 2008; Peña, 2008). Se asume que cambios espectrales de un propóleo analizado están directamente ligados a una modificación en la su composición química. Debido a la variedad de especies de árboles de las que las abejas recolectan el propóleo, cada región produce mezclas complejas de compuestos que a su vez producen espectros únicos, los cuales se consideran como "huellas digitales" individuales (Hacura, 2006; Yan-Wen et al., 2008; Cai et al., 2012).

El objetivo del presente trabajo fue la caracterización fisicoquímica de propóleo y de su extracto etanólico [EEP] recolectado en la región Zapopan, Jalisco, México, por Apis mellifera, mediante la determinación de la humedad, cenizas, ceras y extraíbles en etanol; con técnicas analíticas espectrofotométricas se cuantificó el contenido de fenoles totales, flavonoides y se obtuvieron las huellas espectrales (UV-Vis, fluorescencia y FTIR). Cabe destacar que estos son los primeros datos descriptivos de un propóleo en la región de estudio.

Materiales y Métodos

Sitio de estudio y obtención de propóleos

Los propóleos se obtuvieron de abejas melíferas africanizadas en el apiario del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CUCBA) de la Universidad de Guadalajara, localizado en el km 15.5 de la carretera Guadalajara-Nogales, en el predio Las Agujas, Nextipac, municipio Zapopan, Jalisco, México; de acuerdo a las coordenadas: 20°44'50.3" de latitud norte y 103°30'43.6" de longitud oeste y una altitud de 1 662 m.

Las muestras se recolectaron en el otoño, de septiembre a noviembre de 2013, por el método de malla plástica. La vegetación predominante alrededor del apiario incluye especies arbóreas: Quercus resinosa Liebm., Q. magnoliifolia Née, Q. castanea Née, Clethra rosei Britton, Arbutus xalapensis Kunth, Pinus oocarpa Schiede ex Schltdl., P. devoniana Lindl., P. douglasiana Martínez, P. lumholtzii B. L. Rob. & Fernald, P. luzmariae Pérez de la Rosa y Arbutus glandulosa Mart. & Galleotti. El material se almacenó en refrigeración (2 °C) y ausencia de luz durante 72 h.

Propiedades fisicoquímicas.

Los análisis se realizaron por triplicado. Los métodos utilizados correspondieron a los de la Norma Ramal Cubana 932-88 (Asís, 1991), cuyo uso obedece a la correspondencia de latitudes de la región de estudio, lo que hace suponer que se trata de composiciones similares. Al extracto etanólico de los propóleos (EEP) se le identificó el contenido de polifenoles y flavonoides y se aplicó espectrofotemetría de UV-Vis, fluorescencia e infrarrojo (FTIR). Las pruebas fisicoquímicas realizadas fueron las siguientes:

Humedad. Se calculó de forma termogravimétrica; se secaron 0.5 g de muestra en estufa (Felisa FE-292AD) a 105 ± 2 °C hasta llegar a un peso constante.

Índice de oxidación. Se realizó de acuerdo con la metodología de Salamanca et al. (2007) y Asís (1991). El método se basa en el tiempo que demora en decolorar una solución de permanganato de potasio por la acción reductora del propóleo en medio ácido, con modificaciones: se pesaron 0.2 g de propóleo en un frasco ámbar con tapa; enseguida se le adicionaron 3 mL de etanol (96 %) y se le dejó en agitación por 48 h a 25 °C. La mezcla obtenida se pasó lentamente a través de un papel filtro. A continuación, se tomó 1 mL del filtrado y se diluyó con agua destilada hasta 25 mL en un matraz aforado. De esta disolución se vertieron 0.5 mL a un tubo de ensayo, se le agregaron 0.5 mL de agua destilada y 1 mL de H₂SO₄ al 20 %, y se agitó durante 1 min; después de ese lapso se añadieron 50 μL de solución de KMnO₄ (0.1 N).

Cera. Se determinó por gravimetría (diferencia de masas) entre una muestra original y el residuo obtenido mediante una extracción con hexano (40-60 °C) en un equipo Soxhlet, durante 8 h.

Material insoluble en etanol. Se pesó 1 gramo de propóleo desgrasado, y se le añadieron 10 mL de alcohol etílico (96 %); se dejó 24 h en agitación, al término se filtró a vacío en papel Whatman Núm. 41; el residuo sólido remanente se secó a temperatura ambiente en desecador de vidrio hasta peso constante, que corresponde al material insoluble en etanol.

Extraíbles en etanol. Basado en la descripción metodológica anterior, la diferencia de masa entre la muestra original y el material insoluble en etanol se denomina "extraíbles en etanol".

