Caracterización molecular y producción de aceites esenciales de diferentes genotipos de orégano (Lippia sp.)

Molecular description and essential oil production of (Lippia sp.) genotypes

Norma Patricia Cazares Alonso ¹, Eulalia Edith Villavicencio Gutiérrez ², Julia Verde Star¹ , Víctor Pecina Quintero ³ e Isidro Humberto Almeyda León ⁴

¹ Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo León.

³ Campo Experimental Bajío, Centro de Investigación Regional Centro (CIRCE), INIFAP.

⁴ Campo Experimental General Terán, Centro de Investigación Regional Noreste (CIRNE), INIFAP.

Fecha de recepción: 09 de octubre de 2008
Fecha de aceptación: 12 de mayo de 2010

Resumen

Con el fin de conservar y aprovechar los recursos genéticos de las zonas áridas y semiáridas de México se realizó la caracterización molecular de 35 genotipos silvestres y seis cultivados de orégano, los cuales se recolectaron en los municipios de Parras de la Fuente, Ramos Arizpe, General Cepeda y Matamoros, del estado de Coahuila. En el análisis se utilizaron marcadores tipo RAPD (ADN Polimórfico Amplificado al Azar, por sus siglas en inglés) y SSR (Sencillas Secuencias Repetidas). Además, se determinó la cantidad y calidad de los aceites esenciales mediante la técnica de arrastre por vapor y cromatografía líquida de alta resolución. Los marcadores RAPD y SSR permitieron detectar un alto nivel de polimorfismos en el orégano. Sin embargo, no se logró diferenciar el total de las recolectas evaluadas y tampoco fue posible agruparlas por su ubicación geográfica. En contraste, la diversidad genética fue moderada (47%) y mayor entre poblaciones. Algunas muestras presentaron valores altos en la producción de carvacrol; mientras que los porcentajes de timol resultaron muy heterogéneos entre las poblaciones muestreadas. Se concluye que existe variación suficiente en el orégano del sureste del estado de Coahuila y es posible seleccionar aquellos con potencial para incrementar la producción de aceites esenciales.

Palabras clave: Aceites esenciales, carvacrol, orégano, RAPD, SSR, timol.

Abstract

In order to preserve and use the genetic resources of the arid and semi-arid and arid lands of Mexico, 35 wild and 6 cultivated samples of Lippia sp. (oregano) from General Cepeda, Ramos Arizpe, Parras de la Fuente and Matamoros in Coahuila State were analyzed. The molecular description was made through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Simple Sequences Repeated (SSR). In addition, the quantity and quality of essential oils was determined by means of the drag technique by steam and high resolution liquid chromatography. RAPD and SSR markers were able to detect a high level of polymorphism in oregano. However, it was not possible to differentiate the whole assessed collections as well as to gather them in regard to location. In contrast, it was determined that the genetic diversity was mild (47%) and higher among populations. Some samples showed high values of carvacrol while thymol was very heterogeneous among populations. It is concluded that there is enough variation in the oregano from Southeast Coahuila and it is feasible to select those materials that can increase the essential oil production.

Key words: Essential oils, carvacrol, oregano, RAPD, SSR, thymol.

INTRODUCCIÓN

Lippia graveolens HBK. (orégano) es una especie forestal no maderable que se desarrolla en las zonas áridas y semiáridas de México. Por sus características aromáticas es referida comercialmente en el mercado internacional como orégano mexicano (Infoagro, 2006). Es una planta aromática perenne de tipo arbustivo de la que se obtiene, a nivel nacional, una producción anual de hoja seca de 6,500 ton, de ellas 90% se destina al mercado de exportación. El principal producto derivado de la hoja de esta planta es el aceite esencial, el cual tiene usos en las industrias de alimentos procesados, licoreras, refresqueras, farmacéuticas y cosmetológicas.

Al igual que la hoja seca, el principal mercado del aceite esencial son los Estados Unidos de América, Italia y Japón (Gaby et al, 2003). Este último se vende a un precio promedio de 170 dólares el litro, en función de su calidad, la cual se mide por la presencia de carvacrol y timol (Dagne, 2001; Licón, 2003). En un estudio comparativo entre el orégano de Grecia y Turquía con el de México (L. graveolens y L. berlandieri Schauer), se demostró que el producto mexicano es superior por su contenido de aceites esenciales y características aromáticas (Martínez et al., 2003).

