Genotipificación por VNTR de aislados de Mycobacterium bovis de ganado sacrificado en Baja California, México*
VNTR for genotyping of Mycobacterium bovis isolates from cattle slaughtered in Baja California, Mexico
Carlos Martínez-Vidala, Sawako Hori-Oshimaa, Alfonso De la Mora-Vallea, Rosa María Bermúdez-Hurtadob, Tomás Benjamín Rentería-Evangelistab, Gilberto López-Valenciab, Leopoldo Javier Galván-Larac, Gerardo Enrique Medina-Basultoa
a Lab. Biología molecular, Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, Universidad Autónoma de Baja California. Carretera Mexicali-San Felipe Km. 3.5 S/N Fracc. Laguna Campestre. 21386. Mexicali, Baja California, México. Tel/Fax: (686)5.63.69.06 ext. 133. gerardom@uabc.edu.mx. Correspondencia al último autor.
]]> b Laboratorio de Tuberculosis y Brucelosis, Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, Universidad Autónoma de Baja California.c Rastro TIF 54.
Recibido el 31 de enero de 2011.
Aceptado el 13 de junio de 2011.
RESUMEN
En México, la tuberculosis bovina (TBB) es uno de los principales problemas que enfrenta la ganadería nacional. Las diferentes técnicas de genotipificación pueden ayudar a establecer la relación que existe entre las diferentes cepas presentes en una región y determinar algunos factores que incidan posteriormente en los programas de control y erradicación de la enfermedad. En el presente trabajo se aplicó la técnica de número variable de repeticiones en secuencia (VNTR) a 11 aislados provenientes de ganado sacrificado en un rastro de Mexicali BC, y a 10 aislados de ganado sacrificado en un rastro de Tijuana. Se utilizaron oligonucleótidos específicos para amplificar los loci ETR-A, ETR-B, QUB-11a, QUB-11b, QUB-1895, QUB-26, QUB-3232 y QUB-3336, determinándose el parentesco relativo entre las cepas aisladas, así como el poder discriminatorio para cada locus en particular y para todos los loci en su conjunto. Se obtuvieron 14 perfiles alélicos al utilizar los ocho loci con un poder discriminatorio de 0.90 siendo el locus QUB 3336 el que mostró el mayor poder discriminatorio (h=0.72) en tanto el locus ETR-B mostró un nulo poder discriminatorio (h=0.00). En un dendrograma, se observaron seis grupos genéticos, en los cuales se encuentran indistintamente aislados de Tijuana y Mexicali Baja California; sin embargo, se encontraron genotipos específicos para cada una de las dos regiones. Los resultados sugieren que aunque el movimiento de ganado y la compra-venta en la región han provocado la dispersión de cepas en estas dos áreas, se puede discernir el origen de la mayoría de los aislados.
Palabras clave: M. bovis, MIRU-VNTR, Genotipificación, México, Baja California.
]]> ABSTRACT
In Mexico, bovine tuberculosis (TB) is one of the main problems which face the national livestock sector. Currently, there are molecular methods for the detection and genotyping of bovine TB, making it possible to determine the relationship between the different strains present in the region and identify some factors influencing the control and eradication programs of the disease in Baja California. In this work the variable-number tandem repeat (VNTR) technique was applied to 11 isolates from cattle slaughtered in a slaughterhouse in Mexicali BC and 10 isolates from cattle slaughtered in a slaughterhouse in Tijuana BC. Specific primers were used to amplify ETR-A, ETR-B, QUB-11a, QUB-11b, QUB-1895, QUB-26, QUB-3232 and QUB-3336 loci, determining the relationship among the isolates, and discriminatory power for each locus in particular and for all loci as a whole. Fourteen allelic profiles were obtained when using eight loci with a discriminatory power of 0.90. The QUB-3336 locus showed the highest discriminatory power (h=0.72) and the ETR-B locus showed no discriminatory power (h=0.00). In a dendrogram, there were six genetic groups with isolates from Tijuana and Mexicali, but some isolates were observed only in one of these areas. The results showed that the movement of livestock and purchase market in the region has led to the dispersal of strains in these two areas; nevertheless, it is possible to differentiate some isolates exclusive of each region.
