Micropropagación de Turbinicarpus knuthianus (boed.) John & Riha cactácea ornamental del Desierto Chihuahuense, en estatus de riesgo

Micropropagation of Turbinicarpus knuthianus (Boed.) John & Riha, ornamental cactus of the Chihuahuan Desert, at risk status

Eulalia Edith Villavicencio Gutiérrez¹*, Areli González Cortes², Alberto Arredondo Gómez³, Leobardo Iracheta Donjuan⁴, Sofía Comparan Sánchez⁵ y Rebeca Casique Valdés⁵

¹ Campo Experimental Saltillo. CIRNE-INIFAP. *Correo-e: villavicencio.edith@inifap.gob.mx

² Centro de Capacitación de Tecnología de Granos y Semillas. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro.

⁴ Campo Experimental Rosario Izapa. CIRPAS-INIFAP.

⁵ Departamento. Botánica. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro.

Fecha de recepción: 28 de junio de 2011
Fecha de aceptación: 24 de julio de 2011

RESUMEN

Se desarrolló un protocolo en cuatro etapas para la micropropagación de Turbinicarpus knuthianus , una cactácea en estatus de riesgo, para la obtención de plantas de maceta con tamaño comercial uniforme, en cantidades suficientes y con calidad fitosanitaria. El método de propagación propuesto es eficiente comparado con el tradicional; es una nueva tecnología de producción factible de aplicarse en el sistema-producto ornamental, bajo el esquema de laboratorio-invernadero. Las semillas de esta especie son quiescentes y pueden establecerse in vitro en el medio MS al 50%, adicionado con 8.65 mM de AG_3, con un porcentaje de germinación de 75%. La inducción de brotes se logró a partir de segmentos de hipocotilo, como explantes, en medio de cultivo MS con diferentes tratamientos. Se determinó que el tipo y concentración de fitohormona influyen en la tasa de multiplicación, y generan hasta 10 brotes por explante; la cinetina (KIN) en interacción 10:1 con AIB en baja concentración es la promotora de este efecto. Durante la aclimatación se observó que la aplicación de 1.5 x 10⁶ UFC ml-1 de Azospirillum brasilense tiene un efecto positivo en el proceso rizogénico, de tal manera que se forman hasta 6 raíces por planta con 2.5 cm de longitud. Con esta metodología es posible regenerar especies en estatus de riesgo de importancia ecológica para el Desierto Chihuahuense y se optimizan los procesos biológicos para la producción de plantas de ornato.

Palabras clave: BA-N6-benzyladenina, cactáceas, inoculación de Azospirillum brasilense , medio Murashige y Skoog, micropropagación, Turbinicarpus knuthianus .

ABSTRACT

A four stage protocol was developed for the micropropagation of Turbinicarpus knuthianus , an ornamental cactus in risk status, in order to produce plants with standard commercial-sized pots in sufficient amount and good phytosanitary quality. The method here described is efficient compared to the traditional method of propagation; it is a new production technology that can be applied to the ornamental product system under the laboratory-greenhouse scheme. The seeds of this species are quiescent and can be established in vitro on MS medium at 50% supplemented with 8.65 2M of GA³, with 75% of germination. The induction of shoots and seedlings was obtained by setting segments of explants on MS medium with different treatments. It was determined that the type and concentration of phytohormone affect the multiplication rate and produce as much as 10 shoots/explant; kinetin (KIN) in interaction with AIB 10:1 in low concentrations favors this effect. During the acclimatization stage, it was observed that the application of 1.5 x10⁶ CFU ml-1 of Azospirillum brasilense promoted a positive reaction of the rhizogenic process, as much as 6 roots 2.5 cm long per plant were formed. With this technology, species of ecological importance in risk status can be restored to the Chihuahuan Desert and the biological processes for the production of ornamental plants can be optimized.

Key words: BA-N6-benzyladenine, cacti, inoculation of Azospirillum brasilense , Murashige and Skoog medium, micropropagation, Turbinicarpus knuthianus.

INTRODUCCIÓN

Turbinicarpus knuthianus (Boed.) John & Riha, comúnmente llamada "biznaguita" o "biznaga cono invertido de Knuth", es una cactácea pequeña de 6 cm de diámetro, con tallo esférico, color verde oscuro con espinas agrupadas en aréolas; presenta flores vistosas muy numerosas de 25 mm de longitud de color carmín rosado brillante. Por su morfología y aspecto es apreciada por coleccionistas expertos y aficionados nacionales y extranjeros, quienes la utilizan como planta de ornato (Hunt et al ., 2006).

Sus poblaciones naturales se distribuyen en el estado de San Luis Potosí, que forma parte del Desierto Chihuahuense, donde presentan un alto grado de deterioro. Son plantas consideradas endémicas, de lento crecimiento y escasas en su hábitat natural, sujetas a protección especial (Pr), ya que están amenazadas por factores que inciden negativamente en su viabilidad; por lo tanto, es necesario propiciar su recuperación y conservación (SEMARNAT, 2010).

