Diversidad genética de la región variable de los genes msp1a y msp4 en cepas de Anaplasma marginale de México

Genetic diversity of the msp1a gene variable region and msp4 gene of Anaplasma marginale strains from Mexico

Rafael Jiménez Ocampo^a, Carlos Agustín Vega y Murguía^b, Nayelli Oviedo Ortega*^b, Edmundo Enrique Rojas Ramírez^b, Miguel Ángel García Ortiz^b, Jesús Francisco Preciado de la Torre^b, Rodrigo Rosario Cruz^b, Delia Inez Domínguez García^c, Sergio D. Rodríguez Camarillo^b

^a C.E. Valle del Guadiana, Durango. INIFAP. México.

^c Universidad Autónoma de Guerrero. Unidad Académica de Ciencias Agropecuarias y Ambientales.

Recibido El 16 de agosto de 2011.
Aceptado El 14 de noviembre de 2011.

RESUMEN

La anaplasmosis es de difícil control debido a la diversidad genética de la rickettsia. La proteína Mspla, compuesta de repetidos variables de entre 23 y 31 aminoácidos en su región variable y la proteína Msp4, son dos de las proteínas de superficie más estudiadas en A. margínale y han sido ampliamente usadas como marcadores genéticos en la caracterización de cepas de A. margínale de diferentes orígenes geográficos. En este trabajo se analizaron, la región variable de la proteína Msp1a y la proteína Msp4 de 10 cepas mexicanas. En el caso de Msp1a, se observó un patrón de segregación que contiene los repetidos appT en diferentes modalidades a lo largo de aislamientos del Golfo de México, principalmente en zonas de estabilidad enzoótica, mientras que la máxima variabilidad se presentó en Tamaulipas, en aislamientos de un brote de la enfermedad, es decir en zonas de inestabilidad. La diversidad observada no es tan extensa como se esperaba y, misma que se puede explicar por la presión que el sistema inmune del hospedero ejerce contra la rickettsia y los mecanismos de esta última para evadirla. En el caso de la proteína Msp4, la secuencia fue altamente conservada tanto en nucleótidos como en aminoácidos para los aislados en estudio, aunque, se observan diferencias con lo previamente reportado en México para este marcador.

Palabras clave: Anaplasma marginale, Proteínas de superficie, msp1a, msp4, Diversidad genética, México, Bovinos, Anaplasmosis bovina.

Control of anaplasmosis is limited due to the rickettsia's wide genetic diversity. Major surface protein (Msp) 1a is composed of one constant region and a variable region which may contain one or more 23 - 31 aminoacid repeat sequences. Mspla variable region together with Msp4 have been used for phylogenetic purposes. We analyzed the variable region of Msp1a and Msp4 gene of ten new Mexican A. margínale strains and compared with previously published sequences in order to correlate the structure of these genes with geographic distribution. In the case of Msp1a, there were geographically distant strains that shared the same variable region, whereas strains from the same outbreak or the same region showed very different structures. Wide diversity in this region had been observed with previous analysis yet a pattern composed by several repeats emerged along organisms isolated from the Mexican gulf coast states. This variation can be explained in part by the immune system pressure over the organism, yet other independent transmission events have to be considered. In the case of Msp4, little variation was observed at the nucleotide level which did not affect the amino acid structures along the new strains analyzed, yet there are differences with previously published for Mexican isolates.

Key words: Anaplasma marginale, Surface proteins, Msp1a, Msp4, Genetic diversity, México, Cattle, Bovine anaplasmosis.

INTRODUCCION

La anaplasmosis bovina es una enfermedad hemolítica que afecta económicamente a la producción ganadera en diferentes países, incluido México⁽¹⁾ y es producida por la rickettsia A. margínale que presenta gran diversidad genética y antigénica⁽²⁾, lo que limita su control mediante vacunas, por lo que aún cuando la vacunación es la forma idónea de control, hasta el momento no se cuenta con vacunas inactivadas efectivas. En México a pesar de que se tiene éxito con una cepa de baja virulencia y con las vacunas homólogas inactivadas a nivel experimental, no existen vacunas comerciales para el control de la enfermedad y sólo algunos países usan de manera rutinaria, cepas de A. margínale de baja virulencia⁽³⁾.