Obtención de los extractos. Se pesaron 5 g de propóleo desgrasado, los cuales se sometieron a extracción exhaustiva en agitación con etanol de 96 % (1 g 10 mL^-1) durante 24 h, a temperatura ambiente y en ausencia de luz. Después se usó vacío para la filtración con papel filtro Whatman Núm. 41; la fracción sólida se colocó en cajas de Petri que se mantuvieron en desecador hasta alcanzar un peso constante, con el propósito de conocer el rendimiento. La fracción etanólica se sometió a un proceso de evaporación al vacío y temperatura de 40 °C, hasta el punto de sequedad. La resina resultante (EEPd) fue envasada en viales ámbar y refrigerada a -12 °C hasta su posterior utilización. De la misma forma se produjo el extracto de propóleo en crudo (sin desgrasado, EEPo).

Preparación de las soluciones de extractos etanólicos de propóleo (EEP). Se pesaron 0.33 g de EEP (tanto desgrasado como sin desgrasar) y se disolvieron en 10 mL de etanol.

Determinación cuantitativa de fenoles totales y flavonoides

El contenido de fenoles totales en el extracto fue determinado por el método de Folin Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965), con ácido gálico como estándar de referencia; se graficaron curvas de calibración (100, 200, 300 y 400 ppm) y se leyó la absorbancia a 760 nm; el contenido de flavonoides totales se cuantificó por el método del AlCl₃(Woisky y Salatino, 1998), con quercetina como estándar de referencia (40, 60, 80 100 y 120 ppm) y se registró la absorbancia a 420 nm; en ambos casos se usó un espectrofotómetro Ocean Optics USB 4000 y etanol al 96 % como blanco.

Espectroscopía UV-Vis. A partir de las soluciones de extracto etanólico (EEP) se hicieron diluciones en etanol al 96 % y enseguida se produjeron los perfiles de absorbancia en UV-Vis, mediante un equipo Ocean Optics USB 4000 en un intervalo de 200 a 450 nm.

Espectrofluorescencia. Se procedió de igual forma y con las mismas soluciones que en la espectroscopia UV-Vis, para establecer los perfiles de fluorescencia, solo que las lecturas se llevaron a cabo en un intervalo de 400 a 650 nm con un equipo Ocean Optics USB 2000 FL.

Espectroscopía FTIR. Se lograron los espectros de FTIR de soluciones de propóleo desgrasado (EEPd), las cuales se prepararon a partir de la disolución de 1 g en 10 mL de etanol. Estos análisis se efectuaron en un equipo Perkin Elmer modelo Spectrum GX^® con aditamento de cristal de diamante, en un intervalo de 700 a 4 000 cm^-1.

En todos los análisis espectroscópicos también se obtuvieron los espectros de los compuestos usados como estándares para la determinación de fenoles totales y flavonoides: ácido gálico (SAG), quercetina (SQ) y una mezcla de ambas (MAGQ).

Resultados y Discusión

La evaluación fisicoquímica, contenido de fenoles totales y flavonoides del propóleo y de su extracto etanólico se presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Caracterización del propóleo de estudio y su comparación con valores estandarizados. ]]> Table 1. Description of the studied propolis and its comparison with standard values.

*Las cenizas se consideran dentro de impurezas mecánicas.
**Dentro de extraíbles con etanol.
*Ashes are considered within the mechanical impurities
**Within extractables with ethanol

Los valores porcentuales de cenizas y humedad (2.5 % y 4.0 %, respectivamente) se consideran adecuados debido a que un valor superior a 5 % de cenizas estaría asociado a un mayor contenido de metales, incluso algunos que resultan nocivos, como el plomo; en cuanto al contenido de humedad, un porcentaje superior a 10 % sería indicativo de ocurrencia de posibles fermentaciones, lo que genera productos no deseados o contaminantes, que pueden ser tóxicos y perjudiciales para la salud (Palomino et al., 2010).

La cantidad de cera presente en el propóleo resultó alta (47 %), y posiblemente esté influenciado por múltiples factores: la época del año en que se recolectó, por una mala manipulación del apicultor, o por la especie de abeja que llevó a cabo la recolección (Arrate, 2008; Londoño et al., 2008; Martínez et al., 2012). Un gran contenido de ceras en muestras de propóleos crudos es desfavorable, porque en esta fracción no están los compuestos fenólicos, los cuales se asocian con la actividad biológica (Cupull et al., 2013).