Las perspectivas económicas de este recurso, a través de su proceso agroindustrial, son muy promisorias siempre y cuando se garantice una producción uniforme, tanto en calidad como en cantidad (Huerta, 2002 y 2005). En la región semiárida de Coahuila, el aprovechamiento de L. graveolens se realiza en ocho municipios de la región centro y sureste del estado; sin embargo, los municipios de Parras de la Fuente, General Cepeda y Ramos Arizpe son las localidades donde la recolecta es mayor (INAFED, 2005; Villavicencio et al., 2007).

La colecta y caracterización de genotipos de orégano, es de primordial importancia para la conservación y explotación de la diversidad genética de ésta y otras especies de las zonas áridas y semiáridas del país. Además, la selección de genotipos con alto potencial productivo puede mejorar la economía y promover la sustentabilidad de los recursos en dichas áreas.

Las técnicas moleculares más destacadas son las basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR); las cuales amplifican secuencias específicas o al azar del ADN y requieren pequeñas cantidades del mismo (Litt y Lutty 1989). Los objetivos del presente trabajo fueron caracterizar a nivel molecular germoplasma silvestre y cultivado de orégano colectado en el estado de Coahuila y establecer su relación con la producción de aceites esenciales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material genético.- En el sureste de Coahuila se realizó un estudio agroecológico de orégano ,que incluyó los municipios de General Cepeda, Parras de la Fuente y Ramos Arizpe. Se consideraron aspectos del medio físico tales como: precipitación, temperatura, pendiente, orientación de la pendiente, textura, fase física y química del suelo, así como la vegetación asociada. Aspectos morfológicos de la planta: altura, cobertura del arbusto y rendimiento (Figura 1).

En las localidades de los municipios referidos, mediante un muestreo sistemático, se recolectaron muestras de hoja de los arbustos "aprovechables", mismos que presentaron una altura y diámetro de copa superior a 50 cm. También se obtuvieron muestras de una plantación comercial en la localidad de La Laguna, que pertenece al municipio de Matamoros, Coahuila, para un total de 41 materiales diferentes (Cuadro 1).

Extracción de ADN.- Se utilizó la metodología descrita por Almeyda et al. (2001), que consiste en triturar 200 mg de tejido en nitrógeno líquido. A la muestra macerada se le agrega una solución de extracción 2-ME/CTAB precalentada a 65°C (2% p/v CTAB, 100 mM Tris - HCl pH 8.0, 20 m MEDTA pH 8.0, 1.4 M NaCl, 1% p/v polivinipirrolidona 40,000), con ß mercaptoetanol a una concentración final de 0.2% y se incuba durante 30 minutos a 65°C. Posteriormente, se adiciona un volumen (p/v con base en el peso del tejido inicial) de cloroformo y centrifugar a 10,000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Se recupera la fase acuosa (superior); se le incorpora 1 volumen de cloroformo y se centrifuga a 10,000 rpm, durante 5 min a temperatura ambiente.

La fase acuosa se recupera y agrega medio volumen de acetato de amonio (7.5 M), dejar por 10 min en hielo para después centrifugar por 10 min a 14,000 rpm, a temperatura ambiente. La precipitación de los ácidos nucleicos se obtiene cuando al volumen recuperado se le agregan 0.7 volúmenes de isopropanol, se mantiene 45 min a temperatura ambiente y después se centrifuga a 10,000 rpm por 15 min. Se elimina el sobrenadante y el precipitado se lava con etanol frío al 70%, se seca a temperatura ambiente y resuspende en 150 μL de agua mQ estéril para su posterior almacenamiento a 4°C, hasta su uso.

Reacción RAPD.- Se evaluaron 40 iniciadores con diferente contenido de Guanina-Citosina (G-C) como nucleótidos selectivos, finalmente, con base en el número de fragmentos amplificados y la reproducibilidad de los patrones electroforéticos obtenidos se eligió el iniciador 2-60% (5'-GTGCGATCTC-3') para evaluar todos los materiales colectados. Las reacciones se realizaron en un volumen final de 25 μL compuesto por: 2 μL de ADN (50 ng), 2.5 μL de solución amortiguadora (1X), 1 μL de MgCl₂ (2mM), 2 μL de DNTP's (200 μM), 0.5 μL de Taq ADN polimerasa (2.5 U), 2 μL de cada iniciador (0.5 μM) y se aforó a 25 μL con agua mQ estéril. Las condiciones de temperaturas para la reacción de PCR fueron: un ciclo de 3 min a 94°C, 30 ciclos de 1 min de desnaturalización a 94°C, 2 min de alineación a 37°C, 1 min de polimerización a 72°C y un ciclo de extensión final a 72°C por 7 min.

