Virulencia de cepas de Listeria monocytogenes procedentes de cabras y sus derivados

Virulence of Listeria monocytogenes strains from goats and their byproducts

Guicela Ramírez Bernal^a, Alma Virginia Lara Sagahón^a, Carlos Gerardo García Tovar^a, Efrén Díaz Aparicio^b, Víctor Rubén Tenorio Gutiérrez^b

^a Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. México.

Recibido el 29 de enero de 2013.
Aceptado el 30 de abril de 2013.

Resumen

Se evaluó la virulencia de cepas de Listeria monocytogenes todas de serotipo 4b procedentes de cabras y sus derivados. Se observaron niveles de virulencia variables cuando se comparó la virulencia relativa (porcentaje de letalidad) en ratones BALB/c inoculados vía intravenosa o intragástrica y su capacidad para infectar macrófagos J774A.1, y células epiteliales Caco-2. Dos cepas obtenidas de alimento de cabras produjeron 100 % de letalidad por ambas vías de inoculación y no mostraron diferencia significativa con la cepa testigo (P>0.05) respecto al porcentaje de invasión y a los parámetros de la cinética de crecimiento cuadrática observada en ambas líneas celulares. Si bien todas las cepas lograron invadir las células Caco-2, solamente algunas consiguieron invadir el bazo después de la inoculación por vía intragástrica. Las dos cepas provenientes de alimento de cabras fueron las más virulentas, representando un riesgo para la salud humana y animal, ya que pueden ser diseminadas en el hato y de este a otras explotaciones o a las instalaciones donde se elaboran alimentos.

Palabras clave: Listeria monocytogenes, Cabras, Virulencia, Ratones BALB/c, Crecimiento intracelular, Macrófagos J774A.1, Caco-2.

Abstract

Keywords: Listeria monocytogenes, Goats, Virulence, BALB/c mice, Intracellular growth, Macrophages J774, Caco-2.

Listeria monocytogenes es un patógeno bacteriano transmitido por alimentos, que causa la listeriosis en humanos y animales. Las características clínicas de la listeriosis incluyen meningitis, meningoencefalitis, septicemia, aborto y gastroenteritis^(1,2). Aunque su incidencia es baja, tiene un impacto sanitario y económico considerable debido a su letalidad (20 a 30 %), y a que aproximadamente el 93 % de los casos requiere hospitalización^(3,4). L. monocytogenes es responsable de aproximadamente 21 % de las muertes en EE.UU. relacionadas con los principales patógenos transmitidos comúnmente por alimentos^(3,4). Un total de 1,624 casos confirmados de listeriosis fueron reportados en 28 países miembros de la comunidad europea en 2010; el índice listeriosis fue estable durante 2006-2010, aunque en algunos países se produjo un incremento en ese mismo periodo^(5,6).

La mayoría de los casos de listeriosis en animales han sido reportados en rumiantes de granja. La leche y los productos lácteos han sido involucrados frecuentemente en brotes de listeriosis en humanos^(7,8). Mientras que las granjas posiblemente sirvan como fuentes directas o indirectas de cepas de L. monocytogenes que son introducidas en la cadena de alimentación humana, éstas también representan ecosistemas que podrían facilitar el surgimiento de subtipos nuevos y más virulentos de este patógeno en un ambiente de alta frecuencia de transmisión⁽⁹⁾. La importancia de las cabras como proveedoras de alimentos se ha reflejado en el incremento de la población caprina y la producción de sus derivados^(10,11). A pesar de la significativa función socioeconómica de la cría de esta especie animal en todo el mundo, la investigación en cabras es limitada en comparación con la investigación en otras especies de animales y sus sistemas de producción^(12,13). En México ya ha sido detectada la presencia de Listeria en leche y quesos^(14,15), sin embargo es escasa la información relacionada con cepas aisladas de cabras y sus derivados así como la virulencia de los mismos^(16,17).

Se ha observado una heterogeneidad considerable en los niveles de virulencia de las cepas de L. monocytogenes sin alguna correlación sistemática establecida entre el nivel de virulencia y las características de identificación u origen específicas^(18,19). Está bien establecido que la respuesta inmune de las personas o la dosis del patógeno ingerida, juegan un papel importante en las presentaciones invasivas o gastroentéricas. Las diferencias entre la virulencia de las cepas también podrían contribuir a las diversas manifestaciones clínicas⁽²⁰⁾.

