Sensibilidad y especificidad de PCR anidada y Spoligotyping como pruebas rápidas de diagnóstico de tuberculosis bovina en tejido fresco
Sensitivity and specificity of nested PCR and spoligotyping as quick diagnostic tests for bovine tuberculosis in fresh tissue
Feliciano Milián Suazoa, Beth Harrisb, Camila Arriaga Díazc, Bruce Thomsenb, Tod Stuberb, Dante González Suárezc, Genoveva Álvarez Ojedad, Marco A. Santillán Floresc, Alberto Morales Loredod, Ciro Estrada Cháveze
a CENID–Fisiología y Mejoramiento Animal, INIFAP. Km. 1 Carretera a Colón, Ajuchitlán, Qro. México. Teléfono y Fax: 419 2920036, 2920033. milian.feliciano@inifap.gob.mx. Correspondencia al primer autor.
]]> b NVSL–APHIS–USDA, United States.c CENID–Microbiología, INIFAP México.
d CE Terán, INIFAP, México.
e CIATEJ–Guadalajara, Jalisco. México.
Recibido el 12 de agosto de 2009
Aceptado para su publicación el 24 de mayo de 2010
RESUMEN
El diagnóstico rápido de tuberculosis en ganado es crítico para decidir si un hato debe someterse a cuarentena de manera definitiva o despoblarse. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la sensibilidad y la especificidad relativa de dos PCR's (MPB70 y IS6110) y spoligotyping como pruebas rápidas de diagnóstico de tuberculosis bovina en tejido fresco. Se usaron 50 muestras de tejido con lesión, provenientes de un hato con 25 % de prevalencia de la enfermedad y 50 muestras de tejido sin lesión, provenientes de un hato libre de la enfermedad. Las muestras se dividieron en dos partes y cada parte analizada en ciego por dos laboratorios diferentes con un mismo protocolo. Las tres pruebas fueron utilizadas para el diagnóstico en tejido macerado tomado inmediatamente antes del cultivo. La sensibilidad y la especificidad relativa de las pruebas diagnósticas se determinaron usando el resultado de presencia/ ausencia de lesiones, histopatología y cultivo como "pruebas de oro." La PCR MPB70 demostró de manera consistente mayor sensibilidad (85 a 91 %) y especificidad (77 a 86 %) en uno de los laboratorios con todas las pruebas de oro. Sin embargo, se observaron diferencias inter–laboratorio: en el segundo laboratorio la sensibilidad fue de 89 a 91 %, pero la especificidad fue baja (57 a 63 %). La PCR IS6110 anidada y spoligotyping tuvieron un pobre comportamiento. La sensibilidad y la especificidad relativa para la PCR MPB70 sugiere que esta prueba puede ser de utilidad como prueba complementaria para el diagnóstico rápido.
]]> Palabras clave: Tuberculosis, Mycobacterium bovis, Diagnóstico, Bovinos, Epidemiología, PCR.
ABSTRACT
Quick diagnosis of tuberculosis in cattle is critical to decide whether or not to quarantine or depopulate a herd. Currently, decisions are based on culture, which takes between four and eight weeks to accomplish. Therefore, the purpose of this study was to evaluate relative sensitivity and specificity of two PCR's (MPB70 and IS6110) and spoligotyping as quick diagnostic tests for cattle tuberculosis in fresh tissue. Fifty tissue samples with TB–suspicious lesions from a herd with 25 % prevalence of the disease and fifty tissue samples with no lesions from a TB–free herd were used in the study. Samples were split into two sets and each set was blind analyzed in two different laboratories under the same protocol. The three tests were used to diagnose tuberculosis in all samples using macerated tissue just before culturing. Relative sensitivity and specificity of all tests were estimated using presence/absence of lesion, histopathology and culture results as gold standards. MPB70 nested PCR showed consistently higher sensitivity (85 to 91 %) and specificity (77 to 86 %) in one of the laboratories with all gold standards; however, inter–laboratory differences occurred, in one of the laboratories sensitivity was from 89 to 91 % and specificity from 57 to 63 %. IS6110 nested PCR and spoligotyping behaved poorly. Relative sensitivity and specificity for MPB70 nested PCR suggest that this test could be useful as a complementary test for quick diagnosis of bovine TB in fresh tissue.