Reacción SSR.- Se evaluaron seis pares de iniciadores (Ashkenazi et al., 2000; Ghislain et al, 2000). Con base en el número de fragmentos amplificados y la reproducibilidad de los patrones electroforéticos obtenidos, se seleccionó el par M5F/M6R (5'-AACATTACAACACATTAGCA-3' y 5'-AACTTATCTGAAACTCTCT-3'). Las reacciones se conformaron en un volumen final de 25 μL compuesto por: 2.5 μl de solución amortiguadora (1X), 2 μL de MgCl₂ (2mM), 2 μL de DNTP's (200 μM), 0.5 μL de Taq ADN polimerasa (2.5 U), 2 μL de cada iniciador (0.5 μM) y se aforó a 25 μL con agua mQ estéril. Las condiciones de temperaturas se establecieron en: un ciclo de 3 min a 94°C, 30 ciclos de 1 min de desnaturalización a 94°C, 2 min de alineamiento a 47°C, 1.5 min de polimerización a 72°C y un ciclo de extensión final de 5 min a 72°C. Las muestras se fraccionaron por electroforésis en geles de poliacrilamida al 6% y se tiñeron con nitrato de plata y bromuro de etidio, para su análisis.

Se utilizó la formula de Powell et. al. (1996) para calcular el índice de diversidad genética de la población en general. Con la información generada se llevó a cabo un análisis de varianza y un análisis de componentes principales (ACP), para lo cual se utilizó el software INFO-GEN (Balzarini y Di Rienzo, 2004). La determinación de las diferencias genéticas entre las poblaciones, se estimó con el índice de contenido polimórfico (PIC) (Botstein et al, 1980).

Extracción y calidad del aceite.- Para estimar la producción de aceite del material vegetal procedente de todas las localidades, se usaron hojas de diversos estratos de ''plantas aprovechables" que presentaron la misma madurez fisiológica y que se cosecharon en la misma época (verano). La extracción del aceite esencial, se hizo por la técnica de destilación por arrastre de vapor, de acuerdo a la Norma AOAC (1990); para ello se colocaron en un matraz de fondo plano 10 g de muestra y 75 mL de agua destilada, calentándose a temperatura constante por un lapso de dos horas. El aceite se separó de la fase acuosa, se recolectó y se conservó en refrigeración.

Las diluciones de los aceites (1:10) se analizaron con la técnica de cromatografía líquida de alta resolución y acetonitrilo como diluyente. De cada una se colocaron 20 2°L en el cromatógrafo, por un tiempo de 30 min bajo las siguientes condiciones: presión de 160 bar; λ= 254 nm y flujo = 1.7 mL min^-1; fase móvil = 60% agua + 40% acetonitrilo. Con las áreas cromatográficas generadas de cada muestra, se obtuvo la concentración en miligramos de timol y carvacrol mediante la fórmula:

y = 29693x - 26052

r² = 09168

x = y + 26052 / 29693

Donde:

]]> y = área o superficie obtenida en el cromatograma

x = concentración en mg de timol o carvacrol

r² = coeficiente de determinación, que por su valor representa baja dispersión de valores.

RESULTADOS

Análisis RAPD

La técnica RAPD diferenció 15 de los 41 materiales de orégano incluidos en este trabajo. El dendrograma que muestra las relaciones entre genotipos conformó cuatro grupos distintivos (Figura 2).

El grupo A es el más homogéneo con 46% del germoplasma analizado, con distancias genéticas que varían de 0.03 a 0.12; además, sus integrantes presentaron los menores contenidos de aceites esenciales. En los materiales agrupados en B y C se obtuvo la mayor producción de esos compuestos, lo anterior se refleja en los valores promedios de estos dos grupos (Cuadro 2). El grupo D se formó con dos genotipos, SU y SI2, los que destacaron por el alto porcentaje de carvacrol; ambos pertenecientes a la localidad de San Isidro. También se observaron tres genotipos completamente divergentes con el resto de los materiales evaluados, dos de ellos muy similares entre sí (NA2, LA2) (Cuadro 2). Los valores más grandes de carvacrol se determinaron en las colectas: LA2, SAU4, SR1, BO1, BO3, BO4, BO5, 4M1, 4M5, SI2 y SI4, la mayoría de ellas ubicadas en los grupos A y C. Los materiales con porcentajes superiores de timol fueron: LA2, LA5, LA6, SAU1, SAU2, SAU5, IND1, IND3, IND4, NA1, SR4, BO1, BO2, 4M3, 4M4 y SI4. De igual manera que en la producción de carvacrol, la mayor proporción de los materiales con registros sobresalientes de timol pertenecieron a los grupos A y C.

