Identificación de biotipos de Staphyloccocus aureus en vacas lecheras de producción familiar con mastitis subclínica en la región centro–este del Estado de México

Staphylococcus aureus biotypes in cows presenting subclinical mastitis from family dairy herds in the Central–Eastern State of Mexico

Ana María Manjarrez López^a, Soledad Díaz Zarco^a, Félix Salazar García^a, Benjamín Valladares Carranza^a, Adriana del Carmen Gutiérrez Castillo^a, Alberto Barbabosa Plliego^a, Martín Talavera Rojas^a, María Uxúa Alonso Fresán^a, Valente Velázquez Ordoñez^a

^a Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México. Km. 15.5 50200 Carretera Toluca–Atlacomulco, México. Tel. 72 22 96 5555, Fax 72 22 96 89 80. hanna1505@yahoo.com.mx Correspondencia al primer autor.

Recibido el 17 de diciembre de 2010.
Aceptado el 2 de julio de 2011.

Resumen

La mastitis ocasiona grandes pérdidas económicas en los hatos lecheros. El Staphylococcus aureus es uno de los principales agentes causales de la enfermedad, considerado de importancia en la salud pública y la salud del hato. El objetivo del estudio fue determinar la frecuencia de S. aureus y los biotipos predominantes en vacas con mastitis subclínica en hatos de producción lechera familiar en la región económica I, Centro–Este del Estado de México. Se condujo un estudio trasversal, en 269 vacas de diferentes etapas de lactación e información del hato en una encuesta cerrada. La muestra de leche se recolectó de cada vaca. La detección de mastitis se realizó mediante la prueba de California. Los biotipos de S. aureus se caracterizaron por medio de la técnica de agar tripticasa soya adicionado con cristal violeta 1:100,000. En las vacas estudiadas la prevalencia de mastitis subclínica fue del 48.3 % (IC₉₅% 42.22 a 54.47) y de mastitis clínica 6.1 % (IC₉₅% 3.44 a 9.48). Se obtuvieron 62 aislamientos de S. aureus, el 79 % correspondió al biotipo C (humano), el 11.3 % al A (bovino), el 6.5 % al E (canino) y el 3.2 % a hospederos no específicos. El tamaño del hato resultó un factor de riesgo asociado a la mayor frecuencia de S. aureus, especialmente cuando el hato fue mayor de 13 vacas (OR = 5.63, IC95% 1.72 a 18.21). Se identifico una prevalencia elevada de mastitis subclínica asociada a la infección por S. aureus Biotipos C y A considerados de importancia en la salud pública.

Palabras clave: Mastitis bovina, Explotaciones familiares, Staphylococcus aureus, Biotipos, Salud pública.

Abstract

Mastitis causes great economic loss in dairy farms. One of the main agents involved is Staphylococcus aureus, which is important not only in public health but in herd health as well. The aim of this study was to determine S. aureus frequency and the predominant biotypes in cows presenting subclinical mastitis from family dairy farms in the Central–Eastern zone of the State of Mexico. A transversal study was conducted considering 269 dairy cows in different lactation periods and herd information was taken through a closed questionnaire. Individual milk samples were taken and California test was used for mastitis detection. Biotypes were identified using soy tripticase agar with violet cristal added (1:100,000). Results show a subclinical mastitis prevalence of 48.3 % (CI_95% 42.22 to 54.47) and for clinical mastitis 6.1 % (CI_95% 3.44 to 9.48). 62 S. aureus isolations were obtained, from which 79 % were biotype C (Human), 11.3 % A (Bovine), 6.5 % E (Canine) and 3.2 % from non specific hosts. Herd size represented a risk factor associated to S. aureus frequency, especially when the herd was larger than 13 cows (OR=5.63, CI_95% 1.72 to 18.21). In the family dairy herds there was a high prevalence of subclinical mastitis associated to the infection produced by S. aureus Biotypes C and A, considered important in public health.

En México la producción lechera se concentra principalmente en las regiones templada y semiárida, donde se identifican sistemas de lechería especializada, familiar y de doble propósito, definidos por el nivel de tecnificación y uso de los recursos de producción⁽¹⁾.