Los principales métodos para evaluar la virulencia de Listeria monocytogenes incluyen ensayos in vivo en animales y ensayos in vitro con células^(21,22,23). La penetración a través de la barrera intestinal es el paso primario para la infección y la subsiguiente invasión de los órganos blanco (hígado y bazo), que es crítica para el establecimiento de la infección sistémica. Los ensayos in vitro están basados en la capacidad de este patógeno para adherirse, entrar, multiplicarse en el citosol y diseminarse en diversas líneas de células eucariotas⁽²⁰⁾. El objetivo de este trabajo fue evaluar la virulencia de cepas de Listeria monocytogenes procedentes de alimento, materia fecal, leche y queso de cabras, mediante la determinación de su virulencia relativa en ratón y el crecimiento intracelular en células epiteliales y macrófagos.

Bacterias: Se compararon 12 cepas de L. monocytogenes pertenecientes al serotipo 4b^(24,25), de las cuales 3 fueron obtenidas de alimento de cabra (AC), 1 de leche de cabra (LC), 3 de materia fecal de cabra (MFC) y 5 de queso de cabra (QC). Además se empleó como testigo una cepa de L. monocytogenes ATCC 43249 serotipo 1/2a (LMC1) y una cepa de serotipo 4b (LMC2) donada por el hospital Manuel Gea González (SSA). Las cepas se cultivaron en caldo BHI (Difco) a 37 °C en agitación (180 rpm) y se mantuvieron almacenadas en caldo BHI suplementado con glicerol y suero bovino (1:1:1) a -70 °C hasta su uso.

Ratones. Ciento ochenta (180) ratones BALB/c de 4 o 10 semanas de edad obtenidos del Bioterio del Centro Médico Nacional Siglo XXI (IMSS), se emplearon para el pase e infección. Se permitió que los ratones se aclimataran durante dos semanas y se alimentaron con agua y alimento estériles ad libitum. Su cuidado y manejo se llevó a cabo de acuerdo a los procedimientos indicados por la Norma Oficial Mexicana NOM-U62-ZOO-1999 y el Subcomité Institucional para el Cuidado de Animales en Experimentación (SICUAE) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM.

Pase en Ratón. Dos ratones BALB/c de 12 semanas de edad fueron inoculados por vía intraperitoneal con H"10⁷ unidades formadoras de colonia (ufc) de cada una de las cepas de L. monocytogenes evaluadas en fase de crecimiento logarítmica. Se utilizó como testigo negativo un grupo de ratones inoculado con solución salina fisiológica (NaCl 0.15 mM). El tamaño del inóculo fue confirmado por conteo de ufc en placas de agar BHI (Difco). Tres días después de la inoculación, las bacterias se aislaron de los ratones. Los bazos se homogeneizaron en 1 ml de solución salina fisiológica y diluciones de estos homogeneizados se sembraron e incubaron en placas de agar BHI (Difco) a 37 °C durante 48 h⁽²⁶⁾. Las cepas obtenidas fueron confirmadas mediante siembra en placas de agar Oxford (Difco), tinción Gram y PCR⁽²⁷⁾. Las cepas se cultivaron y almacenaron como ya se describió.