Dado que la flora del país es parte del patrimonio nacional y que es prioritaria su regeneración, sobre todo de aquellas especies con estatus de riesgo, la micropropagación constituye una forma de conservación ex situ, a partir del grado de deterioro que tienen sus poblaciones naturales y el interés que existe por algunos taxa como plantas de ornato, en países europeos y asiáticos.

Los métodos de conservación ex situ se basan en el mantenimiento del material biológico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro y en colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botánicos). Los dos primeros son de los sistemas más convenientes para el germoplasma, porque permiten almacenar una gran variabilidad genética en forma económica y práctica; sin embargo, en especies como T. knuthianus, cuyas poblaciones son no son de alta densidad y tienen una reducida producción de semillas y de brotes laterales, además de un bajo porcentaje de germinación, es necesario implementar opciones de conservación ex situ como el cultivo de tejidos vegetales (CTV), con el propósito de multiplicarlo, puesto que cuenta con pocos individuos y tiene dificultades para propagarse por métodos convencionales (Villavicencio et al., 2005).

En cactáceas los brotes se obtienen de yemas axilares que se desarrollan in vitro; estas estructuras están contenidas en areolas o mamilas y su procedencia pueden ser segmentos de plantas de vivero (Vyskot y Jara, 1984; Escobar, 1985; Yassen-Mohamed et. al., 1995), campo (Clayton et al ., 1990) y de plántulas germinadas in vitro (Fay y Gratton , 1992).

Algunos autores señalan que en el cultivo de yemas axilares aún existen varias incógnitas por resolver; sin embargo, este método de clonación resulta eficiente en especies útiles como es el caso de T. knuthianus (Rodríguez-Garay y Rubluo, 1992; Hubstenberger et al ., 1992).

Dada la importancia ecológica y económica que tiene este recurso fitogenético para las zonas semiáridas del desierto Chihuahuense y para el sector ornamental se desarrolló un protocolo para su micropropagación, en el que también se consideró el efecto que produce el inoculante de Azospirillum brasilense, por ser una bacteria que incide en el proceso rizogénico, como se ha comprobado en Triticum aestivum L., Zea mays L. y en plantas propagadas in vitro como; jojoba, caña de azúcar, papa y mandioca (Carletti et al., 2003; Díaz-Zorita et al ., 2004; Okon, 1985).

MATERIALES Y MÉTODOS

Material genético

Se utilizaron semillas de una colecta masal de poblaciones naturales ubicadas en los municipios de Guadalcázar, Cerritos y Villa Hidalgo en el estado de San Luis Potosí. En cada localidad se hizo una caracterización del medio físico, que incluyó: la altitud, precipitación, temperatura, textura del suelo, pendiente, orientación de la pendiente y vegetación asociada (Figura 1, Cuadro 1).

Etapa 1. Establecimiento de semillas en un cultivo aséptico

Se evaluó la germinación in vitro de T. knuthianus mediante un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2 x 2, en el cual se consideró como factor A: dos tipos de medio (MBG1= 0.6% agar + 87.64 mM de C₁₂H₂₂O₁₁ y MBG2= MS (Murashige y Skoog, 1962) al 50%. El factor B consistió en dos tratamientos: sin C1= 0.0 mM de AG₃ y con aplicación de ácido giberélico, C2= 8.65 mM de AG₃ adicionado al medio de cultivo como promotor de la germinación. Se usaron semillas de una colecta masal, desinfectadas de acuerdo al protocolo de Villavicencio e t al. (2009), con 60 días de colecta, para 30 semillas y tres repeticiones por tratamiento. Las evaluaciones se realizaron cada siete días, durante un período de nueve semanas, las variables consideradas fueron la velocidad (VG) y el porcentaje de germinación (PG).

Etapa 2. Multiplicación o inducción de brotes

Mediante un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2X6 se establecieron segmentos de hipocotilo, obtenido de las plántulas germinadas in vitro, en un medio para la inducción de brotes (MIB), el cual se adicionó con una relación citocinina-auxina 10:1. El factor A correspondió a los dos tipos de fitohormona (F); cinetina 6-furfuryl aminopurina (Kin) y 6-bencil aminopurina (BA). Como factor B se evaluaron seis concentraciones (C) de estas citocininas (T1=0.46, T2=0.69, T3=1.16, T4=2.32, T5=3.48 y T6=4.64 mM de Kin) y (T1=0.44, T2=0.66, T3=1.10, T4=2.21, T5=3.30 y T6=4.40 mM de BA), combinadas con su proporción correspondiente de auxina (T1=0.41, T2= 0.61, T3=1.03, T4=2.07, T5=3.1 y T6=4.13 x 10^-1 μM de AIB), así mismo se incluyó un tratamiento sin fitohormonas. Como unidad experimental se establecieron tres explantes por frasco con 10 repeticiones por tratamiento. A las ocho semanas se registró el número de brotes (NB) y la altura (A) de los mismos, en mm.