Key words: Tuberculosis, Mycobacterium bovis, Diagnostic tests, Cattle, Epidemiology, PCR.
Mycobacterium bovis, el agente causante de la tuberculosis bovina (BTB), también infecta a una amplia gama de especies mamíferas, incluyendo al hombre(1)). En países en desarrollo la BTB es una zoonosis importante, especialmente entre poblaciones de alto riesgo como son trabajadores de establos y de rastro, veterinarios y personas que consumen leche bronca o queso fresco elaborado con leche bronca proveniente de hatos infectados(2). Actualmente la BTB es también importante por las pérdidas económicas que ocasiona a la industria ganadera, así como por los costos de los programas de control y erradicación(3) y la limitante que representa para el libre comercio de animales y sus productos(4).
Los programas de control y erradicación de la BTB se basan en la tuberculinización y la eliminación de los animales reactores; sin embargo, el comportamiento epidemiológico de la prueba ha sido una preocupación constante por sus parámetros irregulares de sensibilidad (40 a 90 %) y especificidad (78 a 96 %)(5,6), lo que predispone a la presencia de resultados falsos positivos y falsos negativos. Con frecuencia los animales que reaccionan a la tuberculina no presentan lesiones en rastro, lo que reduce la confianza de los productores en los programas oficiales de control; el desecho de animales falsos negativos es un costo extra para el productor.
La inspección post–mortem en rastro se realiza para confirmar el diagnóstico de la tuberculina por la presencia de lesiones compatibles con TB, especialmente en nódulos linfáticos asociados al tracto respiratorio. La inspección de canales como medio de diagnóstico es práctico cuando se combina con histopatología para identificar lesiones microscópicas de tuberculosis o para identificar bacilos acido–alcohol resistentes(7,8). Sin embargo, en algunos países, para llegar al diagnóstico definitivo se envían al laboratorio lesiones de tejido sospechoso para el cultivo, el cual toma entre 4 y 8 semanas. Este proceso es poco práctico, caro y tardado; los veterinarios oficiales o el productor tienen que esperar mucho tiempo por los resultados para dictaminar sobre una cuarentena. Afortunadamente, las nuevas técnicas de amplificación de ADN han incrementado de manera importante las alternativas de diagnóstico.
Las técnicas de diagnóstico basadas en la amplificación de ADN de M. bovis a por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido ampliamente descritas(9). La PCR(10) puede amplificar cantidades extremadamente pequeñas de ADN, aun cuando las cantidades estén en el rango de picogramos(11) y hacerlas detectables por medios convencionales. Una PCR que tiene como blanco el gen que codifica la proteína MPB70, considerada específica para M. bovis(12), ha demostrado buena sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de tuberculosis en humanos y ganado(13). Una sola copia de este gen está presente en cepas de M. bovis y otras micobacterias del complejo M. tuberculosis, pero ausente en otras 24 especies y otros géneros bacterianos. Así mismo, una PCRMPB70 anidada demostró alta sensibilidad y especificidad cuando se usó la presencia/ausencia de lesiones sospechosas de TB como "prueba de oro" en 21 animales provenientes de una zona endémica y 20 animales de una zona libre de BTB. Esta prueba también demostró ser muy sensible, detectando cantidades de hasta 10 fg de ADN(14).