Virulencia en ratones BALB/c. Para la evaluación de la virulencia relativa de las cepas de L. monocytogenes por cada vía de inoculación, intravenosa (iv) e intragástrica (ig), por cada cepa se empleó un grupo de cinco ratones BALB/c de 6 semanas de edad. Se utilizaron cultivos del microorganismo en fase de crecimiento logarítmica, centrifugados, lavados y resuspendidos en solución salina fisiológica. La inoculación intravenosa se hizo en la vena caudal con 0.2 ml (H"10⁵ ufc) del cultivo empleando una jeringa de 1 ml (longitud de aguja 13 mm/calibre 27Gx Becton Dickinson). A los ratones inoculados por la vía intragástrica se les retiró el alimento 12 h previas a la inoculación, con el fin de evitar el riesgo del vómito durante o posterior a la inoculación. Se inocularon con 0.1 ml (H"10⁹ ufc) del cultivo vía intragástrica mediante una sonda de alimentación de acero inoxidable (calibre 22, longitud 1.5 in) conectada a una jeringa de 1 ml. Se utilizó como testigo negativo un grupo de ratones inoculado con solución salina por cada una de las vías (iv e ig). El tamaño del inóculo se verificó mediante conteo de ufc en placas de agar BHI (Difco), después de incubación a 37 °C durante 48 h^(23,26). Los ratones se observaron durante 7 días. Los ratones que sobrevivieron se sacrificaron mediante la aplicación de CO₂ seguida de dislocación cervical. Se extrajo el bazo de todos los ratones muertos o sacrificados de cada grupo y se realizaron los conteos del microorganismo de prueba que logró invadirlos. Los bazos se homogeneizaron en 1 ml de solución salina fisiológica, y diluciones de estos homogeneizados fueron sembrados e incubados en placas de agar BHI (Difco) a 37 °C durante 48 h. Las cepas aisladas se confirmaron mediante siembra en placas de agar Oxford (Difco), tinción Gram y PCR⁽²⁷⁾. La virulencia relativa expresada como porcentaje de letalidad se calculó dividiendo el número de ratones muertos entre el número de ratones empleados por cepa, usando los datos de letalidad de las cepas testigo como punto de referencia⁽²³⁾.

Crecimiento intracelular en macrófagos J774 y células epiteliales Caco-2. Se crecieron monocapas de macrófagos J774 y células epiteliales Caco-2 a 37 °C durante 3 y 5 días respectivamente, en placas para cultivo celular de seis pozos hasta obtener una confluencia de 95 % (H"10⁵ células/pocillo). Las monocapas se inocularon con el microorganismo evaluado en fase de crecimiento logarítmica a una concentración de H"10⁶ ufc por pozo, obteniéndose una multiplicidad de infección (MOI) H"10 bacterias por célula en medio DMEM e incubadas a 37 °C durante 1 h; transcurrido este tiempo se lavaron tres veces con buffer de fosfatos (PBS) y se incubaron 2 h a la misma temperatura en medio DMEM suplementado con gentamicina (100 μg/ml de medio). Posteriormente, se lavaron las monocapas con PBS y para determinar el crecimiento intracelular, se incubaron a la misma temperatura en medio DMEM con gentamicina (10 μg/ml de medio) durante 22 h más. Se consideró que los conteos obtenidos 2 h posteriores a la infección representaron el número de bacterias que habían sido internalizadas. La invasión fue calculada en base a la relación entre las bacterias internalizadas respecto al inóculo y expresada en porcentaje. El crecimiento intracelular fue evaluado después de una incubación a 37 °C durante 2, 4, 8 y 24 h después de la infección. Los ensayos se realizaron por duplicado y el experimento se repitió dos veces para cada cepa evaluada^(28,29,30).

Análisis estadístico. Para el análisis estadístico se utilizó el software R versión 2.14⁽³¹⁾. Se realizó un análisis de regresión para ajustar un modelo a las cinéticas de crecimiento y un análisis de varianza para la comparación de los modelos de las cepas evaluadas con el control. La prueba de Dunnet se empleó para comparar el porcentaje de invasión de las cepas y su crecimiento en 24 h con el testigo.

En este trabajo se encontró que la virulencia relativa en ratones BALB/c varió entre las 12 cepas probadas, obteniéndose diversos porcentajes de letalidad (100 a 0 %) en ambas vías de inoculación. En ningún caso, pase y ensayo de virulencia, los organismos evaluados pudieron ser aislados del bazo de los ratones empleados como testigo negativo (inoculados con solución salina fisiológica).