Key words: M. bovis, VNTR, Genotyping, Mexico, Baja California.
La tuberculosis bovina (TBB) es una enfermedad infecto contagiosa crónica causada por la bacteria Mycobacterium bovis, la cual se presenta también en fauna silvestre y en humanos, generando fuertes problemas, tanto económicos como de salud pública(1).
La TBB se encuentra en la lista de enfermedades con fuertes repercusiones socioeconómicas y de salud pública según la Organización Mundial de Salud Animal(2). La tuberculosis en humanos, causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis es una enfermedad con una prevalencia alta en países en vías de desarrollo, detectándose anualmente hasta 20 millones de casos nuevos en el mundo, de los cuales entre 0.5 y 5 % son debidos a M. bovis(3,4).
En México, la TBB es uno de los principales problemas que enfrenta la ganadería nacional, debido a la alta prevalencia en bovinos productores de leche (16 % en general), provocando pérdidas económicas directas e indirectas(5).
M. bovis posee un genoma de 4'345,492 pb, con 4,003 genes que codifican para 3,952 proteínas y 50 RNAs estructurales, incluye un profago y 42 secuencias de inserción (IS). Estructuralmente M. bovis además, contiene aproximadamente 65 % de G + C, lo que se refleja en el contenido de aminoácidos básicos de sus proteínas, en la mayoría enzimas necesarias para su pared celular. El genoma de M. bovis tiene más del 99.95 % de identidad con M. tuberculosis(6,7,8).
La mayoría de los cambios del genoma del complejo de M. tuberculosis se han asociado a elementos móviles como las secuencias de inserción (IS), constituidas por fragmentos pequeños de DNA capaces de auto-insertarse dentro del genoma de la micobacteria y conferir polimorfismo entre las cepas(7). La genotipificación de M. bovis tiene una gran importancia en todo el mundo, en especial cuando se tratan de determinar fuentes de infección y diseminación. De este modo, se puede deducir que cepas de M. bovis con idéntico genotipo tienen muy probablemente el mismo origen, y que cepas con genotipo diferente provienen de diferentes lugares o fuentes de infección; esto nos permite por ejemplo, determinar si un animal recientemente introducido es causante de un brote de tuberculosis (9).
En México se han genotipificado aislados de M. bovis principalmente por Spoligotyping y VNTR. En un estudio realizado en el norte de México se genotipificaron 58 aislados por spoligotyping, encontrando patrones comunes con otras partes del mundo y diferentes de otros aislados en el país (10), en tanto en otro estudio analizaron 36 aislados de Estados Unidos y 5 aislados de Aguascalientes, Tamaulipas y Chihuahua por VNTR, encontrando concordancia entre algunos aislados de Texas y México, y entre las pruebas de Spoligotyping y VNTR(6). En otro estudio se tomaron 62 aislados de distintas partes de México y se les aplicó Spoligotyping, reportando que no fue posible establecer patrones específicos por región de procedencia(11). Actualmente por la reproducibilidad, precio y rapidez del análisis por VNTR para la genotipificación del complejo M. tuberculosis, está siendo ampliamente utilizado para el estudio de brotes epidemiológicos específicos en varios países, contándose además con bases de datos que contienen los perfiles de más de 20 loci en muchos aislados alrededor del mundo, los cuales sirven para la comparación y establ ecimiento de relaciones filogenéticas y epidemiológicas con los aislados que van analizándose en nuevos estudios(12,13).