]]> La amplificación de secuencias de inserción, tales como IS6110, que se conoce están presentes en diferente número de copias en bacterias del complejo M. tuberculosis, también han sido usadas en el diagnóstico de la tuberculosis en humanos y ganado, y se usa en la actualidad para confirmar infección en tejidos fijados en parafina(15). Sin embargo, esta técnica genera resultados falsos negativos si los tejidos permanecen en formol por periodos prolongados de tiempo.Otra técnica basada en PCR es la de spoligtyping. Este es un método que detecta la presencia de espaciadores de secuencias repetidas (DR, por sus siglas en inglés) en un locus del genoma de M. bovis. Se encontró que esta región cromosomal contiene un número grande de DRs de 36 pb separadas por espaciadores de ADN variable (DVRs, por sus siglas en inglés) de 35 a 41 pb de longitud. Cuando se compararon las DRs de varios aislados, se observó que el orden de los espaciadores era similar, pero que ocurrían algunas delecciones o inserciones. De este modo, el polimorfismo viene de la ausencia/presencia de uno o más de estos espaciadores variables. Así, spoligotyping detecta la presencia o la ausencia de estos espaciadores de secuencia conocida, característica que es utilizada para determinar similitud genética entre cepas(16). Aunque esta técnica es básicamente utilizada para la tipificación de cepas extraídas de cultivo, también ha demostrado su utilidad para simultáneamente detectar y tipificar cepas del complejo M. tuberculosis directamente de muestras clínicas(17,18). Dado que el procedimiento involucra la amplificación de la región DR por PCR, seguido de la hibridación con oligonucleótidos específicos para cada espaciador, supuestamente esta técnica muestra mayor sensibilidad y especificidad que otros métodos basados en PCR. Así, el objetivo del presente estudio fue evaluar la sensibilidad y la especificidad de una PCR anidada, utilizando como blanco el gen MPB70 y la secuencia IS6110, así como también spoligotyping como métodos de diagnóstico rápido de la tuberculosis bovina en tejido fresco.
Para el estudio se utilizaron 50 muestras de tejido con lesiones macroscópicas sospechosas de tuberculosis proveniente de una zona endémica con 25 % de prevalencia y 50 muestras de tejido sin lesión proveniente de una zona libre de tuberculosis, colectadas por la inspección de canales en rastro. Cada muestra fue dividida en dos partes y cada parte fue congelada y enviada de manera codificada y en ciego para su análisis a uno de dos laboratorios: México (Lab 1) y Estados Unidos de Norteamérica (Lab 2), donde ambos usaron el mismo protocolo de trabajo.
A cada una de las muestras se les realizó histopatología y cultivo para confirmar el diagnóstico por la presencia de lesiones sugestivas de BTB y la presencia del bacilo, respectivamente. El cultivo se realizó siguiendo el método descrito por Payeur et al(19). En el caso de México, la histopatología y el cultivo fueron realizados en el laboratorio de Microbiología del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología (CENID–Micro) del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y pecuarias (INIFAP) en Palo Alto, D.F. La sensibilidad y la especificidad relativa para las tres pruebas fue estimada utilizando la presencia/ausencia de lesiones y los resultados de histopatología y cultivo como "pruebas de oro." Todas las muestras se manejaron en las mismas condiciones en todo momento.
El ADN para las pruebas de PCR se obtuvo a partir del tejido siguiendo el método del amonio acetil–trimetil (CTAB, por sus siglas en inglés)(20). De manera resumida, 0.5 ml de cada homogenado de muestra de tejido fue transferido a un tubo de microcentrífuga (1.9 ml) y centrifugado a 10,000 rpm por 10 min, de donde posteriormente se decantó el sobrenadante. Después de la centrifugación, el pellet fue homogenizado con 400 μl de TE (100 mM tris–HCL, pH 8.0, 10 mM EDTA) y 50 μl de lisosima (100 mg/ml, Sigma No. de Cat. L6876) para romper la pared celular e incubado a 37 °C por 1 h. Posteriormente se añadieron 70 μl de SDS al 10%, seguido por 6 μl de una solución de proteinasa K (10 mg/ml Sigma No. de Cat. P4850) para inactivar las proteínas e incubado a 65 °C por 10 min. Después de la incubación, a cada muestra se le agregaron 10 μl de 5 M NaCl, seguido por 80 μl de una solución de 5M NaCl con 5% N–cetyl–N, N, N, –bromuro de trimetil amonio, así, la mezcla se incubó a 65 °C por 10 min.
La extracción de ADN se hizo utilizando un volumen de fenol/cloroformo/isoamil (24:1) y la precipitación posterior con 0.6 volúmenes de isopropanol absoluto, lavado con 1 ml de 70% de etanol. Posteriormente fue resuspendido en 200 ¡ü de agua (MILI–Q) y cuantificado con el uso de diluciones de 1:50 con un espectrofotómetro GeneQuant II. Las lecturas se hicieron a 260 y 280 nm para estimar la concentración y la pureza. El ADN genómico, purificado y homogenizado a 100 ng/μl se observó por electroforesis en un gel de agar a 0.7% teñido con bromuro de etidio y corrido a 120 volts durante 50 min. Los geles fueron observados en un transiluminador de luz ultravioleta y fotografiados con una cámara instantánea.