En el Cuadro 1 se muestra la distribución de la virulencia relativa de las cepas con relación a la fuente. Once de las cepas produjeron el mismo porcentaje de letalidad por ambas vías de inoculación, sin embargo, las cepas control (LMC1 y LMC2) y una de alfalfa (AC3) produjeron una letalidad de 100 % al ser inoculadas por vía intravenosa, pero no fue así por la vía intragástrica, en donde mostraron letalidades de 0 o 20 %. Dos cepas (16.7 %) provenientes de alfalfa mostraron 100 % de letalidad en ambas vías de inoculación y seis cepas (50 %) no produjeron muerte en los ratones por ninguna vía de inoculación (iv o ig). Siete de las doce cepas y las dos cepas tstigo lograron invadir y crecer en el bazo de los ratones en ambas vías de inoculación con diferentes proporciones. Los ratones inoculados vía intravenosa (5.09 ± 1.98 log₁₀ ufc) y los ratones muertos (7.52 ± 0.41 log₁₀ ufc) presentaron conteos en bazo superiores respecto a los observados en los ratones inoculados vía intragástrica (3.04 ± 2.70 log₁₀ ufc) y los sacrificados (2.98 ± 2.12 log₁₀ ufc). Todas las cepas fueron recuperadas del bazo de los ratones inoculados por la vía intravenosa, no obstante en cinco de los ratones inoculados por vía intragástrica esto no fue posible.

La diversidad de los niveles de virulencia se reflejó también en el cultivo de las cepas en las líneas celulares J774 y Caco-2. Se determinaron las ufc intracelulares para cada cepa 2, 4, 8 y 24 h posteriores a la infección, hallándose que todas las cepas evaluadas pueden invadir y replicarse intracelularmente en ambas líneas celulares (Figuras 1 y 2). Se observó que seis cepas en los macrófagos J774 (AC3, LC1, MFC1, MFC2, QC1 y QC4) y siete en las células Caco-2 (AC3, LC1, MFC1, MFC2, MFC3, QC1 y QC4) obtenidas de alimento, leche, materia fecal y queso, muestran diferencia significativa con la cepa testigo LMC1 (L. monocytogenes ATCC 43249) (P<0.05) en relación al porcentaje de invasión. También se encontró que para ambas líneas celulares, cinco de las cepas obtenidas de materia fecal, leche y queso (LC1, MFC1, MFC2, QC2 y QC4) muestran diferencia significativa con la cepa testigo LMC1 (P<0.05) respecto al crecimiento intracelular en 24 h. Del mismo modo, se observó que independientemente de la cepa, los porcentajes de invasión y el crecimiento intracelular fueron menores en los macrófagos J774 (0.09 ± 0.43 %; 0.65 ± 1.07 log₁₀ ufc) que en las células Caco-2 (1.25 ± 1.07 %; 3.0 ± 0.85 log₁₀ ufc) (Figuras 1 y 2). El crecimiento de la cepas en los macrófagos presentó una disminución entre las 8 y las 24 h posteriores a la infección, excepto AC1, AC2 y las cepas control LMC1 y LMC2 (Figura 2B). La cepa proveniente de leche (LC1) tuvo dificultades para sostener el crecimiento en los macrófagos, mostrando una disminución en las ufc 4 h posteriores a la infección.

Asimismo, se encontró que el modelo cuadrático de la forma logUFC=At²+Bt+C, donde t representa el tiempo, es adecuado para describir la cinética de crecimiento promedio de todos los evaluados en ambas líneas celulares (r² ≥ 0.85). Por medio de la comparación de modelos se confrontaron las cinéticas de las cepas con el control LMC1 y se obtuvo que en Caco-2 y el los macrófagos J774, 9 y 10 de las cepas respectivamente (AC3, LC1, MFC1, MFC2, QC1, QC2, QC3, QC4, QC5 y MFC3) presentaron diferencia significativa (P<0.05) en por lo menos uno de los valores estimados de los parámetros del modelo.

Estudios llevados a cabo por el grupo de Roche et al⁽¹⁹⁾ sugieren que hasta un 50 % de las cepas de L. monocytogenes podrían tener una baja virulencia debido a mutaciones en determinados genes de virulencia. Otros estudios muestran que la virulencia de las cepas de L. monocytogenes varía incluso dentro del mismo serotipo^(21,22,32). A pesar de que las cepas evaluadas en este trabajo pertenecen al serotipo 4b que es uno de los más frecuentemente aislados en casos de listeriosis; dichas cepas presentaron diferente nivel de virulencia en los ensayos realizados.