Además del contenido de ceras, otro parámetro que incide notablemente en la calidad del propóleo son las resinas solubles en etanol, ya que cuanto mayor sea el valor de esta fracción, mejor será el producto final, debido a que es en ella donde están los compuestos de interés. En el caso particular del estudio que se documenta, el valor de 33 % resulta favorable, si se considera el contenido de ceras determinado. Adicionalmente, el material insoluble es un elemento que no contiene los principios activos y su elevada presencia deprecia el producto (Arrate, 2008). En el propóleo analizado, este parámetro fue de 16 %; es decir, casi no contiene impurezas mecánicas, y se ubica 50 % por debajo de lo establecido en la norma Ramal Cubana 932-88 (Asís, 1991).

Una determinación rápida de la capacidad antioxidante (asociada a la actividad biológica del propóleo) es el índice de oxidación. Los resultados para esta prueba fueron en promedio de siete segundos, número que representa un buen indicador de la presencia de compuestos de naturaleza fenólica, o con grupos funcionales oxidables (Palomino et al., 2010), ya que la norma de Ramal Cubana (Asís, 1991) establece 22 segundos como máximo.

Al referirse a estos compuestos, en términos porcentuales respecto al propóleo bruto, hay 8.6 % de fenoles totales, cantidad que parece ser baja; sin embargo, el contenido de flavonoides es de 4.3 %; por lo que su proporción dentro de los fenoles totales es de 50 %, valor relevante e importante debido a las propiedades a las que se asocian esas moléculas.

Espectroscopía UV-Vis

Dado que se emplean tanto el ácido gálico, como la quercetina en la determinación del contenido en el propóleo de fenoles y flavonoides (moléculas bioactivas), respectivamente (Cai et al., 2012), se obtuvieron las huellas espectrales de absorbancia para las moléculas puras, así como una mezcla de las (Figura 1a). En el caso de SAG se distinguen las señales características registradas por Hernández et al. (2013) a 220 y 267 nm (221 y 267 en la solución del estudio); en la SQ también se aprecian señales previamente establecidas por Dimarco et al. (2012) que se ubican en 260 y 375 nm (255 y 376 en el estudio). Además, se evidencian un par de señales más a 210 y 230 nm. Al analizar la mezcla de las soluciones estándar, se obtuvo el espectro de la MAGQ que, si se observa con atención, es el resultado de la suma de las señales de los espectros de los estándares individuales; en la zona de los 200 a los 300 nm los picos de la quercetina son apantallados por la mayor absorbancia del ácido gálico.

Figura 1. Espectros de absorbancia: a) comparación entre solución estándar de ácido gálico (SAG), solución estándar de quercetina (SQ) y mezcla (MAGQ). b) Extractos etanólicos de propóleo (EEPo y EEPd) y MAGQ.
Figure 1. Absorbance spectra: a) comparison between the standard solution of Gallic acid (SAG), the standard solution of quercetin (SQ) and mixture (MAGQ); b) Ethanolic extracts of propolis (EEPo and EEPd) and MAGQ.

La Figura 1b muestra el espectro de absorbancia de los EEPo y EEPd que presentan dos señales características y distintivas: a 211 y 292 nm; las distintas intensidades entre EEPo y EEPd se asocian a la diferencia en el contenido de ceras y grasas que fueron removidas en el caso del EEPd; por ello, el comportamiento de la absorbancia es casi el mismo para ambos EEP, lo que parece estar regido, básicamente, por el contenido de compuestos fenólicos totales, esto obedece a las señales a 211 nm para ambos EEP muy cerca de la que presenta MAGQ a los 223 nm, mientras que la señal a los 292 nm aparece desplazada a la derecha, con respecto al de la MAGQ que está a 262 nm y lejos (hacia la izquierda) de la de 373 nm. Esa tendencia (dos señales) en los EEP es atípica en comparación con espectros de absorbancia de otros propóleos, pues la mayoría tiene una sola señal entre 200 y 230 nm o bien una amplia curva de 210 a 300 nm (Samara et al., 2011; Bedascarrasbure et al., 2004).

Espectrofluorometría

Figura 2. Espectros de intensidad de fluorescencia: a) comparación entre solución estándar de ácido gálico (SAG), solución estándar de quercetina (SQ) y mezcla (MAGQ). b) Extractos etanólicos de propóleo (EEPo y EEPd) y MAGQ.
Figure 2. Fluorescence intensity spectra: a) comparison between the standard solution of Gallic acid (SAG), the standard solution of quercetin (SQ) and mixture (MAGQ); b) Ethanolic extracts of propolis (EEPo and EEPd) and MAGQ.
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Los espectros de fluorescencia para EEPo y EEPd son similares entre sí (Figura 2b), con señales de máxima intensidad a 540 y 535 nm, independientemente de si está desgrasado o no el EEP; además, dicho valor coincide con la máxima intensidad de fluorescencia para SAG, SQ y MAGQ que es de 535 nm. Por tendencia e intensidad, parece que se analizan flavonoides por su similitud al espectro de SQ.