Condiciones de incubación.- En el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo del CIRNE-INIFAP se hicieron las dos primeras etapas anteriores. Las semillas se colocaron en tubos Erlenmeyer, con un volumen de 5 mL de medio de cultivo. Las plántulas se subcultivaron en frascos Gerber^(g) de 70 mL de capacidad, con un volumen de 20 mL de medio de cultivo. Los subcultivos en la etapa de multiplicación se llevaron a cabo en envases de polipropileno de 500 mL con un volumen de 50mL de medio de cultivo, que se incubaron a una temperatura de 26 ± 1°C y con un fotoperíodo de 16 h luz^-1.

Etapa 3. Enraizamiento y aclimatación

En el invernadero del Campo Experimental Saltillo del CIRNE-INIFAP se establecieron vitro-plantas del 10 mm de altura, mediante un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 4 X 2, con tres repeticiones por tratamiento. El factor A consistió en los cuatro tipos de sustratos (S): S1=arena; S2= "peat moss"; S3= negra y S4= mezcla homogénea de las tres anteriores y el factor B en la inoculación de la cepa de Azospirillum brasilense en dos concentraciones: CONC1= 1.5x10⁶ y CONC 2= 3x10⁷ UFC/ mL-¹. Además se contó con un testigo por tipo de sustrato, sin aplicación de la cepa. Las aplicaciones del concentrado de la cepa se realizaron cada siete días, con evaluaciones a los 30 días; las variables consideradas fueron: incremento en altura del tallo (IAT), longitud de raíces (LR) y número de raíces (NR).

RESULTADOS Y DISCUSION

Etapa 1. Establecimiento de semillas en un cultivo aséptico

Porcentaje de germinación (PG). Se obtuvieron diferencias significativas de la interacción MBGxC, con un efecto positivo en proporciones diferentes, al adicionar el promotor de la germinación, el tratamiento MBG2= MS (Murashige y Skoog, 1962) al 50% + 8.65 mM de AG₃ del que resultó un PG=75%, mismo que duplicó la emergencia de las vitro-plántulas, con respecto al medio MBG1= 0.6% agar + 87.64 mM C₁₂H₂₂O₁₁ + 8.65 mM de AG₃. Esto muestra que en condiciones in vitro T. knuthianus requiere de la adicción de nutrimentos y fitohormonas para promover la imbibición, absorción de oxigeno, activación de enzimas, el transporte de moléculas hidrolizadas hasta el ápice meristemático y con ello activar el proceso de respiración, división celular y alargamiento para el crecimiento de la vitro-plántula.

Con el potencial osmótico presente en el medio MBG4= 0.6% agar+87.64 mM de C₁₂H₂₂O₁₁ se determinó un PG del 10%, lo que muestra que la semilla es viable, quiescente y que su estructura permite la imbibición, hidratación de los tejidos y la digestión pero no así la translocación y división celular para la emergencia de la vitro-plántula.

De acuerdo con Maiti et al . (1994) especies con semillas de este tipo tienen una testa delgada y sólo requieren de condiciones ambientales favorables para que su germinación, ya que existe una fuerte relación entre la ultraestructura de la semilla y el proceso germinativo, en el cual influye el medio de cultivo que se utilice como lo refieren Dutra et al. , 2008; Kauth et al., 2006 y Malda et al., 1999.

La modificación al medio de cultivo in vitro se ha realizado en otras cactáceas ( Mammillaria elongata DC. , Selenicereus megalanthus (K. Schum. ex Vaupel) Moran y Hylocereus undatus (Haw.) Britton et Rose para favorecer el metabolismo celular de la semilla, activar el crecimiento del embrión y el proceso enzimático de los tegumentos, para que la cubierta de la semilla se rompa y emerja una nueva vitro-plántula (Papafotiou et al ., 2001; Pelah et al., 2002) (Figura 2).

Etapa 2. Multiplicación o inducción de brotes

Existen diferencias significativas ( P ≤ 0.05) entre el tipo de fitohormonas (F) utilizadas para la inducción de brotes; con la cinetina (Kin) se obtuvo la mejor respuesta, con un NB promedio de 6.0 brotes por explante con una altura (A) de 6.0 mm, a diferencia de los explantes establecidos en BA, los cuales registraron 30% menor cantidad de brotes con una altura de 5 mm en promedio (cuadros 2 y 3).

Al comparar este efecto con el tratamiento sin fitohormonas se comprobó que de forma endógena T. knuthianus es capaz de producir brotes; sin embargo, su regeneración es baja (2.33 brotes por explante) (Cuadro 3).