La lechería especializada se localiza principalmente en el norte de México, con sistemas de producción que aportan el mayor volumen de la producción nacional. Son altamente tecnificadas, mecanizadas en la producción de forrajes, en el ordeño y manejo de la leche⁽²⁾.

La lechería de doble propósito localizada en las regiones tropicales se caracteriza por una producción estacional. El manejo del ganado y su alimentación se basan en el pastoreo en praderas de gramíneas nativas y pastizales inducidos, y la dieta se complementa con subproductos agrícolas. En este sistema de producción los costos de alimentación disminuyen por el pastoreo⁽³⁾.

La lechería familiar es el sistema de producción predominante en México, localizada principalmente en la región central del país, en unidades de producción a pequeña escala manejadas por la familia. La alimentación del ganado está basada en el pastoreo en pequeñas superficies agrícolas con pastos nativos, forrajes y esquilmos suministrados en el pesebre⁽⁴⁾. El sistema depende de hatos estabulados y semi–estabulados en los que predomina la raza Holstein y las cruzas con la raza criolla⁽⁵⁾. El nivel de tecnificación y uso de insumos para la producción es limitado, con un manejo tradicional del hato y generalmente el ordeño es realizado de forma manual⁽⁶⁾. La venta local de leche y los productos lácteos el aborados domésticamente generan ingresos adicionales a la familia, aunados a otras actividades agrícolas y de jornal. En el Valle de Toluca prevalece el sistema de producción lechera de tipo familiar, el cual es considerado una actividad relevante que favorece el empleo de la familia y el desarrollo regional (4).

En las vacas el nivel de infección de la glándula mamaria por S. aureus en el hato, depende de la prevalencia en la población y la dinámica de la infección asociada con los factores de virulencia propios del agente⁽⁷⁾. La caracterización fenotípica de S. aureus por medio del biotipo permite identificar el origen presuntivo de las cepas⁽⁸⁾.

En los hatos lecheros a pequeña escala, las condiciones de higiene y el manejo sanitario frecuentemente son deficientes; esta situación contribuye al desarrollo de la mastitis, enfermedad de gran importancia sanitaria y económica en la producción lechera⁽⁹⁾ . La mastitis afecta considerablemente la salud de la glándula mamaria y la calidad sanitaria de la leche, representando un riesgo potencial a la salud pública por la posible contaminación de la leche y sus productos por cepas de S. aureus de origen animal⁽¹⁰⁾.

El presente estudio se realizó para determinar la presencia de mastitis subclínica, la frecuencia de infección de S. aureus y los biotipos presentes en los hatos lecheros de producción familiar en la región centro–este del Estado de México, que comprende los municipios de Chapultepec, Mexicaltzingo, Santa María Rayón, San Antonio la Isla y Tenango de Valle, con un clima templado sub–húmedo C(w2)(w)b(I)g de la clasificación de Koeppen⁽¹¹⁾.

La población lechera de los hatos se caracterizó a partir de los datos obtenidos al aplicar una encuesta cerrada para determinar el tamaño de hato, el tipo de ordeño y la asociación de la prevalencia de mastitis clínica y subclínica, con la infección por S. aureus y sus biotipos.

El diagnóstico de mastitis se realizó mediante la prueba de California con la técnica descrita por Blowey⁽¹⁴⁾, la reacción a la prueba en la muestra de leche de los cuartos glandulares fue interpretada en una escala ordinal (0=no hay reacción, 1=reacción trazas, 2 = reacción uno, 3 = reacción dos y 4= reacción tres).

El aislamiento bacteriológico se realizó inoculando 0.010 ml de leche sobre placas de agar sangre y manitol sal agar, incubadas a 37 ºC en aerobiosis durante 24 h. Las unidades formadoras de colonias (UFC) se identificaron mediante los procedimientos bacteriológicos descritos por el National Mastitis Council⁽¹²⁾ para identificar el S. aureus; se observó el tipo de hemólisis sobre las placas de agar sangre, se realizó la tinción de Gram, las pruebas de catalasa y coagulasa en tubo efectuada con plasma humano y de bovino, Voges Proskauer y caldo nitrato⁽¹⁵⁾; la fermentación anaerobia de manitol y aerobia de la maltosa⁽¹⁶⁾. Se emplearon las cepas de S.aureus ATCC25923 y S. epidermidis ATCC 12228 como testigo del análisis bacteriológico.