Las reacciones de PCR fueron realizadas en un volumen final de 20 μl. La mezcla de PCR tuvo una concentración final de 10 mM de tris–HCL (pH 8.3); 50 μM de KCl; 250 ¡M de cada dNTP; 0.4 μM de cada oligonucleótido; 0.5 U de Taq polimerasa, 1% de trito X–100; 0.15 mg/ml de albúmina bovina sérica (el Lab 2 no usó este aditivo) y 500 ng de ADN. Los programas de PCR se corrieron en un termociclador GeneAmp PCR system 2400 (el Lab 2 usó el sistema 9700) y los productos se analizaron en gel de agarosa al 3%.
Para eliminar los inhibidores en la reacción de PCR y para mostrar la viabilidad del ADN, se incluyó un control con oligonucleótidos específicos para la amplificación de un fragmento de 375 pb del gen CyB, el cual codifica el citocromo b del ADN mitocondrial. Los iniciadores y el protocolo de amplificación fueron: CYBI 5' CCA TCC (TCA) AAC ATC (ATT) TCA GCA (TCA) TGA TGA AA 3' y CYB2 5' GCC CCT CAG AAT GAT ATT TGT CCT CA 3'; 24 ciclos (30 ciclos) a 94 °C por 30 seg, 60 °C (58 °C) por 30 seg y 72 °C por 30 seg. Las diferencias entre laboratorios en la secuencia de los iniciadores y el número de ciclos se indican en paréntesis.
Una vez que las muestras de ADN fueron optimizadas con la amplificación de ADN, se corrió una PCR simple para hacer el diagnóstico de TB por medio de la amplificación de un segmento de 372 pb del gen MPB70 de las micobacterias del complejo M. tuberculosis (TB1F 5' GAA CAA TCC GGA GTT GAC AA 3' and TB1R 5' TAC ATG ATT GAC AGC GTG CT 3'); El protocolo de amplificación fue: 24 ciclos a 94 °C por 45 min, 60 °C (58 °C) por 30 seg y 72 °C por 1 min(21). Posteriormente se usó un décimo del producto para amplificar un fragmento de 208 pb dentro de la región del fragmento de 372 pb del gen MPB70 por medio de un PCR anidado con los oligonucleótidos diseñados para este estudio (M22/ 3 5' GCT GAC GGC TGC ACT GTC GGGC 3' y M22/4 5' CGT TGG CCG GGC TGG TTT GGC C 3'); 35 ciclos de 94 °C por 30 seg y 1 min a 72 °C, usando la misma temperatura para la hibridación y la extensión(14).
El PCR para la secuencia IS6110 se realizó de acuerdo al procedimiento original desarrollado para M. bovis(15). El ADN se extrajo del macerado de tejido por el método de CTAB. De manera alternativa, se preparó un extracto crudo de tejido a partir de dos secciones de parafina (5 mm cada uno) que fue puesto en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml y peleteado por centrifugación a 1,600 rpm por 2 min, seguido de la adición de 200 µl de agua con 0.5% de Tween 20. Este tubo se puso entonces a dos ciclos de 10 min de ebullición seguido por congelación rápida (nitrógeno líquido). Después de un tercer ciclo de ebullición, la muestra se centrifugó a 7,000 rpm por 20 min y 70 μl del sobrenadante fue utilizado para la PCR.