Después de analizar los tratamientos como efectos independientes con la prueba de medias ( P ≤ 0.05), se determinó que el tratamiento T12 tiene un efecto positivo en la inducción de brotes, hasta 10 brotes por explante en el medio MIB adicionado con 4.40 mM de BA + 4.13 x μM de AIB. Lo anterior contrasta con el tratamiento T2, en el cual se obtuvieron 9 brotes por explante en un MIB con una baja concentración de Kin 0.46 mM de Kin + 0.61 μM de AIB. Los resultados muestran que la concentración de citosina-auxina en una relación 10:1 es positiva para la inducción de brotes; aunque su efecto depende del tipo de fitohormona que se utilice. A diferencia de lo sucedido con el tratamiento sin fitohormona, en el que se tuvo el menor número de brotes.

La interacción citosina-auxina ha sido efectiva en la organogénesis directa de 21 especies de cactáceas mexicanas, como lo refieren Pérez et al . (1998) y Mata et al . (2001), entre ellas las del género Turbinicarpus, cuando se utilizaron de 8.8-13.31 mM de BA y 0-2.6 μM de ANA en medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962).

Altura de brotes (A). Se registraron diferencias significativas entre los tratamientos con y sin fitohormona, éste último presentó la mayor altura de brotes (8.22 mm), a diferencia de los tratamientos con fitohormonas, mismos que registraron un valor estadísticamente igual a 6 mm, cuando se utilizo cinetina (KIN) (Cuadro 4, Figura 4).

Al analizar el efecto del tipo de fitohormona se observó que la altura de los brotes se reduce al aumentar su número de explantes, como sucedió en los tratamientos T2 y T12, con 4 y 3 mm, respectivamente (Cuadro 4).

Un efecto opuesto se obtuvo cuando se utilizó BA, en los que el número y altura de los brotes se incrementa conforme se aumenta la concentración de la citocinina, de tal manera que con la concentración entre 0.66 a 3.3 mM de BA el número máximo de brotes por explante fue de cuatro con una altura superior a 5 mm; sin embargo, con la concentración más alta (4.40 mM de BA), la tasa de multiplicación es más del doble, pero los brotes son de menor tamaño (3 mm en promedio) (Cuadro 4). Algo similar se presentó en Mammillaria sanangelensis Sánchez-Mej., cuando se utilizó una concentración alta de fitohormona (4.4 mM de BAP + 0.53 μM de ANA), la cual indujo la generación de 21 brotes por explante, con una altura menor a 3 mm (Martínez-Vázquez y Rubluo, 1989).

Con base en los resultados aquí documentados se puede decir que el control hormonal influye en la diferenciación del explante como lo refieren Mauseth (1976, 1979), y se demuestra que la regeneración de brotes in vitro de T. knuthianus es posible inducirla a partir de yemas axilares; así mismo, la eficiencia del método de propagación se expresa en el número de brotes por explante (Vyskot y Jara, 1984; Martínez-Vázquez y Rubluo, 1989; Clayton et al ., 1990 y Dabekaussen et al. , 1991).

También se determinó que la micropropagación de T. knuthianus ocurre si al medio de cultivo (MIB) se le agregan fitohormonas, ya que sus yemas axilares presentan letargo, con meristemos axilares quiescentes con potencial mitótico activo en cada una de sus zonas (a) célula madre central; b) zona periférica y c) meristemo), en donde es posible desarrollar primordios fotosintéticamente normales, llamados brotes, tal como lo describió Mauseth (1976, 1978, 1979), quien fue el primero en evaluar este efecto en cactáceas.

La tasa de multiplicación de T. knuthianus es exponencial y varía dependiendo de la fitohormona que se utilice, siempre que se mantenga una relación 1:8:8:8; del medio de cultivo (MIB) adicionado con 0.69 mM de Kin + 0.61 μM de AIB. Los valores para esta variable fueron superiores al citado por Dávila et al. (2005) y Clayton et al . (1990) en Escobaria missouriensis (Sweet) D.R. Hunt , Pediocactus paradinei B. W. Benson y Toumeya papyracantha (Engelm) Britton et Rose, cuya tasa de multiplicación máxima fue de 6.0 brotes por explante.

En el caso de la cactácea estudiada la máxima tasa de multiplicación en relación de 1:10:10:10 se obtiene in vitro en un medio de cultivo MIB con 4.4 mM de BA+ 0.413 μM (relación 1:10:10:10). Esta cifra es semejante a la que se ha registrado en especies de los géneros: Coryphantha, Echinocereus y Mammillaria (Clayton et al ., 1990) y en Astrophytum myriostigma Lem. ( Villavicencio et al., 2006; 2009)., pero que supera a la consignada en otras especies de cactáceas mexicanas como Mammillaria voburnensis Scheer y Mammillaria elongata DC. (Ordóñez, 2003; Papafotiou et al. , 2001).