En este trabajo se evaluó la virulencia relativa de las cepas en ratones BALB/c, para ello fueron inoculadas por la vía intravenosa o intragástrica. La determinación de la virulencia relativa, la cual se expresa como porcentaje de letalidad, representa una alternativa para los ensayos de virulencia en ratón, ya que requiere menor número de animales por ensayo porque es independiente de las ufc⁽²³⁾. Nuestros resultados mostraron que las cepas de L. monocytogenes inoculadas en ratones BALB/c variaron en el porcentaje de letalidad que causan y en su habilidad para crecer en el bazo de ratón. Se encontró que la infectividad de algunas cepas fue diferente cuando se comparó la vía de inoculación. El 50 % de las cepas no mostró virulencia en los ratones independientemente de la vía de inoculación (iv o ig) y no lograron infectar el bazo de los ratones después de inoculación intragástrica. De acuerdo con reportes, el porcentaje de cepas de L. monocytogenes no patógenas varía entre 1.6 y 90 %⁽³²⁾.

En diversos trabajos se observa que la incapacidad de ciertos aislados para infectar el bazo y en general la baja virulencia de cepas de campo, podría reflejar la mutación o ausencia de uno más factores de virulencia lo cual afectaría la patogenicidad del microorganismo^(33,34). Aunque la cuantificación de bacteria viable en el bazo o el hígado ha provisto los resultados más consistentes en la evaluación cuantitativa de la virulencia^(35,36), existen trabajos que muestran una amplia variación en la infectividad en ratones, en los cuales se han obteniendo conteos promedio <3 log₁₀ ufc en el bazo e hígado de ratones inoculados por la vía intragástrica⁽³⁷⁾. En el presente estudio se encontró que una cepa aislada de materia fecal (MFC3) inoculada por vía intravenosa, produjo conteos en bazo semejantes a los obtenidos en ratones muertos (7.38 ± 7.3 log₁₀ ufc) sin causar muerte en los ratones. Esto podría indicar que un conteo elevado del microorganismo en el bazo de ratones inoculados por vía intravenosa, no necesariamente asegura la virulencia del mismo. Se ha observado que la evaluación de la virulencia por conteos en el bazo después de la inoculación intravenosa podría fallar para detectar aislamientos de L. monocytogenes con poca infectividad para la ruta intragástrica, y la mayoría crecen mejor en el bazo que en el hígado debido a la inoculación vía intravenosa, por ello se cree que la ruta de entrada podría afectar la distribución de la bacteria en dichos órganos, y que el ambiente celular del bazo e hígado difiere, requiriéndose mecanismos de virulencia específicos para su crecimiento en cada uno(26,36).

Un contribuyente principal a la virulencia de L. monocytogenes es su habilidad para invadir y replicarse dentro de una amplia variedad de células eucariotas^(18,20). Las bacterias generalmente crecen de manera exponencial^(38,39); sin embargo en este trabajo se encontró que las cepas evaluadas de L. monocytogenes mostraron un crecimiento polinomial de segundo grado en las líneas celulares macrófagos J774 y Caco-2. En los resultados de los ensayos in vitro, se observó que las cepas obtenidas de cabras y sus derivados difieren en su habilidad para invadir ambas líneas celulares Caco-2 y los macrófagos, aunque mostraron el mismo potencial de crecimiento dentro de las células. En general se observó una invasividad y crecimiento intracelular ligeramente superior en las células epiteliales Caco-2, mostrando también mayor dispersión en los datos obtenidos respecto a las cepas evaluadas. Nuestros resultados de crecimiento intracelular en ambas líneas celulares concuerdan con los obtenidos en otros estudios, en los cuales las cepas de L. monocytogenes crecen 2-3 log₁₀ (10 a 12 h) en las células Caco-2, comenzando a declinar su crecimiento hacia las 24 h, y en los macrófagos crecen 1.5 a 3 log₁₀ (6 a 14 h), disminuyendo su crecimiento entre 10 y 24 h posteriores a la infección^(40,41).

Los resultados del ensayo in vitro no pudieron reproducirse del todo en el ensayo in vivo usando inoculación intragástrica en ratones BALB/c. A pesar de que todas las cepas evaluadas lograron invadir las células Caco-2, no todas consiguieron invadir el bazo después de la inoculación por vía intragástrica. Estos resultados concuerdan con lo encontrado en otros estudios, indicando que la virulencia no solamente está determinada por su capacidad de invasión y crecimiento intracelular, sino también por su habilidad para crecer in vivo(^37,42).