Análisis SSR

La técnica de microsatélites diferenció 21 recolectas de orégano en 10 grupos de acuerdo al dendrograma generado (Figura 3). El promedio más alto en la producción de aceite se observó en el grupo I (BO3, BO4, BO5 y BO6) (Cuadro 3); en tanto que para el carvacrol, correspondieron a los grupos F y G, los dos con un solo material; por esa razón sus valores promedios resultaron superiores a los grupos A, B, C e I, que incluyen genotipos con alta producción de carvacrol, como es el caso de la colecta SI2 del grupo A, cuyo porcentaje fue de 8.66. Se determinó una banda de 100 pb en los materiales SR1, SR3, SI3, 4M5, con rendimientos de 6.2 a 7.6 mL de carvacrol.

El análisis conjunto de los resultados de las dos técnicas de amplificación de ADN generó un tercer dendrograma, con seis grupos; pero se mantuvo la estrecha relación observada entre los materiales, con los dos métodos por separado. Al igual que con la técnica RAPD, se distinguieron tres genotipos completamente divergentes con el resto de las muestras evaluadas, dos de ellas muy similares entre sí (NA2, LA2) (Figura 4); razón por la cual ambas pueden pertenecer a una misma recolecta.

En términos generales, los ejidos Boquillas (BO) e Independencia (IND) fueron las localidades con los genotipos de mayor producción de aceites esenciales. Los dos ejidos mostraron una estrecha relación cuando se usó la técnica de RAPD's; mientras que con la de SSR se separaron, pero se observa una relación entre ellos.

En cuanto a la calidad de aceite expresada en los porcentajes de carvacrol y timol, los contenidos más altos de carvacrol se observaron en los materiales procedentes de los ejidos, Boquilla, San Rafael, 4 de Marzo y San Isidro, municipio Parras de la Fuente.

Respecto al timol sobresalió el germoplasma de los ejidos 4 de Marzo, San Isidro y Boquilla. En relación a los municipios, resaltaron por sus contenidos de aceite; así como por sus porcentajes de timol y carvacrol las recolectas de Parras de la Fuente.

Análisis genético

El análisis RAPD amplificó 10 marcadores, todos polimórficos (100% de polimorfismo); el análisis SSR amplificó 11 bandas, 10 de ellas polimórficas (91% de polimorfismo). En cuanto al índice de diversidad, este fue de 48 y 47%, respectivamente. Resultados que indican la existencia de diversidad genética en las poblaciones de orégano que se desarrollan en el estado de Coahuila y evidenciaron una estrecha relación entre los materiales evaluados. Así mismo el análisis de varianza (Cuadro 4) indicó la presencia de diversidad genética dentro y entre poblaciones. El análisis de componentes principales (ACP) mostró claras diferencias genéticas a nivel de poblaciones; ya que los municipios se dispersaron en los dos primeros componentes (ACP1 y ACP2) (Figura 4). Aunque, el RAPD presentó el máximo polimorfismo, la técnica de microsatélites diferenció un mayor número de materiales, pues resultaron más informativos los marcadores SSR; ya que cinco de estos presentaron valores de PIC en un intervalo de 0.265 a 0.363 y con RAPD sólo tres marcadores tuvieron un PIC de 0.330 a 0.397.