]]> Posteriormente se realizó una amplificación usando los iniciadores externos que amplifican un fragmento de 583 pb de la secuencia de inserción IS6110, según lo reportado por Wilson(22), seguida de una segunda amplificación de un fragmento de 200 pb. Las amplificaciones fueron realizadas con un método de "inicio–caliente". La mezcla de la reacción (volumen final de 25 μl) contenía 25 pmoles de iniciadores, 2.5 U ADN polimerasa (Promega Inc.), 1.0 mM MgCl2 y 0.2 mM de nucleótidos (mezcla de nucleótidos para PCR, Bioline, Inc.). El control positivo de ADN se obtuvo de extractos de cultivo bacteriano de las cepas de referencia AN5 y BCG. En cada PCR se incluyó un control negativo (sólo reactivo) y al menos un control de tejido negativo (linfonodo de bovino) por cada 20 muestras (el Lab 1 no usó estos controles). El protocolo de amplificación para los iniciadores externos fue: un ciclo de 2 min a 93 °C, 35 ciclos a 93 °C por 45 seg, 65 °C por 1 min, 72 °C por 45 seg y 10 min finales de extensión a 72 °C. Cinco μl del producto de esta PCR se utilizaron para la segunda reacción. El protocolo de amplificación de los iniciadores internos fue: un ciclo a 93 °C, 35 ciclos a 93 °C por 45 seg, 45 seg a 48 °C (el Lab 2 usó 50 °C) y 45 seg a 72 °C, con un periodo de extensión final de 10 min a 72 °C. El producto de amplificación fue teñido con bromuro de etidio y analizado por electroforesis en gel de agarosa.Spoligotyping se realizó tal como lo describe Kamerbeek et al(17). De manera resumida, la amplificación del ADN se corrió en una mezcla de PCR de 50 μl, la cual contenía: 5 μl of 10X buffer de reacción (100 mM Tris–HCL, pH 8.3, 500 mM KCl), 4 μl de una mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 2.5 μl de 25 mM MgCl2, 20 pmol de cada iniciador (DRa 5' –GGT TTT GGG TCT GAC GAC– 3' marcado con biotina en la terminal 5', y DRb 5' –CCG AGA GGG GAC GGA AAC –3'), 0.625 U de Amplitaq polymerase (Perkin–Elmer) y 5 μl de ADN blanco. Las amplificaciones se obtuvieron en un termociclador usando: 1 ciclo a 96 °C por 3 min, 30 ciclos a 96 °C por 1 min, seguido por 55 °C por 1 min y 72 °C por 30 seg. La hibridización se realizó de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Isogen). El ADN hibridado se detectó con alguno de los siguientes métodos, liquido quimiluminicente de detección ECL (Amersham International), o liquido de detección CDP–Star (Roche Applied Sciences; Indianapolis, IN) seguido por exposición a rayos X (Eastman Kodak) por 12 min, o por captura electrónica, digitalizado y estandarizado en un sistema foto documentador (ChemiDoc EQ gel documentation system: Bio–Rad; Hercules, CA). Se incluyó en el análisis molecular M. tuberculosis H37Rv y M. bovis BCG y AN5 como controles de espoligotipo conocido.
Para estimar la sensibilidad y la especificidad relativa de las pruebas, se utilizó la presencia/ ausencia de lesiones macroscópicas en tejido, el resultado del cultivo y de histopatología como "pruebas de oro". Se utilizó también la prueba de kappa para evaluar el nivel de concordancia entre las pruebas. Todos los análisis estadísticos se realizaron en SPSS versión 16.
Los resultados muestran que la proporción de muestras positivas a histopatología de aquéllas con lesión macroscópica fue de 91 y 93 %, para los laboratorios 1 y 2, respectivamente, mientras que la proporción de muestras negativas del grupo de tejido sin lesión fue de 98 % para ambos laboratorios (Cuadro 1). De manera sorpresiva una de las muestras del grupo de "libre de lesiones" resultó positiva al cultivo.
La sensibilidad y la especificidad relativas de las tres pruebas diagnósticas en estudio se estimaron usando la presencia/ausencia de lesiones en tejido y los resultados del cultivo y el análisis histopatológico como "pruebas de oro". Cuando se usó la presencia/ ausencia de lesiones, la sensibilidad de la PCR MPB70 anidada fue de 85 vs 91 % para los laboratorios uno y dos, respectivamente. Sin embargo, la especificidad fue diferente: 86 vs 63 %, con valores de kappa también diferentes: 72 vs 54 % para los laboratorios 1 y 2, respectivamente. En el caso de la PCR IS6110, los resultados fueron muy pobres para los dos laboratorios: 35 y 70 % para sensibilidad y 9 y 97 % para especificidad, con valores extremadamente bajos de kappa (29 y 50 (%), para los laboratorios 1 y 2, respectivamente). Finalmente, cuando se usó spoligotyping, los resultados también fueron pobres: la sensibilidad fue de 47 a 51 % y la especificidad de 89 a 80 %, con valores de kappa de 36 y 31 % (Cuadro 1). No obstante, el valor predictivo positivo fue bueno para todas las pruebas (73 a 86 %).