En el genoma de este microorganismo se han descrito ampliamente seis genes de importancia para estudios moleculares, msp1 α, msp 1β, msp2, msp3, msp4 y msp5, en los que están codificadas las correspondientes proteínas principales de superficie de la rickettsia, algunas de las cuales constituyen blancos de la respuesta inmune del hospedero contra el patógeno^(3-5). De estas proteínas, Msp1a⁽⁶⁾ presenta polimorfismo entre distintos aislados de A. margínale y otras más, sufren de variaciones dentro del propio animal evadiendo así la respuesta inmune del hospedador. Por el contrario, Msp4, es ampliamente conservada entre aislados geográficos y se usa como marcador filogenético⁽⁷⁾. Para la caracterización molecular de la diversidad genética de los aislados se han usado marcadores moleculares como la región variable de la proteína Msp1a y la proteína Msp4. Msp1a es una proteína de superficie codificada por el gen msp1 α, conformada de un dominio conservado y un dominio variable compuesto de uno o varios polipéptidos muy semejantes entre sí llamados repetidos, cada uno compuesto de 23 a 31 aminoácidos y de los que se pueden encontrar hasta 11 secuencias en tándem, iguales o diferentes^(6,7). Estudios de caracterización molecular de aislados geográficos de A. margínale demuestran amplia diversidad genética, lo que sugiere que el gen msp1 α se encuentra bajo presión positiva por parte del sistema inmune del hospedero⁽⁸⁾. El fragmento variable de esta proteína se encuentra expuesto sobre la membrana de la rickettsia, y se sabe que tiene propiedades de ligando o adhesina hacia un receptor aún no identificado en los eritrocitos del bovino y células de ciertas garrapatas como Dermacentor variabilis e Ixodes scapularis⁽¹⁰⁾, se le atribuye un papel importante en la inmunidad del bovino y en la invasión y transmisibilidad por garrapatas. La diversidad que se observa en esta proteína es importante, ya que afecta de manera directa el diseño y desarrollo de inmunógenos que pudieran tener un amplio espectro en la protección ofrecida contra esta enfermedad⁽¹¹⁾. Estrada-Peña et al⁽¹²⁾ reportan la primera evidencia de evolución del gen msp 1α de A. margínale relacionado con los rasgos ecológicos que afectan el desarrollo de la garrapatas. La proteína MSP4 de 31 kDa, codificada por el gen msp4, es altamente conservada entre los distintos aislados de A. margínale. Contiene bloques de aminoácidos relacionados con la proteína MSP2⁽¹³⁾. Aunque se cree que es de baja capacidad inmunoprotectora, ha sido usada en estudios filogenéticos dada su baja variabilidad, y actualmente se realizan estudios con rMSP4 para evaluar su potencial inmunogénico⁽¹⁴⁾. En México se reporta que MSP4 es altamente conservada en aislados de diferentes regiones geográficas y aislados de un mismo brote^(15,16). Para plantear estrategias de control efectivas en contra del microorganismo se requiere conocer la epidemiología molecular de aislados nacionales de A. margínale, por lo que el objetivo de este estudio fue caracterizar la diversidad genética de cepas mexicanas de Anaplasma margínale usando como marcadores las secuencias de los genes msp1 α (región variable) y msp4.

MATERIALES Y MÉTODOS

Colección y nomenclatura de las muestras

Extracción de ADN y amplificación por PCR

La extracción de ADN genómico se realizó mediante el kit comercial Ultra Clean^TM DNA genomic, (MO BIO Laboratories Inc.). El ADN fue sometido a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un volumen de 25 ml, empleando la mezcla de reacción PCR Master mix system (Promega, Madison, WI, USA). 0.1-1 ng de ADN y 10 pmol de los siguientes iniciadores: msp1α sentido 5' -GTGCTTATGGCAGACATTTCC-3' y antisentido 5'-CTCAACACTCGCAACCTTGG-3'; ubicados en las regiones conservadas que flanquean la región variable del gen msp1 α⁽²⁰⁾; con los siguientes pasos en el termociclador: desnaturalización a 95 °C por 120 seg, alineación a 56 °C por 60 seg y extensión a 72 °C por 60 seg, con 36 ciclos y un paso final de extensión a 72 °C por 10 min; para la amplificación del gen msp4 se utilizaron los iniciadores sentido 5'- GGGAGCTCCTATGAATTACAGAGAATTGTTTAC-3' y antisentido 5'-CCGGATCCTTAGCTGAAC AGGAATCTTGC-3'; con el siguiente programa: desnaturalización 94 °C por 120 seg, alineación a 60 °C por 60 seg y extensión a 72 °C por 60 seg con 35 ciclos y un paso final de extensión a 72 °C por 10 min⁽²¹⁾. Las reacciones fueron realizadas en un termociclador Biometra^®, (Goettingen, Germany). Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1.0 %, el tamaño de los amplicones fue comparado con un marcador de peso molecular de 1 Kb (EZ Load 100 bp PCR Molecular Ruler, Bio-Rad). Las secuencias de cada gen se verificaron por clonación en un vector pGEM Promega^® (Madison WI). Por cada amplicón se seleccionaron diez clonas recombinantes que tuvieran el inserto del tamaño esperado o igual al del control positivo de ADN genómico, tres clonas con el inserto verificado se crecieron en medio LB con ampicilina por 12 h y se extrajo el ADN plasmídico con un kit comercial (Wizard Plus SV Minipreps DNA Purifications System Promega); el ADN se cuantificó en un espectrofotómetro (NanoDrop Thermo scientific MA, USA) y se enviaron a secuenciar al Instituto de Biotecnología de la UNAM, tres clonas en sentido y antisentido en una concentración de 600 ng/1 6 ml. S e obtuvieron las secuencias y cromatogramas de las tres clonas de cada aislado con el programa BioEdit y las tres secuencias FASTA de cada aislado se alinearon mediante un programa de conglomerados ClustalW (www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html), para obtener una secuencia consenso en la cual se localizaron los marcos de lectura abiertos (ORF) mediante la utilería en línea del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). En las secuencias de aminoácidos fueron identificados los repetidos del gen msp1a. Con los dos marcadores se realizó un análisis filogenético de las secuencias obtenidas de los nuevos aislados no reportados y los aislados previamente reportados en México, con base en el algoritmo Neighbor-Joining.