Etapa 3 enraizamiento y aclimatación

Incremento en altura del tallo (IAT). En las tres primeras fechas de aplicación se determinaron diferencias altamente significativas ( P ≤ 0.05) entre los efectos independientes S y CONC, de tal manera que, al final de la evaluación, el IAT fue estadísticamente igual en los tres primeros sustratos evaluados (S1=arena, S2= peat moss y S3= negra), con un IAT de 17 mm, superior al de las plantas aclimatadas en el sustrato S4. Se obtuvo un efecto positivo con la interacción SxCONC, cuando se inoculó la cepa de Azospirillum brasilense en baja concentración (CONC1=1.5x10⁶ UFC/ ml-1) , y los tres sustratos referidos superan en IAT al resto de los tratamientos. Al final del proceso de aclimatación se tuvieron plantas entre 4 y 7 cm de altura con un 95% de sobrevivencia; con ello se demuestra que la concentración de unidades formadoras de colonias (UFC) influye positivamente en el aumento de IAT, a diferencia de sus homólogos, los testigo, en donde los que los IAT resultaron estadísticamente igual y menor a 2 mm (cuadros 5 y 6).

Número de raíces (NR). Se obtuvo un efecto igual al descrito para el IAT con los tres sustratos usados. En promedio 4 raíces por planta, con la misma concentración de unidades formadoras de colonias (UFC) (cuadros 5 y 6). Los resultados duplican en NR a los observados con sus tratamientos homólogos, pero sin la aplicación de la cepa, lo que muestra que T. knuthianus tiene niveles endógenos de auxinas que le permiten inducir el proceso rizogénico, como lo citado para Capsicum chinese Jacquin, con una concentración similar (CONC1=1.5x10⁶ UFC ml^-1) (Canto et al. , 2004) (Cuadro 7); sin embargo son relativamente bajos comparados con los de otras especies ( Camellia sinensis (L.) Kuntze) según Tomasz et al. (2006).

Al analizar los tratamientos como efectos independientes, el tratamiento T2 en la prueba de medias (Tukey ∞ 0.05) resultó significativo, con un valor máximo de 6 raíces por planta, mientras que T1 y T3 fueron estadísticamente iguales con 5 raíces por planta, y duplican el número de raíces, con respecto a los tratamientos homólogos sin la aplicación de la cepa, cuyo número de raíces no fue mayor a 2 por planta, lo que confirma que la especie tiene niveles endógenos de auxinas (Canto et al., 2004) (Cuadro 8, Figura 5).

De acuerdo a Kapulnik et al. (1985), la aplicación de 10⁷ UFC mL^-1 incide en el número y longitud de total de raíz, en tanto que la inoculación de 10⁸ UFC mL^-1 causa la inhibición de desarrollo. El efecto rizogénico es similar al consignado por otros autores; al trabajar con Pachycereus pringlei (S. Watson) Britton et Rose, la concentración de 1.5 x10⁶ UFC L^-1 de Azospirillum spp. inoculado a un suelo pobre de áreas desérticas, incrementa la materia vegetativa hasta un 60% y el largo de las raíces en un 100%. Para el caso de T. knuthianus se determinó que la bacteria invadió el sistema radical del cactus, durante los primeros 30 días de aclimatación considerando este tiempo como un período de adaptación (Pacovsky et al., 1985; Puente y Bashan, 1993).

Supervivencia. El crecimiento ex vitro es autotrófico, y no heterotrófico como en condiciones in vitro , por lo que es necesario reconstruir y desarrollar procesos y estructuras adaptativos como lignificación, cubiertas cuticulares, estomas y órganos fotosintéticos para que las plantas tengan un desarrollo autónomo, mismo que ocurre durante la aclimatación. Al respecto, se obtuvieron diferencias significativas entre sustratos con y sin inoculación de la cepa; las plantas que fueron aclimatadas con la interacción de la cepa registraron una supervivencia mayor al 91%, independientemente del tipo de sustrato, mientras que sus homólogos sin la cepa sólo alcanzaron un valor promedio de 72 %, y el tratamiento T10 presentó mayor contenido de humedad lo cual provocó un incremento en la pudrición de las plantas (Cuadro 8 y Figura 6). Trinidad (2005) cita el mismo efecto en T. knuthianus con un porcentaje bajo de supervivencia (60%).

A pesar de que se trata de un sustrato estéril comúnmente usado en plantas ornamentales de tallo suculento, los resultados muestran que para la especie de interés es poco recomendable, ya que sus requerimientos de humedad son bajos. T. knuthianus es una planta propia de condiciones semiáridas, por lo que se propone utilizar un sustrato poroso como lo refieren Johnson y Emino (1979 b). Los tratamientos T1 y T5 tuvieron un efecto positivo en la aclimatación, si se inocula con una cepa rizogénica, en ambos casos se observó una sobrevivencia estadísticamente igual (90%).