Cuando se utilizó el resultado del cultivo del Mycobacterium y el resultado de la histopatología como "pruebas de oro," los resultados fueron muy similares a los observados cuando se utilizó la presencia/ausencia de lesión: la sensibilidad para PCRMPB70 fue de 86 y 90 %, para laboratorio uno y dos, respectivamente. Cuando se usó histopatología, la sensibilidad fue de 87 y 89 %, respectivamente. En el caso de la especificidad, esta fue de 77 % para el Lab 1 y de 60 % para el Lab 2. Los valores de sensibilidad y especificidad fueron muy bajos para las PCRs que utilizaron la secuencia IS6110 y spoligotyping (Cuadro 1).
El comportamiento de los métodos tradicionales de diagnóstico se muestra en el Cuadro 2. La presencia de lesión, histopatología y el cultivo mostraron excelente concordancia (kappa = 82 a 100 %).
Se conoce que la sensibilidad y la especificidad reales de las pruebas de tamizado para el diagnóstico de tuberculosis en el ganado, sólo pueden ser estimadas en poblaciones donde todas las situaciones epidemiológicas son posibles: infectados, expuestos y no infectados. Más que eso, cuando la prueba en evaluación es in vivo, los animales deben ser sacrificados para tener un diagnóstico definitivo: presencia de lesiones por inspección de la canal, presencia de lesiones compatibles con tuberculosis por histopatología y el aislamiento del Mycobacterium por cultivo. Sin embargo, cuando la prueba en evaluación es una prueba post–mortem, el uso de muestras de "segunda mano" es una buena alternativa, en especial si la prevalencia de la enfermedad en la población es conocida. En nuestro estudio se conocía de antemano que las muestras con presencia de lesiones macroscópicas venían de ganado productor de leche en hatos con una prevalencia de TB del 25 %, mientras que las muestras libres de lesiones venían de ganado de carne en un área libre de tuberculosis.
En este estudio se ha demostrado que la prueba PCRMPB70 anidada en tejido fresco tiene una razonablemente buena sensibilidad y especificidad; por lo tanto, tiene el potencial para ser usada como una prueba complementaria rápida para el diagnóstico de la tuberculosis bovina. La rapidez en el diagnóstico es crítica en al menos dos situaciones: cuando el productor está esperando los resultados para mover canales retenidas en rastro o cuando, ambos, el productor y el Veterinario oficial necesitan decidir sobre la aplicación de una cuarentena definitiva o la liberación de una cuarentena precautoria, o bien para aplicar pruebas adicionales al hato sospechoso; casos todos, en que la PCRMPB70 es una buena alternativa.
La sensibilidad y la especificidad encontradas con el antígeno MPB70 en este estudio son menores a las reportadas por Cousins et al(13); sin embargo, es ese estudio los autores sabían de antemano el estatus real de las muestras con base en los métodos tradicionales de diagnóstico. Por lo tanto, la PCRMPB70 anidada es una prueba adicional de diagnóstico que puede ser utilizada en paralelo o en serie, con histopatología, por ejemplo, para incrementar la precisión en el diagnóstico de la TB en un periodo corto de tiempo.