Espectroscopía FTIR

Se generaron espectros de infrarrojo con el objetivo de identificar los principales grupos funcionales y enlaces de los componentes en el propóleo obtenido (EEPd). En la Figura 3 se observan los espectros de infrarrojo en transmitancia para la muestra EEPd y su comparación con ácido gálico y quercetina.

Figura 3. Espectros de FTIR de A) propóleo desgrasado (EEPd), B) ácido gálico (SAG) y C) quercetina (SQ).
Figure 3. FTIR spectra of: A) lean propolis (EEPd), B) Gallic acid (SAG) and C) quercetin (SQ).

Como se aprecia, las principales señales se corresponden entre sí, tan solo con ligeros desplazamientos, lo cual es factible que se relacione con la presencia de diferentes tipos de fenoles en el extracto EEPd, mientras que las señales del espectro de ácido gálico son solo de uno de ellos en particular. Lo anterior también se advierte con mayor detalle en el Cuadro 2, en el que se ofrece un resumen de las principales señales para fenoles y flavonoides, y es fácil visualizar que la mayoría de las señales características de los fenoles se corresponden con las obtenidas para el extracto EEPd.

Cuadro 2. Principales señales de FTIR para el extracto (EPPd) y su comparación con los de la literatura (Yan-Wen et al., 2008).
Table 2. Main FTIR signals for the extract (EPPd) and its comparison with those in literature (Yan-Wen et al., 2008).

Algo similar ocurre con la comparación entre los espectros de EEPd y la quercetina (Figura 3), en la que prácticamente todas las señales existen, tanto en SQ como en el extracto, de modo parecida tan solo con ligeros desplazamientos, los cuales has sido ya registrados por algunos autores para este tipo de muestras (Yan-Wen et al., 2008). De forma análoga (Cuadro 2), hay alta correspondencia de las señales de la muestra analizada en el laboratorio (EEPd) con las dadas a conocer por diversos autores (Yan-Wen et al., 2008; Cai et al., 2012) para fenoles y flavonoides; lo cual se puede considerar como un fuerte indicativo de la presencia de los dos compuestos en el extracto, y se explica porque las señales características principales para ambos son vibración y flexión a 1 450 cm^-1 (para este estudio, 1 450-1 455 cm^-1), de vibración y flexión a 1 369 cm^-1 (en el presente trabajo, 1 380 cm^-1) y de vibración, alargamiento y flexión a 1 088 cm^-1 (para el caso analizado, 1 087 cm^-1). La señal a 880 cm^-1 está asociada a alcoholes primarios y secundarios y específicamente en el etanol se da un estiramiento simétrico a 880-881 cm^-1 (para este estudio, 800 cm^-1), en respuesta a que los extractos están disueltos en etanol.

Los espectros de infrarrojo obtenidos para la muestra EPPd se considera como una "huella digital" del propóleo estudiado. Ha sido consignado por otros autores (Zimnicka y Hacura, 2006; Shang, 2011) que la composición de los propóleos pueden variar con el área y la estación del año en los que se recolectan.

Conclusiones

El estudio que se presenta constituye la primera descripción fisicoquímica de propóleo procedente del Bosque La Primavera, en el que la muestra analizada presenta características ubicadas dentro de los parámetros establecidos en la norma Ramal Cubana 932-88, en función de los cuales se considera que tiene un gran potencial para desempeñar actividad biológica y, por lo tanto, tener aplicaciones en el área de la salud.

Los espectros obtenidos sugieren que el perfil UV-Vis es atípico, ya que tiene dos señales particulares y diferenciadas; resultados más asociado a la existencia y concentración de fenoles totales. El perfil de fluorescencia evidencia compuestos con anillos conjugados y gran cantidad de dobles enlaces, como los que se observan en las moléculas tipo flavonoide, los cuales poseen un espectro de emisión fluorescente único. En cuanto al análisis mediante FTIR, los espectros revelaron prácticamente la totalidad de las señales representativas de los grupos químicos correspondientes a fenoles y flavonoides, indicador de la presencia de dichos compuestos en el propóleo estudiado.

Conflicto de intereses

Los autores declaramos no tener conflicto de intereses.

Contribución por autor

Agradecimientos

Los autores desean expresar al Mtro. Rafael Ordaz Briseño por las facilidades otorgadas en el muestreo de propóleo en el apiario del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CUCBA) de la Universidad de Guadalajara.

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