Los repetidos previamente reportados que fueron utilizados para los análisis bioinformáticos fueron obtenidos del GenBank del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) MSP1A: EU283847-EU283856, DQ501242-DQ501244, EF053268, ACM49259.1, ABO09627, ABF56507-ABF56509. MSP4: EU283843-EU283846, EF053264-EF053267, ACM48956.1, AAN09910.1, ABO09623-ABO09 626. MSP4: EU283847-EU283856, ABO09623-ABO09625, AF428083, AF428089, YP002563212, AF428090.

RESULTADOS

En este trabajo se colectaron diez muestras de sangre de bovinos de diferentes regiones de México que resultaron positivas en la amplificación por PCR anidado del gen msp5, lo que nos confirmó el diagnostico de la presencia de A. marginak⁽¹⁵⁾ (datos no mostrados). Estas 10 muestras fueron obtenidas de seis Estados de la República (Cuadro 1). Tres de estos aislados (Mex-30-184-01; Mex-30-184-02; Mex-30-184-03) se obtuvieron de un solo brote de la enfermedad en un mismo rancho en Tlapacoyan, Veracruz; por otro lado, se obtuvieron dos muestras (Mex-28-037-01 y Mex-28-037-02) del mismo municipio en Soto la Marina, Tamaulipas, pero de ranchos diferentes.

En el Cuadro 1 se observan los aislados recuperados en este estudio (asteriscos), y otros previamente reportados; asimismo, se muestra la composición de los repetidos en el fragmento variable de Msp1a para todos ellos. En el Cuadro 2 se presentan las secuencias y los números de acceso de tres repetidos 72, 73 y 74 para los aislados Tlapacoyan 01, Tlapacoyan 02 y Soto la Marina 02 respectivamente, no reportados previamente.

Al comparar la estructura de la región variable del gen msp1 α, existen similitudes entre los repetidos como en el caso particular de los aislados Atitalaquia, Hidalgo y 01 de Soto la Marina, Tamaulipas, las cuales son idénticas a pesar de ser originarios de lugares muy distantes. Asimismo, existe una alta coincidencia entre los aislados de Veracruz, Playa Vicente y Tlapacoyan 01, excepto por el repetido "B" en la 6° posición del primero, que está ausente en el segundo. Entre otros aislados que presentan alto grado de similitud se encuentran Palenque, Chis y 02 de Tlapacoyan con el mismo número de repetidos, pero el repetido β de la 1°posición de Palenque se sustituye por el repetido 73, en el de Tlapacoyan (Cuadro 1). En un grado menor de similitud, se observa como el aislado Palenque es muy parecido a los aislados Tlapacoyan y Tepic conservando el motivo β β Γ en sus estructuras. En contraste, se observa el caso de Mex-28-037-01 y Mex-28-037-02 colectados en dos diferentes ranchos en brotes simultáneos en Soto la Marina, Tamaulipas, donde no existe coincidencia en ninguno de los repetidos presentes. De la misma forma los repetidos en los aislados Mex-30-184-01, Mex-30-184-02 y Mex-30-184-03, de un mismo rancho en Tlapacoyan, Ver., excepto por el repetido "C" en los aislados 01 y 03, no hay coincidencias entre ellos.