La determinación de los biotipos de S. aureus se efectuó sobre placas de agar cristal violeta (agar tripticasa soya adicionado con cristal violeta 1:100,000), en consideración al sistema simplificado^(8,17), al observar la producción de estafilocinasa, tipo de hemólisis de las UFC en agar sangre preparado con eritrocitos de ovino y la coagulación del plasma de bovino en tubo, y la reacción positiva al cristal violeta de las UFC consistente en una coloración morada y un halo ligeramente amarillo sobre las placas de agar después incubar a 3 7 ºC durante 2 4 h⁽¹⁷⁾. Posteriormente se observaron las características de crecimiento y los cambios de coloración de las UFC. La identificación de los biotipos estableció un origen presuntivo de las cepas^(17,18): A de humano, coagularon el plasma humano y las UFC mostraron una coloración violeta con un ligero halo amarillento; C de bovino, coagularon plasma humano y de bovino, las UFC se observaron de color crema, la reacción al cristal violeta fue negativa; y E de canino, produjo UFC de color blanco.

Los datos obtenidos, se analizaron a partir de cuadros y gráficas de frecuencia para el análisis de prueba de hipótesis de proporciones. La frecuencia de mastitis subclínica y clínica se obtuvo al analizar los resultados de la prueba de California en asociación con la infección de S. aureus y su intervalo de confianza al 95 %. El riesgo se estimó por medio de la Razón de Momios (OR, IC 95%)⁽¹⁹⁾.

En las unidades de producción estudiadas, el 66.7 % tuvieron un sistema de ordeño mecánico y el tamaño de hato promedio fue de 11.2 vacas en línea de ordeño, con una producción media de 10.76 L/vaca al día. De las 269 vacas muestreadas, la frecuencia de mastitis subclínica fue del 48.3 % (IC95% 42.22 a 54.47) y de mastitis clínica del 6.1 % (IC95% 3.44 a 9.48). El cuadro 1 muestra la distribución de aislamientos de S. aureus por tamaño de hato. La mayor frecuencia de infección (30.7 %) (OR = 5.63, IC₉₅% 1.72 a 18.21) se obtuvo en los hatos con una población entre 13 y 18 vacas. La tasa de positividad específica de S. aureus fue 23. 04 %, predominante sobre la frecuencia decreciente de aislamiento de otros agentes; Staphylococcus coagulasa negativos, Streptococcus ssp, Escherichia coliy otros organismos coliformes.

La frecuencia de cuartos negativos al aislamiento bacteriológico fue del 47.20 %. Los biotipos de S. aureus identificados fueron diferentes en su frecuencia; el 79 % correspondieron al biotipo A, el 11.3 % al biotipo C, el 6.5 % al biotipo E y el 3.2 % se consideraron como hospederos no específicos (Cuadro 2). La distribución de los biotipos identificados en los hatos (Cuadro 3) mostró diferencias con respecto al sistema de ordeño empleado. El biotipo C se consideró predominante en las vacas evaluadas.

En el presente estudio se estimó un nivel de producción promedio en línea de ordeño de 10.76 L/vaca y un tamaño de hato no mayor a 30 vacas semejante al informado en otros trabajos⁽²⁰⁾. En los hatos evaluados se observó un predominio del sistema de ordeño mecánico realizado con pequeñas unidades portátiles. Es posible que esta situación incremente el riesgo de infección en la glándula mamaria, y el desarrollo de la mastitis por agentes patógenos de tipo contagioso y ambiental, como S. aureus y la E. coli, que pueden estar presentes en el hato al momento del ordeño. Se ha observado que en hatos pequeños existe una mayor prevalencia de mastitis subclínica, cuando los animales son ordeñados mecánicamente comparados con los que se ordeñan manualmente⁽²¹⁾. Sin embargo, se ha demostrado que la mala higiene durante el ordeño contribuye significativamente al desarrollo de infección intraglandular mamaria por S. aureus y otros agentes de importancia clínica en la mastitis⁽²²⁾.