]]> La sensibilidad y la especificidad de la prueba de PCR que utiliza la secuencia IS6110 como blanco fueron bajas. Esto pudo ser debido al tamaño del fragmento de la PCR inicial amplificado por la PCR anidada. Para MPB70, el producto de la PCR fue de 372 pb, mientras que para la IS6110 fue de 583 pb. Aunque ambos productos son muy grandes para diagnóstico por PCR, el producto de la IS6110 es mayor por aproximadamente 200 pb; para la PCR anidada, la amplificación inicial de los productos generalmente ocurren previo a la expansión exponencial. De este modo, si hay un efecto grande de dilución debido a la gran cantidad de ADN del animal en el ambiente, es posible que los ciclos iniciales de la reacción de la PCR sean muy ineficientes, llevando a resultados falsos negativos. En este caso, es necesario realizar trabajo de laboratorio adicional para incrementar la eficacia del método.Se ha mencionado que spoligotyping tiene el potencial, tanto de hacer el diagnóstico como la tipificación de M. bovis en tejido fresco al mismo tiempo. En este estudio, mostró baja sensibilidad y los patrones moleculares no fueron siempre los mismos cuando se usó tejido fresco o cultivo como fuente de ADN para la PCR; parece ser que en tejido fresco el ADN del huésped interfiere con la reacción. Esto puede también deberse a las varias reacciones de PCR requeridas para amplificar el ADN en forma eficiente. Los resultados falsos positivos y falsos negativos, particularmente en especímenes con bajo número de bacilos, reduce la confiabilidad en esta prueba. La variabilidad en los resultados ha sido atribuida a los métodos de descontaminación, el procedimiento de extracción de ADN, los métodos de eliminación de inhibidores de la polimerasa, los controles internos y externos y los procedimientos de prevención de contaminación cruzada. De hecho, algunos de los espoligotipos no mostraron patrón de M. bovis, indicando que se presentó un alto nivel de reacciones no específicas. Más que eso, los resultados del spoligotyping obtenidos directamente de tejido fresco no necesariamente fueron similares a aquellos obtenidos de ADN a partir de cultivo (datos no mostrados), indicando la presencia de ADN del huésped, lo que hace a esta técnica poco apropiada en tejido fresco. Esto indica que es necesario hacer mejoras en los procedimientos para incrementar la confiabilidad de la PCR–IS6110 y de spoligotyping como pruebas prácticas para la detección de bacilos del complejo M. tuberculosis.
Algunos métodos de PCR han sido previamente mencionados como útiles en la identificación de M. bovis para el diagnóstico de TB en animales y humanos (23); sin embargo, esos métodos requieren el cultivo de tejido, el cual toma entre 4 y 8 semanas. Nuestros resultados de concordancia para la PCRmpb70 e histopatología son similares a aqullos previamente reportados(14) con valores de kappa de 0.44 a 0.71. Sin embargo, en nuestro estudio, la concordancia entre la PCRMPB70 y el aislado de cultivo fue un poco mejor; con valores de kappa de 0.48 a 0.72 vs 52. Considerando la presencia/ausencia de lesiones como método de confirmación del diagnóstico, nuestras PCR anidadas mostraron sensibilidades menores (85 a 91 % vs 100 %) pero mejores especificidades (63 a 86 % vs 77 %).
La conclusión de este estudio es que la prueba PCRMPB70 anidada tiene el potencial para ser usada como prueba complementaria para el diagnóstico rápido de tuberculosis en el ganado usando macerado de tejido fresco. Esta prueba, en combinación con histopatología puede ser usada en serie o en paralelo para mejorar la precisión del diagnóstico en un periodo de tiempo corto. La prueba anidada de PCR–IS6110 y spoligotping no proporcionaron una buena alternativa de diagnóstico rápido en este estudio; sin embargo, mejoras en el ADN de la muestra y condiciones más estrictas de amplificación podrían incrementar ambas, la sensibilidad y la especificidad.