Estos resultados muestran la capacidad que tienen las plantas cultivadas in vitro para controlar la pérdida de agua a través de la activación de sus estomas (Santamaría et al. , 1995; Santamaría, 1996), y que el comportamiento morfo-fisiológico y la bioquímica de las plántulas aclimatadas dependen de las condiciones hetero-mixotróficas a las que están expuestas durante este proceso.

CONCLUSIONES

En especies con un número reducido de semillas, como es el caso de T. knuthianus, la perdida de plántulas limita su regeneración en condiciones controladas, por lo que la selección del medio de cultivo es importante en la etapa de establecimiento, dado que su efecto se refleja en las siguientes fases de la micropropagación.

La micropropagación es un método factible para regenerar especies de cactáceas, involucra cuatro etapas en las cuales se pueden producir vitroplantas de tamaño uniforme y con buena calidad fitosanitaria. Mediante el cultivo de tejidos vegetales y el uso de microorganismos promotores del crecimiento de las plantas, se pueden optimizar procesos biológicos de este tipo de especies de importancia ecológica y económica.

El uso de rizobacterias es una alternativa exitosa para la aclimatación de T. knuthianus , ya que mantiene la fertilidad del suelo, sin causar contaminación ambiental.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su reconocimiento al fondo sectorial CONAFOR-CONACYT por el financiamiento del proyecto CO3-10569, así como a la Fundación Produce Coahuila A. C. y al SNICS-SINAREFI por el apoyo que dio origen al presente trabajo. También se agradece a los Comisariados ejidales y productores de los diferentes municipios de San Luís Potosí por su colaboración y facilidades brindadas para los trabajos de campo.

REFERENCIAS

Araya E., L. Gómez, N. Hidalgo y R. Valverde. 2000. Efecto de la luz y del acido giberélico sobre la germinación in vitro de jaul ( Alnus acuminatay ) Agronomia Costarricense 24(1): 75-80.         [ Links ]

Burdman S., Y. Okon and E. Jurkevitch. 2000. Surface characteristics of Azospirillum brasilense in relation to cell aggregation and attachment to plant roots. Crit. Rev. Microbiol. Vol 26:91-110.         [ Links ]

Canto M., J. C., S. Medina P. y D. Morales A. 2004. Efecto de la inoculación con Azospirillum sp en plantas de chile Habanero ( Capsicum chinese Jacquin). Tropical and Subtropical Agroecosystems 4(1): 21-27.         [ Links ]

Carletti S., M., E. Rodríguez C. A. y E. Llorente B. 2003. Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal en la micropropagación de plantas. In : Albanesi, A., A. Anriquez, S. Luna, C. Kunst y R. Ledesma (Eds.). Microbiología Agrícola. Un aporte de la investigación Argentina. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Ciudad Santiago del Estero, Argentina. pp. 119-129.         [ Links ]

Clayton, P. W., J. F. Hubstenberger and G. Phillips C. 1990. Micropropagation of members of the Cactaceae subtribe Cactinae. J. Amer. Soc. Hor. Sci. 115(2):337-343.         [ Links ]

Dabekaussen, M. A. A., R. L. M. Pierik, J. D. Van der Laken and J. Hoek Spaans. 1991. Factors affecting areole activation in vitro in the cactus Sulcorebutia alba. Rausch. Sci. Hort. 46:283-294.         [ Links ]

Dávila, F. C. A., De La Rosa, C. M. L., Pére, M. B. 2005. In vitro propagation of eight species or subspecies of Turbinicarpus (Cactaceae). In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 41: 540-545.         [ Links ]

De La Rosa-Ibarra M, García H. 1994. Estimulación de la germinación de cinco especies de cactáceas consideradas en peligro de extinción. Phyton-Int. J. Exp. Bot. 56: 147-150.         [ Links ]

De la Vega, B. y R. Alizaga, 1987. Efecto del ácido giberélico y del preenfriamiento sobre la ruptura del reposo en semillas de salvia. Agronomía Costarricense. 11(1): 89-95.         [ Links ]

Díaz-Zorita, M., R. Ballina, M. Fernández C., C. Penna and A. Perticari A. 2004. Field inoculation of wheat ( Triticum aestivum L.) and corn ( Zea mays L.) with Azospirillum brasilense in the Pampas region, Argentina. 22nd Latin American Conference on Rhizobiology. Brasil. Journal of Soil Biology 45: 28-35.         [ Links ]

Dutra D., R. Timothy J., P. J. Kauth, L. Scott S., M. E. Kane and L. Richardson 2008. Asymbiotic seed germination, in vitro seedling development, and greenhouse acclimatization of the threatened terrestrial orchid Bletia purpurea . Plant Cell Tiss Organ Cult. 94: 11-21.         [ Links ]