DISCUSIÓN

Con respecto a la situación geográfica no hubo agrupación de genotipos, tampoco se observó concordancia del agrupamiento entre los materiales con las dos técnicas utilizadas, lo que coincide con lo citado para papa y cebada (Milbourne et al, 1997; Russell et al., 1997). Así mismo, hay estudios que indican que a mayor polimorfismo entre marcadores (SSR, RAPD y ALFP), existe una correlación más alta entre datos y por lo tanto, la coincidencia en la formación de los grupos es grande (Powell et al., 1996; Pecina et al., 2001). En este trabajo, aunque el polimorfismo es alto (80 y 90), es insuficiente para agrupar a los genotipos de manera similar por las dos técnicas. Es probable que lo anterior responda al bajo número de iniciadores empleados, por lo que es recomendable el empleo de un mayor número de reacciones RAPD y SSR para la discriminación entre genotipos y aumentar la robustez de los resultados

Los materiales colectados en la localidad de La Laguna, no producen la mayor cantidad de aceite, pero si muestran consistencia en los valores obtenidos; cabe señalar que los genotipos de esta localidad son cultivados, a diferencia de los colectados en los otros sitios, que son materiales 100% silvestres, sin ningún tipo de manejo agronómico.

La diferencia en la producción de aceites esenciales; así como, en la concentración de carvacrol y timol, probablemente se asocie a la variabilidad genética del germoplasma evaluado y a los factores abióticos; no obstante que las regiones son geográficamente muy cercanas, los pequeños cambios climáticos (temperatura) afectan la producción de los aceites esenciales, como ocurre en las oleaginosas (Oliva et al., 2006), ya que se reconocieron zonas especificas donde se localizan las plantas con mayor producción de aceites esenciales.

La variabilidad genética y su distribución dentro y entre poblaciones vegetales es importante para comprender su origen y evolución en condiciones naturales, determinarla en parientes silvestres es útil para los fitomejoradores y genetistas. En el presente trabajo, la diversidad genética mostrada por la técnica de RAPD y SSR fue muy similar (48 y 47%) y es superior a la de otros cultivos (Powell et al, 1996; Hernández et al, 2006; Gil et al, 2006).

En las poblaciones de orégano estudiadas la variación genética es moderada y concuerda con la diferencia en la producción de aceites esenciales; sin embargo, es más coincidente con la variación en los porcentajes de timol en los materiales analizados. Así mismo pueden considerarse mayores a los resultados de la clasificación taxonómica tradicional, ya que se estableció que todos los materiales de orégano evaluados pertenecen a la especie L. graveolens HBK. Además, el nivel de diversidad genética indica que aunque hay sobreexplotación del recurso, existe suficiente variación entre los materiales de orégano procedentes del sureste de Coahuila; ya que los municipios de Matamoros y Parras de la Fuente se dispersaron en los dos primeros componentes principales. Por lo tanto es posible seleccionar individuos con potencial para incrementar la producción de aceites esenciales, sobre todo si se les aplica algún tipode manejo agronómico.

Las dos técnicas utilizadas diferenciaron a la mayoría de los genotipos incluidos en el estudio y coinciden en algunos aspectos, como establecer que el germoplasma de la localidad La Laguna es el más divergente en relación con los otros sitios de muestreo. Lo anterior se explica por el hecho de que las colectas del municipio de Matamoros son materiales cultivados, en los que ya se realizó una selección y manipulación del germoplasma. La técnica de microsatélites resultó más sensible y permitió observar un mayor número de marcadores SSR, medianamente informativos, en comparación con RAPD, al mostrar valores de entre 0.25 y 0.5 de PIC (Botstein et al., 1980). Con base en la reproducibilidad de los resultados, se recomiendan las condiciones descritas en el presente trabajo para llevar a cabo estudios de caracterización molecular de un número más grande de material genético de orégano, con cualquiera de las dos técnicas, lo cual incidirá en un mejor uso, aprovechamiento y conservación eficiente de este recurso forestal no maderable de gran importancia, sobre todo en zonas áridas y semiáridas del país.

CONCLUSIONES

Los marcadores RAPD y SSR permitieron detectar un alto nivel de polimorfismos en orégano. Sin embargo, no se logró diferenciar el total de las colectas evaluadas y no fue posible agruparlas por su situación geográfica.

La diversidad genética fue moderada (47%) y mayor entre poblaciones. Sin embargo, se establece que existe variabilidad suficiente entre los genotipos de orégano y es posible seleccionar germoplasma con potencial para incrementar la producción de aceites esenciales, sobre todo si a estos materiales se les da algún tipo de manejo agronómico.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su reconocimiento al fondo sectorial CONAFOR-CONACYT y a a Fundación Produce Coahuila A. C., por el financiamiento del proyecto CO3-10569 que dio origen al presente trabajo. También agradecen a la Asociación de Productores de Oréganos de México S. P. R. de R. L por su colaboración y facilidades brindadas en los trabajos de campo.

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