La caracterización fenotípica de los biotipos del S. aureus permitió identificar el origen presuntivo de las cepas consideradas; de origen humano, bovino y canino, que tienden a explicar la dinámica de la infección, resaltando la importancia epidemiológica del biotipo C, el cual puede estar involucrado en la infección cruzada entre las vacas lecheras y el hombre. Es posible que la contaminación de la leche y sus derivados pueda contribuir a la diseminación del agente entre la población humana, al ingerir leche no pasteurizada y productos lácteos elaborados sin adecuadas practicas de higiene^(27,28). La contaminación de la leche puede ocurrir a través de la infección de la glándula mamaria, los utensilios y el equipo de ordeño⁽²⁹⁾.

Los biotipos de S. aureus sugieren una variación importante entre las cepas relacionadas con ecovares presentes en la zona estudiada⁽¹⁸⁾, asociados a los factores de virulencia de las cepas; esta variación puede ser evaluada mediante el gen de la coagulasa, que facilita la determinación de la variación genética entre las cepas de S. aureus en una región geográfica en la cual se observa una predominancia de ciertos genotipos, relacionados con el aumento en la virulencia de S. aureus⁽³⁰⁾.

El biotipo C de S. aureus predominante denota su importancia para la salud pública, debido a que este biotipo también se ha detectado en carne procedente de mercados de Bélgica, en donde se determinó un alto porcentaje del biotipo en las cepas de S. aureus identificadas⁽³¹⁾. En otros trabajos relacionados, se menciona que los aislamientos de S. aureus de origen animal tienden a ser menos enterotoxigénicos comparados con las cepas de origen humano⁽³²⁾. En estas últimas se observa generalmente una tendencia a producir cantidades importantes de Proteína A y alfa toxina, que incrementan notablemente el peligro para la población humana al detectar cepas de S. aureus de tipo epidémico^(33,34).

Es probable que la mayor frecuencia del biotipo C presente en la población de las vacas estudiadas, sea debido a prácticas inadecuadas en el manejo e higiene del ordeño; esta situación de acuerdo con la literatura favorece una infección cruzada hombre–vaca, al indicar que el hombre es una fuente potencial de S. aureus para la ocurrencia de infecciones intramamarias en el ganado lechero⁽³⁵⁾. En otros estudios utilizando técnicas de biología molecular en cepas aisladas de pacientes humanos y de leche de bovinos con mastitis, se indica que la fuente de las cepas de S. aureus difiere entre los reservorios identificados en humanos y bovinos, al representar dos subpoblaciones separadas raramente presentes en infecciones cruzadas⁽³⁶⁾. Sin embargo, otros autores coinciden señalando que pueden ocurrir frecuentemente infecciones entre las vacas y el hombre en los hatos lecheros^(37,38).

El riesgo epidemiológico de infección por S. aureus para el hombre, se puede incrementar si consideramos que la leche y sus derivados son una parte importante en la nutrición del humano⁽³⁹⁾; la transferencia de S. aureus entre las vacas y el hombre puede dar como resultado un problema serio de salud pública, por el desarrollo de infecciones de origen alimentario por cepas de S. aureus productoras de enterotoxinas que afecten la inocuidad y calidad de la leche, así como el creciente incremento de la resistencia a los antibióticos al S. aureus en las vacas lecheras, particularmente al observar cepas resistentes a oxacilina y meticilina (ORSA/MRSA), y multi–resistencia a los antibióticos. El S. aureus de origen bovino puede contribuir a incrementar la presión de infección humana por cepas MRSA y las resistentes a fluoroquinolonas^(40,41,42).

En los hatos de producción lechera familiar estudiados en la región centro–este del estado de México; existe una alta tasa de positividad de S. aureus biotipos C y A considerados de origen humano y de bovino, asociados con la presentación de mastitis subclínica en las vacas lecheras.

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca # 212841 otorgada a Ana María Manjarrez López para cursar los estudios de Maestría. A los productores lecheros que contribuyeron en la realización del estudio.

LITERATURA CITADA

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