Escobar H., A. 1985. Micropropagación y almacenamiento in vitro de Opuntia amyclaea Tenore. Tesis de Maestría en Ciencias. Colegio de Postgraduados. Montecillo, Edo. de México. México. 80 p.         [ Links ]

Fay, M. F. and J. Gratton. 1992. Tissue culture of cacti and other succulents: a literature review and a report on micropropagation at Kew. Bradleya. 10: 33-48.         [ Links ]

Giusti, P., D. Vitti, F. Fiocchetti, G. Colla, F. Saccardo and M. Tucci. 2002. In vitro propagation of three endangered cactus species. Scientia Horticulturae 95(4): 319-332.         [ Links ]

Hubstenberger J. F. P., W. Clayton and G. Phillips C. 1992. Micropropagation of Cacti (Cactaceae) IV. Biotechnology in Agriculture and Forestry 20:49-68.         [ Links ]

Hunt, D., N. Taylor and G. Charles (Eds.) 2006. The New Cactus Lexicon. Descriptions and illustrations of the cactus family. International Cactaceae Systematic Group. DH Books. UK. Vol. I, 375 p.         [ Links ]

Johnson J. L. and E. Emino R. 1979a. Tissue culture propagation of cacti. Cact. Succ. J. (US) 51: 275-277.         [ Links ]

Johnson J. L. and E. Emino R. 1979b. In vitro propagation of Mammillaria elongata . Hort Science 14(5): 605-606.         [ Links ]

Kapulnik Y., Y. Okon and Y. Henis. 1985. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation. Can. J. Microbiol. 31:881-887.         [ Links ]

Kauth ,J. P., A. Wagner V. and E. Michael K.2006. In vitro seed culture and seedling development of Calopogon tuberosus. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 85(1): 91-102.         [ Links ]

Maiti R., K., P. Hernández J. L. and M. Valdez M. 1994. Seed ultraestructure and germination of some species of Cactaceae. Phyton No. 55 pp. 97-105.         [ Links ]

Malda, G., H. Suzan and R. Backhaus. 1999. In vitro culture as a potential method for the conservation of endangered plants possessing crassulacean acid metabolism. Sci Hortic 81(1):71-87.         [ Links ]

Martínez V. , O. and A. Rubluo. 1989. In vitro mass propagation of the near-extinct Mammillaria san- angelensis Sánchez-Mejorada. J. Hort. Sci. 61(1):99-105.         [ Links ]

Mata, R. M., M. Monroy-De La Rosa, K. M. Goldammer and V.M Chávez-Ávila. 2001. Micropropagation of Turbinicarpus laui Glass et Foster, an endemic and endangered species. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 37: 400-404.         [ Links ]

Mauseth, D. J. 1976. Cytokinin and gibberellic acid-induced effects on the structure and metabolism of shoot apical meristems In : Opuntia polyacantha (cactaceae). Amer. J. Bot. 63 (10): 1295-1301.         [ Links ]

Mauseth, D., J. 1978. An investigation of the phylogenetic and ontogenetic variability of shoot apical meristems in the Cactaceae. Amer. J. Bot. 65(3): 326-333.         [ Links ]

Mauseth, D. J. 1979. A new method for the propagation of cacti: sterile culture of axillary buds. Cact. and Succ. J. (51): 186-187.         [ Links ]

Moebius-Goldammer K., M. Goldammer, R. Mata M. and V. Chávez M. 2003. Organogenesis and somatic embryogenesis in Ariocarpus kotschoubeyanus (Lem.) K. Schum. (Cactaceae), an endemic and endangered Mexican species. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 39(4): 388-393.         [ Links ]

Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays with tobacco cultures. Physiol. Plant 15: 473-497-         [ Links ]

Murashige, T. 1974. Plant propagation through tissue cultures. Ann. Rev. Plant Physiol. 25: 135-166.         [ Links ]

Okon, Y. 1985. Azospirillum as a potential inoculant for agriculture. Tends in Biotechnology. pp. 223-228.         [ Links ]

Okon, Y. and C. A. Labandera-González. 1994. Agronomic applications of Azospirillum : an evaluation of 20 years worldwide field inoculation. Soil Biol. Biochem. 26:1591-1601.         [ Links ]

Ordóñez M., M. A.2003. Propagación in vitro de Mammillaria voburnensis Scheer. (Cactaceae) Universidad de San Carlos de Guatemala. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Guatemala, Guatemala. 70 p.         [ Links ]

Pacovsky, R. S., E. A. Paul and G. J. Bethlenfalvay. 1985. Nutrition of sorghum plants fertilized with nitrogen or inoculated with Azospirillum brasilense. Plant Soil 85:145-148.         [ Links ]

Papafotiou M., G. Balotis N., T. Panayiota L. and J. Chronopoulos. 2001. In vitro plant regeneration of Mammillaria elongata normal and cristate forms. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 65: 163-167, 2001.         [ Links ]