La internalina A es un factor de virulencia de L. monocytogenes necesario para la invasión de células del epitelio intestinal. Algunos serotipos poco virulentos (por ej., 1/2c) poseen mutaciones en el gen inlA que dan lugar a internalinas A truncadas, pero en el serotipo 4b no se dan estas mutaciones, lo que se ha asociado con su carácter más virulento⁽⁴³⁾. Aunque la E-caderina de ratón no es un receptor eficiente para la internalina A de L. monocytogenes, el mecanismo de acción que involucra la E-caderina el cual promueve la internalización de la bacteria en la célula hospedera, podría no ser la única ruta, ya que diversos estudios muestran que algunas líneas de ratón como la BALB/c usada en este trabajo, son susceptibles a la infección vía intragástrica por L. monocytogenes^(20,43). Además, la habilidad de L. monocytogenes para sobrevivir en el tracto gastrointestinal e invadir a través de la mucosa, y la presencia de condiciones fisiológicas e interacciones microbianas con bacterias comensales en la mucosa intestinal, posiblemente sean factores limitantes para la infección natural, y requieran factores de virulencia diferentes de aquellos necesarios para la invasión y multiplicación de células in vitro^(29,37,44). Estas podrían ser algunas de las razones por las cuales los resultados de los ensayos en células humanas no siempre muestren una correlación clara con los resultados obtenidos en el modelo de ratón inoculados por la vía oral.

En nuestro estudio dos de las cepas evaluadas de Listeria monocytogenes (AC1 y AC2, 16.7 %) causaron el 100 % de letalidad en ratones como consecuencia de la inoculación intravenosa e intragástrica; estas cepas mostraron concentraciones altas del microorganismo en el bazo, un crecimiento sostenido en ambas líneas celulares y sus parámetros cinéticos no tuvieron diferencia significativa al compararlos con la cepa testigo LMC1 (ATCC 43249), lo cual podría sugerir que dichas cepas estarían mejor capacitadas para sobrevivir en el tracto gastrointestinal, llegar a sangre traspasando la mucosa intestinal y multiplicarse en los órganos. Asimismo, una cepa obtenida de leche de cabra fue incapaz de desarrollar un crecimiento sostenido en los macrófagos, mostrando una disminución en su crecimiento intracelular 4 h posteriores a la infección, y en general un crecimiento intracelular menor comparado con el resto de las cepas en ambas líneas celulares. Se han encontrado cepas consideradas avirulentas capaces de iniciar una infección dentro de los macrófagos pero no logran prolongarla por al menos 7 h, esta capacidad ha sido asociada con la expresión de proteínas de reparación de DNA y de respuesta a estrés, y se considera que estas diferencias podrían determinar la habilidad de L. monocytogenes para sobrevivir en los macrófagos⁽¹⁸⁾.

Este estudio muestra que las cepas evaluadas de L. monocytogenes provenientes de cabras y sus derivados, todas del serotipo 4b, presentaron diferente nivel de virulencia en los ensayos realizados, la cual no solo está determinada por la capacidad de invasión y crecimiento intracelular, sino también por su habilidad para crecer in vivo. No obstante que todas las cepas evaluadas tuvieron la capacidad para invadir y crecer intracelularmente en los macrófagos J774 y las células epiteliales Caco-2, no todas establecieron una infección y produjeron muerte en los ratones. Si bien las cepas con mayor nivel de virulencia provienen de alfalfa utilizada como alimento de cabras, estas representan un riesgo para la salud animal y la salud humana, ya que pueden ser diseminadas en el rebaño, y de éste a otras explotaciones o a las instalaciones donde se elaboran alimentos. Debido a la que los rumiantes de granja y la leche han sido frecuentemente implicados en casos de listeriosis y la importancia de las cabras como fuente de alimentos, es necesario incrementar la investigación en esta especie animal.

AGRADECIMIENTOS

Trabajo financiado por SAGARPA clave del proyecto 46599; CONACYT clave del proyecto SIN-2008/90945 y beca CONACYT número 173630.

LITERATURA CITADA

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