En el caso de los aislados Mex-31-089-01 de Ticul, Yuc. y Mex-30-184-01 de Tlapacoyan, Ver., a pesar que presentan el mismo número de aminoácidos y pares de bases, los repetidos en tándem son completamente diferentes (Cuadro 1, Figura 1).

Las secuencias del gen msp4 en ocho aislamientos de este estudio, presentan 849 pares de bases con variaciones en la secuencia de nucleótidos. En dicha secuencia está codificada una proteína de 282 aminoácidos como se ha reportado previamente⁽²²⁾. Las secuencias obtenidas para los aislados de este trabajo (Cuadro 3) presentaron un promedio de seis variaciones sinónimas con relación a la reportada para msp4 del aislado de Florida⁽²²⁾; sin embargo las diferencias en nucleótidos no se reflejaron en cambio en el aminoácido correspondiente. El análisis de alineación múltiple de similitud de las secuencias, calculado mediante el programa Clustal W, mostró un máximo de 100 % de similitud entre los aislados de Ticul y Tlapacoyan 02, y los aislados Tepic y Soto la Marina 03, mientras que el mínimo de similitud (99.4 %), se observó entre los aislados Tlapacoyan 01 y Soto a Marina 02, sin embargo estas diferencias no son significativas, ya que en la mayoría de los casos estas diferencias a nivel de nucleótidos no se reflejaron en las secuencias de aminoácidos.

La relación entre Msp4 de los aislados de este estudio con los ya publicados, se observa en el árbol filogenético realizado utilizando el algoritmo Neighbor Joining (Clustal W; Figura 2).

DISCUSION

Anaplasma marginale es de distribución nacional en México y, en ciertas regiones se presenta con frecuencia en forma de brotes por fallas en el control de garrapatas, ocasionados por el excesivo uso de ixodicidas y la consecuente generación de resistencia⁽²³⁾. Estudios previos sobre la diversidad genética de esta rickettsia en México usando aislamientos de varias zonas del país, mostraron una extensa variación tomando como marcador la región variable del gen msp1 α, sin embargo, estos estudios se basaron en un número relativamente reducido de aislamientos^(11,15,16). En el presente trabajo analizamos la diversidad genética de A. marginale en México, usando la cepa Florida como base para una comparación usando un número de aislamientos adicionales a los previamente descritos. Para este efecto, se incluyen organismos colectados de zonas del Golfo de México, desde Tamaulipas, centro y sur de Veracruz, Chiapas, Yucatán y, dos aislados, de Nayarit e Hidalgo y se analizan en conjunto con secuencias previamente publicadas para robustecer el análisis y obtener una idea más precisa sobre la diversidad de este organismo en México.

En segundo término encontramos el motivo α β β Γ presente en siete aislados, sea por si solos o complementados por otros repetidos, comprendiendo organismos del Golfo de México, pero también del centro del país (Yautepec, Mor.) y la costa oeste (Tepic Nay.). Por su parte, la amplia distribución del repetido β en nueve aislados en secuencias de 2 o más dentro del mismo aislado (Cuadro 1) hace que esos aislamientos se puedan agrupar en una sola tribu dentro del árbol filogenético (Figura 1), indicando la influencia que tiene este repetido sobre un gran número de organismos a nivel nacional. Hay que notar que el motivo α β β Γ o motivos relacionados, se encuentran también en organismos de Argentina⁽²⁴⁾ y Brasil⁽²⁵⁾, lo que podría indicar que esta estructura pudo tener su origen en Brasil, y ser transferida de manera silente a México en pie de cría de razas productoras de carne y con buena adaptación a climas cálidos como el nuestro⁽¹¹⁾. La presencia en México de genotipos que incluyen el motivo α β β Γ, dan pie a la hipótesis que los aislados base u origen de estos repetidos, probablemente se mantienen en las costas del golfo de México, de donde se distribuyen al resto del país, hacia el norte en Tamaulipas y hacia el sur, en Chiapas. Su presencia en Morelos y Tepic, se puede explicar por movilizaciones ocasionales de ganado de Registro desde Veracruz a otros puntos del país.

Un tercer grupo de aislamientos compuesto por tres aislados con la misma estructura de repetidos (τ, 57, 13, 18) son Soto la Marina 01 y Tamaulipas 15⁽¹⁶⁾, los dos de Soto la Marina y el aislado Atitalaquia, Hgo, Mex-14-010-01, este último colectado en una engorda de ganado, establecida en una zona geográfica donde este tipo de bovinos no es usual, y donde Boophilus microplus no se reporta, por lo que se puede pensar que sea el mismo aislado importado de Tamaulipas.