]]> Debido a que aun no existen reportes de análisis por VNTR para aislados de M. bovis provenientes de Baja California, y siendo éste un estado fronterizo de importancia bilateral por su colindancia con el estado de California, Estados Unidos, en el presente trabajo se utilizó la técnica de VNTR a diferentes aislados de M.bovis provenientes de bovinos de la región, comparándose entre ellos y con los de otros estados del País y de Estados Unidos, obteniéndose datos de genotipificación que aportan información relevante en cuanto a las diferencias genéticas de los aislados, su relación y su distribución.En este estudio se cultivaron 37 muestras de tejido con lesiones sugestivas de tuberculosis provenientes del rastro TIF No. 54 de Mexicali BC desde junio de 2009 a enero de 2010, obteniéndose 11 aislados. Además se analizaron 10 aislados identificados anteriormente con el mismo procedimiento, provenientes de del rastro 301 de Tijuana, las cuales fueron obtenidas en el año 2008 y mantenidas en el Cepario del IICV(14). El muestreo se llevó a cabo en conjunto y con la supervisión de inspectores sanitarios adscritos a las instalaciones de los rastros en mención, quienes después de la inspección tomaron un pequeño fragmento de nódulos linfáticos de pulmones y cabeza como tejido fresco para el cultivo bacteriológico(15), el cual se realizó en una campana de seguridad clase III siguiendo el protocolo descrito por Payeur et al(16).
Dos inclinados en medio Stonebrink se inocularon utilizando aplicadores de algodón estériles y se incubaron a 37 °C durante 4 a 6 semanas. Los medios inoculados se observaron periódicamente para la detección de presencia de colonias, las cuales una vez obtenidas se sometieron a identificación de microorganismos del complejo tuberculoso por vía molecular, mediante la identificación del fragmento de inserción IS6110 como fue previamente descrito(17). Se utilizaron las cepas H37RV, AN5 y BCG Tokio como testigos, las cuales se encuentran en el Cepario del laboratorio de Tuberculosis y Brucelosis del IICV. Posteriormente se les realizó un PCR para amplificar el gen que codifica para una histona (hupB) y hace posible la diferenciación entre M. bovis y M. tuberculosis(18). Todas las muestras positivas a aislamiento y PCR, declaradas como M. bovis positivas, se analizaron mediante la técnica de VNTR, utilizando loci anteriormente evaluados y referidos en el Cuadro 1. La detección de los fragmentos obtenidos para cada aislado se hizo también conforme a la técnica descrita por los autores referidos(19,20,21). Una vez obtenidos los perfiles VNTR para cada aislado, se capturaron en una matriz de Excel y se compararon filogenéticamente entre ellos y con los perfiles VNTR de 19 aislados obtenidos en otras partes de México y Estados Unidos(6,12,13), utilizándose el programa TreeView para editar el diseño de dendrogramas(22). La diversidad alélica (h) de los VNTR's individualmente y en combinación, fue calculada usando la siguiente ecuación: h=1 - Σxi2 [n/(n-1)], donde n es el número de aislados y xi es la frecuencia del alelo i de un locus(23,24).
En el Cuadro 2 se pueden observar los diferentes números de copias obtenidas al analizar las bandas correspondientes de cada locus, corroborando las repeticiones obtenidas para BCG y H37RV en una base de datos(25). Los loci que mostraron mayor polimorfismo fueron QUB-3336 y QUB-3232. Se obtuvieron 14 perfiles alélicos (muestras con diferente número de copias en al menos un locus de los analizados) al utilizar los ocho loci con una diversidad alélica (poder discriminatorio) de 0.90 y de 0.89 al utilizar solo los loci ETR-A, QUB-11a, QUB-11b, QUB-3232 y QUB-3336. De los 21 aislados, se obtuvieron en total veintitrés diferentes perfiles (número de copias de cada locus para todas las muestras) a partir de estos ocho loci. La diversidad alelica (h) obtenida para cada uno de los loci, fué de 0.00 hasta 0.72 (Cuadro 3). El locus QUB-3336 mostró el mayor poder discriminatorio (h = 0.72), en tanto el QUB-3232 mostró un poder discriminatorio moderado (h = 0.37) al igual ETR-A (h = 0.22) y QUB-11b (h = 0.21). Los loci QUB-11a (h = 0.14), QUB-26 y QUB-1895 (h = 0.05) mostraron un bajo poder discriminatorio, en tanto el locus ETR-B mostró un nulo poder discriminatorio (h=0.00).