LITERATURA CITADA
1. Moda G, Daborn CJ, Grange JM, Cosivi O. The zoonotic importance of Mycobacterium bovis. Tubercle and Lung Diasease 1996;(77):103–108. [ Links ]
2. Daborn CJ, Grange JM. HIV/AIDS and its implications for the control of animal's tuberculosis. British Vet J 1993;(149):05–417. [ Links ]
]]>3. Krebs JR, Andersen R, Clutton–Brock T, Morrison I, Young D, Donelly C. Bovine tuberculosis in cattle and badgers. London: MAFF publications; 1997. [ Links ]
4. Milian SF, Harris B, Arriaga DC, Romero TC, Stuber T, Alvarez OG, et al. Molecular epidemiology of Mycobacterium bovis: Usefulness in international trade. Prev Vet Med 2008;(87):261–271. [ Links ]
5. Francis J, Seiler RJ, Wilkie IW, O'Boyle D, Lumsden MJ, Frost AJ. The sensitivity and specificity of various tuberculin tests using bovine PPD and other tuberculins. Vet Rec 1978;(103):420–425. [ Links ]
6. Costello E, Egan JW, Quigley FC, O'Reilly PF. Performance of the single intradermal comparative tuberculin test in identify ing cattle with tuberculous lesions in Irish herds. Vet Rec 1997;(141):222–224. [ Links ]
7. Whipple DL, Bolin CA, Miller JM. Distribution of lesions in cattle infected with Mycobacterium bovis. J Vet Diagn Invest 1996;(8):351–354. [ Links ]
]]>8. Corner LA. Postmortem diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle. Vet Microbiol 1994;(40):53–63. [ Links ]
9. Noredhoek GT, van Embden JDA, Kolk AHJ. Reliability of nucleic acid amplification for detection of Mycobacterium tuberculosis: an international collaborative quality control study among 30 laboratories. J Clin Microbiol 1996;(34):2522–2525. [ Links ]
10. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase–catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987;(155):335–351. [ Links ]
11. Oste C. Polymerase chain reaction. BioTechniques 1988;(6):162–167. [ Links ]
12. Wood PR, Ripper J, Radford AJ, Bundesen PG, Rylatt DB, Cottis LE, John M, Plackett P. Production and characterization of monoclonal antibodies to Mycobacterium bovis. J Gen Microbiol 1988;(134):2599–2604. [ Links ]
]]>13. Cousins DV, Wilton SD, Francis BR, Gow BL. Use of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol 1992;(30):255–258. [ Links ]
14. Estrada–Chávez C, Díaz OC, Arriaga DC, Villegas–Sepúlveda N, Pérez GR, González SD. Concordancia de la PCR y métodos rutinarios para el diagnóstico de tuberculosis bovina. Vet Méx 2004;(35):225–236. [ Links ]
15. Miller J, Jenny A, Rhyan J, Saari D, Suarez D. Detection of Mycobacterium bovis in formalin–fixed, paraffin–embedded tissues of cattle and elk by PCR amplification of an IS6110 sequence specific for Mycobacterium tuberculosis complex organisms. J Vet Diagn Invest 1997;(9):244–249. [ Links ]
16. Aranaz A, Liebana E, Mateos A. Spoligotyping of Mycobacterium bovis strains from cattle and other animals: a tool for epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol 1996;(34):2734–2740. [ Links ]
17. Kamerbeek J, Schouls L, Folk A, van Agterveld M, van Soolingen D, Kuijper S, Bunschoten A, Molhuizen H, Shaw R, Goyal M, van Embden J. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 1997;(35):907–914. [ Links ]
]]>18. Roring S, Hughes MS, Skuce RA, Neill SD. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium bovis directly from bovine tissue specimens by spoligotyping. Vet Microbiol 2000;(74):227–236. [ Links ]
19. Payeur J, Jarganin J, Marquart J, Schaper IY, Martin B. Laboratory methods in veterinary mycobacteriology for the isolation an identification of mycobacteria. National Services Laboratories Iowa, USA: United States Department of Agriculture. 1993:1–48. [ Links ]
20. Wards BJ, Collins DM, de Lisle GW. Detection of Mycobacterium bovis in tissues by polymerase chain reaction. Vet Microbiol 1995;(43):227–240. [ Links ]
21. Cousins DV, Wilton SD, Francis BR. Use of ADN amplification for the rapid identification of Mycobacterium bovis. Vet Microbiol 1991; (27): 187–195. [ Links ]
22. Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria. In: Ausebel R, Brent RE, Kingston DD, Mooere JG, Seidman JG, Smith JA editors. Current protocols in molecular biology. New York, USA: Greene Publishing and Wiley–Interscience; 1998. [ Links ]
]]>23. Cobos–Marín L, Montes–Vargas J, Rivera–Gutiérrez S, Licea–Navarro JA, Gonzalez–y–Merchand JA, Estrada–García I. A novel multiplex–PCR for the rapid identification of Mycobacterium bovis in clinical isolates of both veterinary and human origin. Epidemiol Infect 2003;(130):485–490. [ Links ]
]]>