Finalmente se observa un cuarto grupo de aislamientos compuesto mayormente por organismos colectados en Soto la Marina a partir de brotes simultáneos en varios ranchos⁽¹⁶⁾; dentro de este grupo se observa que hay cuatro aislamientos que comparten el genotipo G4 de Msp1a (4, 63, 63, 27, 12), de igual manera los genotipos G2, G5 y G8, fueron colectados en el mismo rancho, durante el brote. En el caso del genotipo G4, lo más probable es que los animales simplemente comparten el mismo organismo, mientras que los otros genotipos son organismos diferentes⁽¹⁶⁾. Dentro de este último grupo de organismos con genotipos no relacionados, se encuentra el nuevo aislamiento de Ticul, Yuc., que presenta los repetidos F M M, que no habían sido reportados previamente en México, pero que son comunes en aislados de Argentina (F M M M), Israel (F M) e Italia (M)^{(11 )}. Los resultados del análisis filogenético de las secuencias obtenidas con los aislados nuevos y los ya reportados, no muestran una asociación filogeográfica contundente, lo que concuerda con la teoría de que la heterogeneidad observada entre los aislados de Anaplasma marginale en México puede ser explicada, como en otras partes, por el movimiento del ganado a nivel nacional y por el mantenimiento de ciertos genotipos por eventos de transmisión independientes, que incluyen transmisión por garrapatas y manejo inadecuado con objetos punzocortantes como agujas, navajas de castración, aretadores, etc.⁽²⁶⁾. Sin embargo no se puede dejar a un lado el hecho de que ciertos repetidos se observan con mayor frecuencia en algunas zonas, como se mencionó antes y como se muestra en el Cuadro 1 y la Figura 1.

En el caso del marcador msp4 en los aislados de este estudio, las diferencias observadas en la secuencia de nucleótidos y aminoácidos es más extensa, como había sido reportado en un brote en el estado de Tamaulipas⁽¹⁶⁾ (Figura 1). Para el análisis de filogenia del gen msp4 se agregaron las secuencias del aislado Florida, EE.UU. como testigo, el cual se aprecia en una rama independiente de los aislados mexicanos; también se incluyó como testigo, la secuencia del gen msp4 de Anaplasma centrale. En este análisis se observa al aislado Mex-14-010-01 de Atitalaquia Hgo., en una rama diferente de donde se encuentran la mayor parte de los aislados, con lo que aún con las diferencias observadas, los aislados mexicanos en su mayoría, agrupan en una sola tribu.

En este estudio se presenta una panorámica más extensa de la diversidad genética de la rickettsia Anaplasma marginale usando como elementos de estudio 10 nuevos aislados y su comparación con lo previamente descrito. Esta panorámica muestra la presencia del motivo a b b G, a lo largo del Golfo de México y aún en otras localidades. A pesar de que los hallazgos de diversidad pueden ser explicados en parte por la presión ejercida por el sistema inmune del hospedero hacia la rickettsia, los mecanismos de ésta para evadir la respuesta inmune, y en parte por los movimientos de ganado dentro del país, existen otros elementos que debemos considerar en los patrones de distribución de la enfermedad que no se han evaluado a detalle, como la transmisión por Boophilus microplus, la garrapata más abundante en México y capaz de transmitir Anaplasma de manera biológica y su relación con la rickettsia. De tal manera, es notorio que de los 28 aislados conocidos hasta ahora en México, 7 comparten el primer repetido de msp1a y 8 la última; de estos, 6 comparten el primero y el último repetido; también resalta que la mayor diversidad observada, se encuentra en la región de Tamaulipas, donde coinciden dos fenómenos, la presencia de brotes severos de anaplasmosis bovina, probablemente debido a que se ha convertido en una zona de inestabilidad enzoótica y, la selección positiva de cepas de garrapatas resistentes a los ixodicidas; posiblemente asociados estos dos fenómenos debido a la relación estrecha en la co-evolución de ambos organismos⁽¹²⁾; en contraste las secuencias que comparten la primera y la última secuencia se encuentran en zonas con estabilidad enzootica. Posiblemente la diversidad de A. marginale observada en México, esté relacionada con los factores de selección ambientales y el uso indiscriminado de ixodicidas, seleccionando poblaciones de garrapatas resistentes a los mismos.

Estos nuevos aislados reportados en este estudio y en estudios previos, nos indican que a pesar que la diversidad genética para el marcador msp1a es extensa, existen poblaciones muy relacionadas dentro en México, y que esto podría ser usado en un programa de control mediante el uso de vacunas inactivadas o vacunas vivas a partir de cepas avirulentas que compartan marcadores, como los descritos en este estudio.

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Trabajo Financiado por proyecto CONACYT-SEP P62525.