Pelah D., R. Kaushik A., Y. Mizrahi and Y. Sitrit. 2002 Organogenesis in the vine cactus Selenicereus megalanthus using thidiazuron. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 71: 81-84, 2002.         [ Links ]

Pérez, M. B., E. Villalobos, E. Meza E., L. R., Morones and J. Lizalde, 1998. Propagation of 21 species of Mexican cacto by axillary proliferation. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 34: 131-135.         [ Links ]

Pierik, R. L. M.1987. In vitro culture of higher plants Martinus Nijhoff Publishers. Boston, MA USA. pp. 54-82        [ Links ]

Puente, M. E. and Y. Bashan. 1993. Effect of inoculation with A. brasilense strains on the germination and seedlings growth of the giant columnar Cardon cactus (Pachycereus pringlei ). Symbiosis, 15:49-60.         [ Links ]

Rodríguez, G. B. and A. Rubluo. 1992. In vitro morphogenetic responses of the endangered cactus Aztekium ritteri (Boedeker). Cact. Succ. J. 64 (3):116-119.         [ Links ]

Rojas A., M. 2008. Efecto del ácido giberélico en la germinación de cuatro especies del género Mammillaria del Valle de Tehuacán-Cuicatlán, México. Bol. Soc. Latin. Carib, Cact. Suc. 5(1), 21-23        [ Links ]

Santamaría, J. M., W. J. Davies, and C. J. Atkinson. 1993. Stomata of micropropagated delphinium plants respond to ABA, CO₂, light and water potential, but fail to close fully. Journal of Experimental Botany. Vol. 44. (258) pp. 99- 107.         [ Links ]

Santamaría, J. M., J. L. Herrera and M. L. Robert. 1995. Stomatal physiology of micropropagated CAM plant: Agave tequilana (Weber). Plant Growth Regulation. 16: 211- 214.         [ Links ]

Debe decir: Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT). 2010. Norma Oficial Mexicana NOM-059-ECOL-2010. Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales. Anexo Normativo II. http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicaciones normas/rec_nat/no_059a2g.html. (4/marzo/2011).         [ Links ]

Statistical Analysis System (SAS). 2002. SAS/STAT user's guide. Release 10.0 ed. SAS Inst. Inc., Cary, NC. USA. 1,028 p.         [ Links ]

Tomasz P., W., M. Hamerska and M. Wróblewska. 2006. Organogenesis of vegetative shoots from in vitro cultured flower buds of Mammillaria albicoma (Cactaceae). Plant Cell Tiss Organ Cult 87:27-32        [ Links ]

Trinidad G., R. 2005. Multiplicación in vitro de Astrophytum myriostigma Lem. y Turbinicarpus knuthianus Boed. y aclimatación de éstas especies y T. lophophoroides Werd. Tesis Licenciatura. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. División de Agronomía. Buenavista Saltillo, Coah., México. 85 p.         [ Links ]

Villalobos A., V. y M. Thorpe. 1985. La micropropagación: conceptos, metodología y resultados. In: Fundamentos y Aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura. W. Roca CIAT. Bogotá, Colombia. pp. 67-85.         [ Links ]

Villavicencio G., E. E., A. Cano P. y I. H. Almeyda L. y M. A. Arellano G. 2006. Nueva técnica para la producción comercial del bonete o birrete de obispo ( Astrophytum myriostigma Lem.) Cactacea ornamental del desierto Chihuahuense. INIFAP-CIRNE. Campo Experimental Saltillo. Folleto para productores Núm. 12. ISBN 970-43-0118-9 Coahuila, México. 10 p.         [ Links ]

Villavicencio G., E. E., A. Cano P. y A. Juárez S. 2009. Micropropagación producción de plantas del bonete o birrete de obispo, cactácea ornamental amenazada de extinción del desierto Chihuahuense. Campo Experimental Saltillo. INIFAP-CIRNE. Folleto Técnico Núm 39. ISBN 978-607-425-130-2 Coahuila, México. 42 p.         [ Links ]

Villavicencio G., E. E., A. Arredondo G., M. A. Carranza P., O. Mares A., S. Comparan S. y A. González C. 2010 Cactáceas ornamentales del desierto Chihuahuense que se distribuyen en Coahuila, San Luis Potosí y Nuevo León, México. Libro Técnico No. 2 ISBN: 978-607-425-473-0 Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP, Saltillo Coahuila, México. 345 p.         [ Links ]

Vyskot, B. and Z. Jara. 1984. Clonal propagation of cacti through axillary buds in vitro. J. Hort. Sci. 59(3): 449-452.         [ Links ]

Yassen-Mohamed, Y., S. Barringer A., W. Splittstoesser E. and R. J. Schnell. 1995. Rapid propagation of tuna ( Opuntia ficus indica ) and plant establishment in soil. Plant Cell Tissue and Organ Culture 42:117-119.         [ Links ]