Cuando se realizó el análisis filogenético de las 21 cepas aisladas en el estudio, utilizando los seis loci mencionados, se generó un dendrograma en el que se observan seis grupos (Figura 1), uno de los cuales corresponde a solo un aislado de Tijuana, lo cual puede deberse a una cepa poco representada y exclusiva de dicha región, o al bajo número de muestras analizadas. Los otros cinco grupos contuvieron tanto cepas provenientes de Tijuana como de Mexicali; sin embargo se observó un subgrupo de dos cepas provenientes sólo de Mexicali con cuatro aislados, lo cual sugiere que este subgrupo está principalmente circulando en Mexicali. Debido a que de los seis grupos genéticos en contrados, cinco contienen tanto aislados provenientes de Tijuana como de Mexicali, sugiere que históricamente se han compartido las cepas en las dos regiones. Lo anterior puede deberse a que el ganado, principalmente machos Holstein-Friesian provenientes de Tijuana han sido vendidos a corrales para engorda en Mexicali, y a que las vaquillas de reemplazo también han sido vendidas entre estas dos regiones. Al analizar individualmente cada uno de los perfiles alélicos, se observó que 5 (de los 14 totales) corresponden sólo a aislados de Mexicali, 6 a aislados sólo de Tijuana y 3 a aislados compartidos. Lo anterior puede deberse a que actualmente hay mas control en el movimiento de animales entre las regiones analizadas, debido a las restricciones de movimiento aplicadas por la normatividad vigente, por lo que se pueden ahora observar diferencias genéticas menores en la mayoría de los aislados dependiendo de la región de procedencia.
Al comparar los perfiles alélicos obtenidos en este estudio, con otros previamente obtenidos para muestras de otros estados del país y de Estados Unidos(6), se observó que de los seis grupos genéticos, tres correspondieron sólo a perfiles de la región, y tres fueron compartidos tanto con perfiles de otras regiones del país como de Estados Unidos. Aunque se encontraron perfiles similares, ningún perfil proveniente de Baja California fue igual a los de las otras regiones incluidas en el análisis.
En el presente estudio se observó que utilizando los loci ETR-A, QUB-11a, QUB-11b, QUB-3232 y QUB-3336 se obtiene un poder discriminatorio adecuado para diferenciar aislados provenientes de la región, y además los perfiles alélicos obtenidos y que se obtengan posteriormente, se pueden comparar con los perfiles de aislados provenientes de otras regiones en todo el mundo(12,13), ya que la técnica VNTR con estos loci es ampliamente utilizada para la genotipificación de M. bovis en muchos países con los que México tiene intereses comerciales y flujo de productos pecuarios y de personas. Los resultados también sugieren que es posible trazar e identificar el lugar de origen de un brote con esta metodología, por lo cual en un futuro podría ser una herramienta útil en casos específicos dentro de la campaña para el control y erradicación de la tuberculosis bovina en México(17,18,19,22).
Los datos presentados en el presente trabajo son la primera aproximación para conocer los genotipos de M. bovis presentes en Baja California, sin embargo faltan estudios más amplios e interdisciplinarios para obtener los datos suficientes que puedan ayudar directamente a la campaña de control y erradicación de la TBB en la región.
]]>AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo fue financiado parcialmente por la 13ava. Convocatoria interna de apoyo a proyectos de investigación UABC. El primer autor fue estudiante de maestría con beca CONACYT durante el desarrollo del estudio. Se contó con apoyo técnico del alumno de doctorado Carlomán Herrera y de la alumna de servicio social Olimpia Haro Montenegro.
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* Trabajo apoyado por la 13ava Convocatoria interna de apoyo a proyectos de investigación UABC. Carlos Martínez fue estudiante becado por CONACYT durante el periodo de esta investigación.
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